El estudio de las interacciones de Staphylococcus aureus Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar los efectos del fenol estafilocócico, la modlina soluble o los PSM en los neutrófilos humanos. Esto se logra aislando primero los neutrófilos de la sangre humana para su posterior análisis in vitro. A continuación, los neutrófilos se cargan con un tinte fluorescente y se mezclan con una serie de concentraciones de PSM con y sin inhibidores, o se les permite fagocitar bacterias S. reus que contienen una construcción reportera GFP del promotor alfa de PSM.

En última instancia, la activación de los neutrófilos por estimulación de PSM puede ser monitoreada por citometría de flujo y la expresión de GFP por el fagocitado. Las bacterias pueden ser analizadas por microscopía de fluorescencia por este método. Puede estudiar los efectos de los estafilocócicos, fenilo, soja, molinas o neutrófilos.

Por supuesto, este método se puede aplicar a muchos otros tipos de células, estímulos y antagonistas. Primero tuvimos la idea de la parte de microscopía de este método cuando discutimos una forma de observar los efectos de los PSM dentro de los neutrófilos. El uso de una construcción de expresión de GFP bacteriana y una microscopía de lapso de tiempo nos permite hacer exactamente eso.

Después de extraer cinco tubos de sangre venosa heparinizada, vierta 12 mililitros de una solución FIAL de densidad de 1,119 gramos por mililitro en un tubo de 50 mililitros y luego superponga cuidadosamente 10 mililitros de una solución FI de densidad de 1,077 gramos por mililitro. A continuación, diluya la sangre con un volumen igual de PBS y coloque cuidadosamente una capa de 20 a 25 mililitros de sangre en cada gradiente de fi call de doble capa. Centrifugar los gradientes durante 20 minutos a 396 veces G y 22 grados centígrados sin romperse.

A continuación, utilice una bomba de vacío equipada con una punta de pipeta estéril para aspirar las capas superiores de plasma amarillo y PBMC. Y luego la tercera capa blanca. Ahora use una pequeña pipeta de plástico para transferir el neutrófilo polimorfonuclear o fracción PMN de cada tubo a un nuevo tubo de 50 mililitros.

Agregue pre-enfriar nuestro PMI recién preparado suplementado con albúmina sérica humana o R-P-M-I-H-S-A a cada tubo para llevar el volumen total a 50 mililitros. A continuación, gire las células, aspire el sobrenadante con una bomba de vacío y vórtice suavemente el eritrocito rojo y el pellet que contiene PMN. A continuación, agregue nueve mililitros de agua desionizada estéril a las celdas e inicie un temporizador.

Agregue exactamente 30 segundos. Agregue un mililitro de PBS 10 veces concentrado para detener el choque hiperosmótico. A continuación, lavar las células en un volumen total de 50 mililitros de R-P-M-I-H-S-A frío.

Después de eliminar el sobrenadante, agregue un mililitro de R-P-M-I-H-S-A a cada paladar, que ahora está blanco debido a la lisis de los eritrocitos. A continuación, resus, suspender pipeteando y combinar los gránulos en un tubo. Ahora cuenta las celdas y ajusta la concentración a una por 10 hasta la séptima celdas por mililitro.

Ahora cargue cinco veces 10 a la sexta celdas por mililitro con dos micromolares gripe oh 3:00 AM en R-P-M-I-H-S-A. Y cubra el tubo con papel de aluminio para protegerlo de la luz. A continuación, incube las células durante 20 minutos a temperatura bajo agitación.

Mientras tanto, prepare una dilución en serie triple del estímulo a 10 veces la concentración final. A continuación, preincubar 30 microlitros del estímulo con un volumen igual de inhibidor o tampón 10 veces concentrado recién preparado durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave las células en 10 mililitros de R-P-M-I-H-S-A y vuelva a suspender las células en R-P-M-I-H-S-A fresco a cinco veces 10 a la sexta célula por mililitro.

Justo antes del análisis de flujo, diluya las celdas a dos veces 10 a la sexta celdas por mililitro en R-P-M-I-H-S-A y agregue 200 microlitros de celdas por tubo de fax. Tenga cuidado de no activar las células agitando o pipeteando, cargue el primer tubo en el citómetro de flujo. Espere tres segundos y luego inicie la adquisición después de un período de tiempo fijo, por ejemplo, ocho segundos, retire el tubo y agregue rápidamente 50 microlitros de la dilución más baja del estímulo a la muestra.

Recargue inmediatamente el tubo y continúe con la adquisición. Cuando termine una serie de dilución, lave la aguja del citómetro de flujo con R-P-M-I-H-S-A nuevo antes de medir una nueva serie. Después de ejecutar la última muestra, analice los datos con el software de análisis de citometría de flujo para analizar la expresión de GFP bacteriana.

Después de la fagocitosis de PMN, cultive una cepa S ous que contenga la construcción reportera de interés durante la noche en caldo, elimine cualquier GFP expresada durante el cultivo durante la noche diluyendo las células a OD 6 60 0 0.01. Aumentar la cultura a OD 6 60 0 0,1. Diluya las células de una a 30 y luego controle el crecimiento hasta que el cultivo vuelva a alcanzar un OD 66 de 0,1.

A continuación, recoja las bacterias por centrifugación. Lave las celdas una vez en DPBS y Resus. Suspender la cultura.

Agregue uno a 10 del volumen original para obtener un OD 60 de 1.0 o aproximadamente cinco veces 10 a la octava UFC por mililitro. Ahora mezcle las bacterias con el PNS recién aislado en R-P-M-I-H-S-A en una proporción de 10 a uno. A continuación, añada suero humano agrupado a una décima parte del volumen final total de suero humano agrupado dentro de la solución celular.

Estimula la fagocitosis agitando la mezcla celular durante 10 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, diluya las PMN cargadas de bacterias a cinco veces 10 por la quinta célula por mililitro, y transfiera 250 microlitros de las células a cada pocillo de un cubreobjetos de ocho pocillos. Finalmente, obtenga imágenes de las células en un microscopio invertido equipado con un objetivo de 40 x y encerrado en una cámara de ambiente oscuro y adquiera imágenes en múltiples ubicaciones en las cámaras de deslizamiento de cobertura cada cinco a 10 minutos tanto en el campo claro como en el canal GFP para seguir la producción bacteriana de GFP en tiempo real, incubando neutrófilos con una serie de concentraciones de PSM alfa sintético tres da como resultado una activación rápida dependiente de la dosis de la células medidas por el flujo de calcio.

La preincubación del péptido PSM alfa tres con 0,01%, 0,1% o 1% de suero humano inhibió significativamente la capacidad del estímulo para provocar una respuesta de calcio. De nuevo, en forma dependiente de la dosis al 1% de suero. Apenas se aprecia ninguna activación en estas concentraciones de PSM alfa tres.

En estas imágenes, se muestran dos neutrófilos que contienen bacterias fagocitadas que contienen una construcción reportera de PSM alfa GFP. Las bacterias comienzan a emitir fluorescencia aproximadamente una hora después de la fagocitosis, lo que indica la expresión de GFP del promotor PSM Alfa. Las bacterias fuera de los neutrófilos no emiten fluorescencia, lo que indica que la expresión alfa de PSM se activa rápidamente solo cuando las bacterias están fagocitadas.

Al intentar este procedimiento es importante recordar que siempre se deben usar neutrófilos frescos para obtener resultados óptimos. Después de ver este video, espero que tenga una buena comprensión de cómo medir el flujo de calcio mediante citometría de flujo y cómo medir la expresión génica bacteriana dentro de las células eucariotas mediante microscopía de fluorescencia.