Registro electrofisiológico simultáneo e imágenes de calcio de neuronas del núcleo supraquiasmático

El objetivo general del siguiente experimento es examinar la interacción entre los cambios en el voltaje o la corriente, como los cambios en la acción, la frecuencia de disparo potencial y la concentración de calcio intracelular en las neuronas del núcleo supramático. Esto se logra preparando el corte de cerebro para el registro de las neuronas del núcleo de la AME utilizando un microelectrodo lleno de la sonda sensible al calcio. Como segundo paso, el microelectrodo se sella con la membrana neuronal.

A continuación, se rompe la membrana neuronal sellada con el microelectrodo para introducir la sonda fluorescente de calcio en las neuronas individuales y para registrar junto con la actividad eléctrica de la membrana se obtienen resultados que muestran medidas de voltaje o corriente e imágenes de fluorescencia de la sonda de calcio a dos longitudes de onda, la alteración en la relación de fluorescencia a estas longitudes de onda refleja el cambio de calcio intracelular dentro de la neurona. Se pueden realizar análisis posteriores para determinar la concentración de calcio de la célula. La principal ventaja de esta técnica es que los cambios en la actividad eléctrica de la membrana y el calcio intracelular producidos por la activación sináptica se pueden medir simultáneamente en neuronas individuales del núcleo supracosmético.

Demostrando esta técnica estará mi colega el Dr. Robert Irwin. Comience este procedimiento colocando el cerebro de rata sobre un papel de filtro circular humedecido con solución para cortar en una placa de Petri de vidrio, descansando sobre hielo, corte la corona cerebral solo para eliminar el cerebelo y el tronco encefálico, y corte partes de los lados derecho e izquierdo de la corteza, dejando un bloque de cerebro que contenga el hipotálamo y preservando cuidadosamente el lado ventral del cerebro que contiene los nervios ópticos SCN y el quiasma óptico. Después de eso, extienda una capa delgada de pegamento acrílico Sano, lo suficientemente grande como para unir el cerebro y los bloques de aros en una cámara de corte de micrótomo helada.

Transfiera el bloque de cerebro helado con el lado hacia abajo sobre el pegamento con el lado que contiene el SCN colocado para cortar primero y los nervios ópticos formando una v apuntando hacia arriba, coloque los bloques aros en otros tres lados. Posteriormente, llene la cámara con tampón de corte helado y burbujee continuamente con carbógeno. El pegamento acrílico Sano se solidificará con la humedad y mantiene el cerebro y los bloques de aros en su lugar.

A continuación, corte las rodajas hipotalámicas coronales que contienen el SCN con un grosor de 220 a 250 micras. Tenga en cuenta que el bloque aros izquierdo se desprendió durante el corte. Esto puede suceder si no se aplica suficiente pegamento.

Después de eso, identifique el segmento que contiene el SCN. Por lo general, se elige un corte donde el quiasma óptico mide aproximadamente de dos a cuatro milímetros de ancho y aparece como una banda blanca con el NSQ solo dorsal que aparece como dos pequeñas hendiduras en el quiasma óptico a cada lado del tercer ventrículo. Transfiera un corte a la cámara de registro de 36 grados Celsius montada en la platina de un microscopio.

La cámara se llena con una solución de grabación que fluye continuamente a dos mililitros por minuto. Aireado con un 95% de carbógeno y precalentado con un calentador en línea. Identifique el NSQ observando los dos núcleos translúcidos del NSQ a ambos lados del tercer ventrículo, dorsales al quiasma óptico que aparece como una banda negra cuando se ilumina con luz transmitida.

Para preparar el microelectrodo para el registro, rellénelo con la solución interna que contiene la sonda de calcio filtrada con un filtro de jeringa de cuatro milímetros a través de un tubo de microllenado. A continuación, coloque el microelectrodo en el soporte de microelectrodos. A continuación, aplique una pequeña cantidad de presión positiva continua al electrodo.

Baje el microelectrodo en la cámara de registro con la guía de la iluminación de luz roja. A continuación, coloque el microelectrodo sobre el SCN utilizando un objetivo de baja potencia. Después de eso, cambie el microscopio a un aumento de alta potencia para seleccionar una subregión de SCN y una neurona SCN individual.

Continúe aplicando una presión positiva suave al microelectrodo a medida que avanza sobre la superficie de la celda. Una vez que esté en la superficie, aplique una suave presión negativa para formar un sello con una resistencia de tres a 10 giga ohmios. Después de eso, ajuste el voltaje de la membrana a menos 60 milivoltios.

A continuación, aplique presión negativa adicional al electrodo para romper la membrana celular con el fin de formar la sujeción del parche de toda la célula. Al entrar en el modo de célula completa, el soma y las dendritas de la neurona SCN se llenarán con la sonda fluorescente. Mida el voltaje de la membrana en el modo de pinza de corriente o la corriente en el modo de pinza de voltaje.

Mientras se monitorean y almacenan los datos de la imagen de la sonda de calcio, las imágenes adquiridas se pueden ver junto con un gráfico de datos de fluorescencia de relación de 340 nanómetros y 380 nanómetros. Durante el experimento, se utiliza un monocronómetro para obtener las mediciones de calcio cuantitativamente exponiendo rápidamente el SCN a la luz ultravioleta. A 340 nanómetros y 380 nanómetros, la luz de excitación pasa a través de un filtro óptico UG 11 para restringir las longitudes de onda armónicas por encima de 400 nanómetros y un espejo dicroico DCLP de 400 nanómetros refleja la luz sobre el tejido.

La luz emitida pasa a través de un filtro de emisión de 510 nanómetros y es capturada por la cámara. Para analizar el resultado, seleccione una región de interés de la imagen inicial y una región de fondo para convertirla en unidades de intensidad de fluorescencia relativa. Los datos de la región de interés se ven en tiempo real durante el experimento.

Los antecedentes se utilizan posteriormente en el análisis de datos posterior. Aquí hay una imagen de campo claro de un corte coronal del hipotálamo que contiene el SCN y el quiasma óptico. Un microelectrodo de vidrio lleno de solución interna que contiene BISRA dos se sella en una sola neurona.

Aquí se muestran las respuestas de calcio a una serie de 50 pasos de voltaje registrados desde una neurona SCN sujeta a voltaje. Las corrientes de sodio dependientes de voltaje se inhibieron con TTX de 0,5 micromolares, y esta es una imagen de captura de pantalla de las regiones somáticas y dendríticas de interés correspondientes a las respuestas de calcio. Estos son los ejemplos de respuestas del calcio a un número variable de pasos de voltaje.

Esta figura muestra el registro simultáneo del voltaje de membrana y el calcio intracelular. En una neurona SCN, el experimento de pinza de corriente se realizó en presencia de ritoxina de 50 micromolares. Una pequeña despolarización del potencial de membrana desencadenó varios episodios de acción, disparando el potencial con el correspondiente aumento y posterior descenso del calcio intracelular.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar cortes de cerebro de núcleo supracosmético saludables y realizar experimentos electrofisiológicos y de imagen simultáneos. No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de protección ocular adecuada al realizar este procedimiento.