Name: El estudio de las interacciones de Staphylococcus aureus Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda a estudiar la activación de neutrófilos humanos por PSMs de Staphylococcus aureus mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Este método permite analizar respuestas inmunitarias in vitro.

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<p class="jove_content"&gt; RN fue parcialmente financiado por una Marie Curie Becas Re-integración europeas (ERG) del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea, el número de proyecto 268324.</p&gt;

1. Aislamiento de PMN de sangre humana mediante centrifugación de densidad <ol><li> Dibuja 5 9 tubos ml de sangre venosa heparinizada. </li><li> Preparar de doble capa de gradientes de Ficoll (4 gradientes para 5 tubos de sangre) de la siguiente manera: Verter 12 ml de una densidad de 1,119 g / ml de solución de Ficoll en un tubo de 50 ml y cuidadosamente capa de 10 ml de una densidad de 1,077 g / ml de solución de Ficoll en la parte superior. </li><li> Diluir la sangre con un volumen igual de PBS. </li><li> Capa de la sangre diluida con cuidado en el gradiente de Ficoll de doble capa; 20-25 ml por gradiente. </li><li> Centrifugar 20 minutos a 396 xg en un rotor de cubeta oscilante, 22 ° C sin frenado. </li><li> Preparar RPMI frío que contiene 0,05% albúmina de suero humano (RPMI-HSA). También hay que preparar 9 ml estéril desionizada H 2 O. Pre-cool tanto el RPMI y H 2 O en el hielo. </li><li> Aspirar la capa de Ficoll superior que contiene el plasma (de color amarillo) y PBMC, y la segunda capa de Ficoll (color blanco) con el uso de una bomba de vacío (poner una punta de pipeta estéril enla pipeta). </li><li> Recoge los PMNs en tubos de 50 ml con una pequeña pipeta de plástico (1 tubo para las fracciones PMN de cada 2 gradientes), y colocarlos en hielo. </li><li> Añadir frío RPMI-HSA para un volumen total de 50 ml y centrifugar durante 10 min a 249 xga 4 ° C. </li><li> Retirar el sobrenadante con el uso de una bomba de vacío y agitar suavemente el sedimento (eritrocitos y PMN). </li><li> Añadir 9 ml estéril desionizada H 2 O e iniciar el temporizador. Detener el choque osmótico hiper después de 30 segundos exactamente, mediante la adición de 1 ml de PBS concentrada 10 veces. Nota: El 30 sec son muy críticos. </li><li> Añadir frío RPMI-HSA para un volumen total de 50 ml y centrifugar durante 10 min a 249 xga 4 ° C. </li><li> Retirar el sobrenadante con el uso de una bomba de vacío y se recoge el precipitado en 1 PMN tubo con un volumen definido (1-2 ml) de RPMI-HSA. </li><li> Determinar la cantidad de células y ajustar la concentración a 1,10 7 células / ml. Dependiendo del donante, el rendimiento de PMNs aislados serán los que betwees 5 x 10 6 y 3 x 10 7 PMNs de cada tubo de 9 ml de sangre </li></ol> 2. Ensayo de citometría de flujo para la evaluación de la movilización de calcio en los PMN humanos <ol><li> Las celdas de carga (5 x 10 6 células / ml) con 2 mM Fluo-3 AM en RPMI-HSA y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente balanceo lentamente, utilizando por ejemplo, un agitador de plataforma oscilante, protegido de la luz. </li><li> Mientras tanto preparar una dilución en serie (por ejemplo, 3 veces) del estímulo a 10x la concentración final. PSMα3 se utiliza en este protocolo, sin embargo cualquier estímulo GPCR que actúa sobre los neutrófilos es adecuado. </li><li> Preparar inhibidor de concentrado 10x del receptor en RPMI-HSA. Cuando el inhibidor actúa sobre el estímulo (por ejemplo HDL en PSMα3) pre-incubar 25 l estímulo con un volumen igual de inhibidor durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células mediante la adición de 10 ml de medio RPMI-HSA y centrifugar durante 249 x g a temperatura ambiente. Resuspender las células a 5 x10 6 células / ml. </li><li> Justo antes del experimento, diluir las células a 2x10 6 células / ml en medio RPMI-HSA y añadir 200 células l por tubo de FACS. PMNs diluidas son muy frágiles. Mantenerlos demasiado tiempo a esta concentración dará lugar a la activación automática, y lo mismo ocurre con agitación vigorosa o pipeta. </li><li> Conecte el tubo a la citometría de flujo, espere 3 segundos y comenzar la adquisición. Después de un período de tiempo fijo (por ejemplo, 8 segundos), quitar el tubo y añadir rápidamente 50 l de estímulo a la muestra. Inmediatamente vuelva a colocar el tubo en el soporte de la muestra y continuar con la adquisición. </li><li> Comience con el extremo más bajo y con la mayor concentración de estímulo. Lave la aguja citómetro de flujo regular después de cada carrera con RPMI-HSA. </li><li> Analizar los datos con el software de análisis de citometría de flujo. Comparar la señal de fluorescencia promedio antes de la adición del estímulo para que después de la adición del estímulo y el uso de los controles positivos y negativos apropiados para calcular la corriente alternafuerza tivación para cada dilución medido. </li></ol> Alternativamente, cuando el inhibidor actúa sobre los receptores de pre-incubar las células con el inhibidor. 3. Análisis de microscopía de fluorescencia de las bacterias Expresión de GFP después de la fagocitosis por los PMN <ol><li> Crecer S. Aureus cepas que contienen un constructo indicador de interés durante la noche en caldo (con antibióticos cuando sea necesario para mantener el plásmido reportero). En este caso cepa MW2 contiene un PSMα constructo indicador de GFP se utiliza 10, crecido en un tubo de plástico de 50 ml con 5 ml de medio de cultivo LB. </li><li> Para eliminar todas las buenas prácticas agrarias de la expresión O / N, diluir las culturas para OD 660 0.01 y crecer a OD 660 de 0,1. Redilute la 01:30 la cultura y controlar el crecimiento hasta que el cultivo alcanza un 660 OD de 0,1. Recoge las bacterias por centrifugación y se lava una vez en DPBS. Resuspender en 1:10 del volumen original para obtener un OD 660 de 1,0 o roughly 5,10 8 UFC / ml. </li><li> Mezclar las bacterias (1.10 7 / ml) con PMN recién aislados (1.10 6 / ml) en medio RPMI-HSA (relación 10:01) en un microtubo de 1,5 ml y añadir suero humano agrupado a una concentración final de 10%. Agitar en una plataforma de agitación durante 10 min a 37 ° C para estimular la fagocitosis. Diluir los PMNs cargados de bacterias a 5.10 5 PMN / ml y pipeta de 250 l en un pozo de un 8 bien calibrada cubreobjetos. </li><li> Imagen de los PMN con bacterias en el microscopio. Un microscopio invertido equipado con un objetivo NA 40X/0.85 funciona bien y debe ser encerrado en una cámara de ambiente oscuro para mantener el medio ambiente de manera estable a 37 ° C. Adquirir imágenes para un número de posiciones predeterminadas utilizando la cámara cada 5-10 minutos, tanto en el campo brillante y el canal de GFP para seguir la producción de GFP en el tiempo. </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En los métodos descritos aquí algunos pasos son muy críticos. Vamos a destacar estas aquí. Para el aislamiento de neutrófilos por centrifugación en gradiente de densidad es importante no perturbar las capas durante o después de las etapas de centrifugación. Al aspirar los neutrófilos utilizando una pipeta de plástico, asegúrese de no apretar el globo, mientras que en la capa de células, como inyectar líquido perturbará las capas. Además, inspeccione visualmente el sedimento de neutrófilos de...

Los neutrófilos (PMNs) son fagocitos profesionales que juegan un papel clave en la respuesta inmune innata contra Staphylococcus aureus 1. La batalla constante entre el huésped y microbio ha llevado a una carrera de armamentos de ambos. Recientemente, cepas relacionadas con la comunidad (CA) de la meticilina resistente S. aureus (MRSA) se han comprobado que parece ser muy eficiente en la elusión de los neutrófilos muerte 2,3. Modulina (MEP) soluble en fenol producción excesiva de CA-MRSA se ha asociado con una mayor virulencia 4,5. Los neutrófilos humanos pueden reconocer estos MEP a través de FPR2 que conducen a la activación de esta proteína G-receptor acoplado a 6. Uno de los acontecimientos más tempranos es la movilización de las reservas intracelulares de calcio (Ca2 +). Ca 2 + actúa como un segundo mensajero para una variedad de funciones efectoras de los PMN incluyendo la desgranulación y la fagocitosis 7. Por lo tanto Ca 2 + es un indicador muy sensible de lacapacidad funcional de las MEP para activar PMNs. Para estudiar los efectos de las MEP sobre los neutrófilos, los neutrófilos frescas se aíslan y se cargan con un medio de contraste que emite fluorescencia en la movilización del calcio. En un experimento de citometría de flujo de esta rápida movilización se puede medir. El uso de este método, es posible estudiar los efectos directos de los componentes tóxicos y otro sobre los neutrófilos, y determinar la concentración más baja a la que éstos están activos. Para nosotros, es una herramienta muy útil para estudiar el efecto de muchas proteínas producidas por S. aureus implicado en la evasión inmune, como FPR2 proteína inhibidora (FLIPR) 8, FLIPR-like 7 y quimiotaxis proteína inhibidora de Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Todas estas proteínas se ha demostrado que inhiben la movilización de calcio en los neutrófilos por la unión al receptor que reconoce el agonista. Recientemente, nuestro grupo ha descrito que las MEP son funcionalmente inhibidos por las lipoproteínas séricas de 10 &lt;/ Sup&gt;. Estas lipoproteínas son abundantemente presente dentro de la sangre y el tejido humano, lo que indica que las MEP ejercen su función principalmente en el medio ambiente intracelular. La disponibilidad del ensayo de movilización de calcio nos permitió medir precisamente el efecto de las lipoproteínas séricas en la activación de neutrófilos por los MEP, indicado por la considerable inhibición por concentraciones muy bajas de suero. Dado que los MEP están funcionalmente inhibidos por el suero, la hipótesis de que hay una función importante para las MEP como las toxinas intracelulares. Por lo tanto, trató de determinar el papel de las MEP después de la fagocitosis. Para investigar la expresión de los PSM en el espacio intercelular, hemos construido fusiones reportero del promotor del operón psmα a GFP. Cuando estos reportero cepas de S. aureus fueron fagocitadas por los neutrófilos, la inducción de la expresión se observa mediante microscopía de fluorescencia 10. Obviamente, esta technique permite el estudio de la expresión de un gran número de genes en S. aureus u otros patógenos después de la fagocitosis. Dado que para S. aureus sobrevivir en el nicho intercelular es muy importante para superar el sistema inmune innato 11 10 12, el estudio del papel de los genes activados en este nicho es altamente relevante para la comprensión de su virulencia.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Sondas moleculares / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>densidad 1.077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>densidad 1.119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>contiene 25 mM HEPES y L-glutamina</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 Microscopio Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsistemas, Países Bajos</td><td>TCS SP5</td><td>objetivo: HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Muy importante que el tubo pueda ser retirado y reemplazado durante el proceso de medición</td></tr></tbody></table>

el estudio de las interacciones de<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía tiempo lapso

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Se presentan métodos para estudiar el efecto de modulinas solubles en fenol (PSM) y otras toxinas producidas y secretadas por Staphylococcus aureus en los neutrófilos. Para estudiar los efectos de los PSM en los neutrófilos que aislamos neutrófilos frescos utilizando centrifugación en gradiente de densidad. Estos neutrófilos se cargan con un medio de contraste que emite fluorescencia en la movilización del calcio. La activación de los neutrófilos por las MEP inicia un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre intracelular. En un experimento de citometría de flujo de esta rápida movilización se puede medir mediante el control de la fluorescencia de un colorante pre-cargado que reacciona con el aumento de la concentración de Ca2 + libre. Con este método se puede determinar la concentración PSM necesario activar los neutrófilos, y medir los efectos de los inhibidores específicos y generales de la activación de los neutrófilos. Para investigar la expresión de los PSM en el espacio intracelular, we han construido fusiones reportero del promotor del operón PSMα a GFP. Cuando estos reportero cepas de S. aureus son fagocitadas por los neutrófilos, la inducción de la expresión se puede observar mediante microscopía de fluorescencia.

Ensayo de citometría de flujo para la evaluación de la movilización de calcio en los PMN humanos La incubación de los neutrófilos con una serie de concentración de PSMα3 sintéticos resultantes en la activación rápida tal como se mide por el flujo de calcio, que se muestra por un aumento en la señal en FL-1. Pre-incubación de PSMα3 sintético con 0,01%, 0,1% o 1% de suero humano inhibió significativamente la capacidad para obtener los flujos de calcio (Figura 1). <p class="jo...

Se presentan métodos para estudiar el efecto de las MEP y otras toxinas secretadas por<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; En los neutrófilos usando citometría de flujo y microscopía de fluorescencia.

El estudio de las interacciones de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar los efectos del fenol estafilocócico, el modulina soluble o las PSM sobre los neutrófilos humanos. Esto se logra primero aislado neutrófilos de sangre humana para su posterior análisis in vitro. A continuación, los neutrófilos se cargan con un colorante fluorescente y se mezclan con una serie de concentraciones de PSM con y sin inhibidores, o bien se les permite fagocitar bacterias S. aureus que contienen una construcción reportera GFP bajo el promotor alfa de PSM.Finalmente, la activación de los neutrófilos mediante estimulación con PSM puede monitorizarse mediante citometría de flujo y la expresión de GFP por las bacterias fagocitadas puede analizarse mediante microscopía de fluorescencia. Con este método, puede estudiarse los efectos de estafilococos, fenilo, soya, molinas o neutrófilos.Por supuesto, este método puede aplicarse a muchos otros tipos celulares, estímulos y antagonistas. Tuvimos por primera vez la idea de la parte de microscopía de este método al discutir una forma de observar los efectos de los PSM dentro de los neutrófilos. Utilizar un constructo bacteriano de expresión de GFP y la microscopía de lapso de tiempo nos permite hacer exactamente eso.Después de extraer cinco tubos de sangre venosa heparinizada, vierta 12 mililitros de una solución de fial con densidad de 1,119 gramos por mililitro en un tubo de 50 mililitros y luego superponga cuidadosamente 10 mililitros de una solución FI call con densidad de 1,077 gramos por mililitro. A continuación, diluya la sangre con un volumen igual de PBS y aplique cuidadosamente entre 20 y 25 mililitros de sangre sobre cada gradiente dual de fi call. Centrifugue los gradientes durante 20 minutos a 396 ×g y 22 °C sin frenado.Luego, utilice una bomba de vacío equipada con una punta de pipeta estéril para aspirar las capas superiores amarilla de plasma y de PBMC. A continuación, la tercera capa blanca. Ahora, use una pipeta plástica pequeña para transferir la fracción de neutrófilos polimorfonucleares o fracción PMN de cada tubo a un nuevo tubo de 50 mililitros.Agregue recién preparado PMI preenfriado suplementado con albúmina sérica humana o R-P-M-I-H-S-A a cada tubo para llevar el volumen total a 50 mililitros. Luego, centrifugue las células, aspire el sobrenadante con una bomba de vacío y remueva suavemente mediante vórtex el sedimento que contiene eritrocitos y PMN. A continuación, agregue nueve mililitros de agua estéril desionizada a las células e inicie un cronómetro.Añada exactamente 30 segundos. Añada un mililitro de PBS concentrado 10 veces para detener el choque hiperosmótico. Luego lave las células en un volumen total de 50 mililitros de R-P-M-I-H-S-A frío.Después de eliminar el sobrenadante, agregue un mililitro de R-PMI-HSA a cada pozo, que ahora es blanco debido a la lisis de los eritrocitos. Luego, resuspenda mediante pipeteo y combine los pellet en un solo tubo. A continuación, cuente las células y ajuste la concentración a 1 × 10⁷ células por mililitro.Ahora cargue cinco veces 10 a la sexta células por mililitro con dos micromoles de fluoh 3:00 AM en R-P-M-I-H-S-A. Y cubra el tubo con papel de aluminio para protegerlo de la luz. A continuación, incube las células durante 20 minutos a temperatura bajo agitación.Mientras tanto, prepare una dilución serial por triplicado del estímulo a 10 veces la concentración final. Luego, preincube 30 microlitros del estímulo con un volumen igual de inhibidor recién preparado a 10 veces la concentración o tampón durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave las células con 10 mililitros de R-P-M-I-H-S-A y resuspenda las células en R-P-M-I-H-S-A fresco a cinco veces 10 a la sexta células por mililitro.Inmediatamente antes del análisis de flujo, diluya las células hasta dos veces 10 a la sexta células por mililitro en R-P-M-I-H-S-A y agregue 200 microlitros de células por tubo FACS. Teniendo cuidado de no activar las células agitándolas o pipeteándolas, coloque el primer tubo en el citómetro de flujo. Espere tres segundos y luego inicie la adquisición; después de un período de tiempo fijo, por ejemplo, ocho segundos, retire el tubo y agregue rápidamente 50 microlitros de la dilución más baja del estímulo a la muestra.Vuelva a cargar inmediatamente el tubo y continúe con la adquisición. Cuando finalice una serie de diluciones, lave la aguja del citómetro de flujo con R-P-M-I-H-S-A fresco antes de medir una nueva serie. Después de analizar la última muestra, analice los datos con software de análisis de citometría de flujo para evaluar la expresión bacteriana de GFP.Después de la fagocitosis por PMN, cultivar una cepa S. ous que contenga el constructo reportero de interés durante la noche en caldo; eliminar cualquier GFP expresada durante el cultivo nocturno diluyendo las células hasta una DO600 de 0,01. Crecer el cultivo hasta una DO600 de 0,1. Diluir las células uno a treinta y luego monitorear el crecimiento hasta que el cultivo alcance nuevamente una DO600 de 0,1.Luego, recoger las bacterias mediante centrifugación. Lavar las células una vez con DPBS y Resus. Suspender el cultivo.Añada de uno a 10 del volumen original para obtener una DO600 de 1,0 o aproximadamente cinco veces 10⁸ UFC por mililitro. Ahora mezcle las bacterias con el PNS recién aislado en R-PMI-HSA en una proporción de 10 a 1. Luego añada suero humano agrupado hasta alcanzar un volumen final de un décimo del volumen total de suero humano agrupado dentro de la solución celular.Estimule la fagocitosis agitando la mezcla celular durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Luego, diluya los PMN cargados con bacterias hasta cinco veces 10 a la quinta células por mililitro, y transfiera 250 microlitros de las células a cada pocillo de una cubreobjetos con ocho pocillos. Finalmente, observe las células en un microscopio invertido equipado con un objetivo de 40 x y encerrado en una cámara con entorno oscuro, y adquiera imágenes en múltiples ubicaciones dentro de las cámaras del cubreobjetos cada cinco a 10 minutos, tanto en campo claro como en el canal GFP, para seguir en tiempo real la producción bacteriana de GFP. La incubación de neutrófilos con una serie de concentraciones del PSM sintético alfa tres produce una activación rápida dependiente de la dosis de las células, medida mediante el flujo de calcio.La preincubación del péptido PSM alfa tres con 0,01 %, 0,1 % o 1 % de suero humano inhibió significativamente la capacidad del estímulo para provocar una respuesta de calcio. Nuevamente, de manera dependiente de la dosis, al 1 % de suero. Casi no se observa activación a estas concentraciones de PSM alfa tres.En estas imágenes, se muestran dos neutrófilos que contienen bacterias fagocitadas con una construcción reportera de PSM alfa GFP. Las bacterias comienzan a fluorescer aproximadamente una hora después de la fagocitosis, lo que indica la expresión de GFP a partir del promotor PSM alfa. Las bacterias ubicadas fuera de los neutrófilos no fluorescen, lo que demuestra que la expresión de PSM alfa se activa rápidamente únicamente cuando las bacterias son fagocitadas.Al intentar este procedimiento, es importante recordar siempre utilizar neutrófilos frescos para obtener resultados óptimos. Después de ver este video, espero que tenga una buena comprensión de cómo medir el flujo de calcio mediante citometría de flujo y cómo medir la expresión génica bacteriana dentro de células eucariotas utilizando microscopía de fluorescencia.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Este video muestra un ensayo in vitro para estudiar la interacción entre neutrófilos y biopelícula. Las bacterias patógenas incrustadas en la biopelícula y los neutrófilos aislados se marcaron mediante marcadores fluorescentes, y la respuesta inmunitaria de los neutrófilos y la evasión de la respuesta inmunitaria de las bacterias se evaluaron mediante un microscopio de fluorescencia.

Un ensayo in vitro para estudiar la interacción entre los neutrófilos y el biofilm

El video muestra un método para investigar el impacto de las células estromales en el reclutamiento de leucocitos. En un modelo de cámara de flujo de placas paralelas, las citocinas proinflamatorias inducen la expresión de receptores de adhesión por parte de las células endoteliales, lo que facilita el reclutamiento y la migración de neutrófilos. La diafonía entre las células estromales y las células endoteliales disminuye el reclutamiento de neutrófilos a las células endoteliales.

Una investigación de flujo in vitro del efecto de las células estromales en el reclutamiento de leucocitos

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

La capacidad del endotelio inflamado para reclutar leucocitos de flujo se regula por las células estromales mesenquimales. Se describen dos modelos in vitro que incorporan células humanas primarias que se pueden utilizar para evaluar el reclutamiento de neutrófilos de flujo y examinar el papel que las células estromales mesenquimales desempeñan en la regulación de este proceso.

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Este estudio describe el monitoreo microscópico de la adherencia del neumococo a las cadenas del factor von Willebrand producidas en la superficie de células endoteliales primarias humanas diferenciadas bajo tensión de cizallamiento en condiciones de flujo definidas. Este protocolo se puede extender a la visualización detallada de estructuras celulares específicas y cuantificación de bacterias mediante la aplicación de procedimientos de inmunoinso diferencial.

Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Este protocolo de imágenes celulares de células bacterianas vivas permite visualizar las interacciones entre múltiples especies bacterianas a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo. Las imágenes de lapso de tiempo permiten la observación de cada especie bacteriana en monocultivo o cocultura para interrogar las interacciones entre especies en comunidades bacterianas multiespecies, incluida la motilidad celular individual y la viabilidad.

Visualización cinética de interacciones bacterianas entre especies de una sola célula

El presente protocolo describe el estudio de las interacciones neutrófilos-biofilm. Las biopelículas de Staphylococcus aureus se establecen in vitro y se incuban con neutrófilos humanos derivados de sangre periférica. La respuesta de explosión oxidativa de los neutrófilos se cuantifica, y la localización de neutrófilos dentro de la biopelícula se determina mediante microscopía.

Ensayos in vitro estandarizados para visualizar y cuantificar las interacciones entre neutrófilos humanos y biopelículas de Staphylococcus aureus

Este protocolo describe un enfoque cuantitativo para medir la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes.

Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

En este manuscrito, proporcionamos un protocolo completo para evaluar la supervivencia antibiótica de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, transformando plásmidos en P. aeruginosa y S. aureus para crear cepas reporteras y visualizar variantes fenotípicas, como persistentes, mediante microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo.

Imágenes de microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo de fenotipos heterogéneos de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus

Aprenda a estudiar la activación de neutrófilos humanos por PSMs de Staphylococcus aureus mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Este método permite analizar respuestas inmunitarias in vitro.

El estudio de las interacciones de Staphylococcus aureus Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso (Video) | JoVE Journal

El estudio de las interacciones de

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