Biopelículas microbianas electroactivas derivadas de aguas residuales: crecimiento, mantenimiento y caracterización básica

El objetivo general de este procedimiento es cultivar una biopelícula microbiana electroactiva anódica a partir de inoculación de aguas residuales y caracterizar sus propiedades bioelectrocatalíticas. Esto se logra configurando primero, inoculando y poniendo en marcha un potencial reactor discontinuo alimentado bioelectroquímicamente controlado estáticamente. El segundo paso es monitorear la producción actual utilizando Krono Pyrometry.

A continuación, el medio se intercambia regularmente después del agotamiento del sustrato hasta que se alcanza una densidad de corriente máxima reproducible, lo que representa una formación de biopelícula en estado estacionario. El paso final es estudiar la transferencia de electrones extracelular de bacterias electroactivas utilizando telemetría de volumen cíclico durante la presencia y ausencia del sustrato. En última instancia, el análisis de datos proporciona información fundamental sobre la termodinámica de la transferencia de electrones microbianos y permite determinar el potencial formal de los sitios de transferencia de electrones extracelulares posibles y reales.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede obtener una visión directa de la transferencia de electrones entre microorganismos y electrodos sólidos, y así derivar información fundamental sobre la transferencia de electrones extracelular microbiana. Por lo general, las personas nuevas en el método tendrán dificultades con la elección correcta de los parámetros y la interpretación correcta de la gráfica derivada. Durante la adquisición y el análisis de datos, se pueden cometer errores graves.

Antes de comenzar este procedimiento, prepare una cantidad adecuada del medio de crecimiento utilizando un tampón de fosfato, incluyendo más nutrientes de acuerdo con la siguiente referencia. Utilice 10 milimolares de acetato de sodio como sustrato. Agregue un mililitro de aguas residuales primarias por cada 20 mililitros de crecimiento, medio como inóculo.

A continuación, inserte una aguja en el medio y enjuáguelo con nitrógeno durante al menos media hora. Para desairearlo mientras se enjuaga con nitrógeno, mida el tamaño del electrodo para la configuración de tres electrodos. Inserte el electrodo de trabajo, el contraelectrodo y el electrodo de referencia en un matraz modificado de cuatro cuellos y 250 mililitros de fondo redondo a través de tapones de silicona.

Envuelva los tapones de silicona con paraform para sellar el sistema mientras se enjuaga con nitrógeno. Vierta 250 mililitros del medio de crecimiento y la mezcla de inóculo a través del puerto de muestreo en el reactor. Cierre el puerto de muestreo con un tapón de silicona y séllelo herméticamente con perfil.

Coloque el recipiente en una cámara de temperatura controlada de 35 grados centígrados para garantizar condiciones ambientales constantes. A continuación, conecte los electrodos a los cables respectivos del estado de potencial. Abra el software para controlar la estadística potencial y elija la técnica.

Cronopirometría. Ajuste el electrodo de trabajo a un potencial constante de 0,2 voltios durante un tiempo de duración de 500 horas registrando cada 600 segundos después de esto, inicie la cronoprobotría y observe el gráfico de la corriente medida a lo largo del tiempo. Después de calcular las densidades de corriente preferenciales, trace la densidad de corriente medida en función del tiempo.

Después de que la corriente oxidativa alcance una meseta y vuelva a la corriente cero, detenga la medición métrica de cronos amperios para un intercambio de medios. Por lo tanto, transfiera el recipiente a una caja de flujo laminar y enjuague el sistema con nitrógeno. Descargue con cuidado el medio y reponga con medio desaireado fresco después de la reposición del medio.

Cierre el puerto de muestreo y séllelo con paraform. Repita los pasos anteriores hasta que la corriente oxidativa máxima alcance un estado estacionario. Después de cada ciclo de crecimiento, tome una muestra de un mililitro de las soluciones frescas y del medio intercambiado para el análisis del sustrato por HPLC. Para estudiar la transferencia de electrones extracelulares, seleccione la técnica de telemetría de volumen cíclico en el software de control de estadísticas de potenciales.

A continuación, ajuste el potencial inicial EI del electrodo de trabajo a menos 0,5 voltios frente al electrodo de referencia, el potencial de vértice E de uno a 0,3 voltios y el potencial final E de dos a menos 0,5 voltios. Utilice una velocidad de escaneo de un milivoltio por segundo. Inicie el experimento y registre al menos tres ciclos para obtener un CV reproducible.

Después de calcular las densidades de corriente preferentes, trace la densidad de corriente medida en función del potencial del electrodo de trabajo. A partir de las mediciones métricas de cronoamperios, se puede medir la densidad de corriente máxima y la eficiencia de Kula. Aquí se muestra una curva de crecimiento cronométrica típica de la biopelícula de varios ciclos de crecimiento utilizando un reactor discontinuo alimentado.

Después de la fase de retraso inicial, comienza una primera densidad de corriente máxima y luego la corriente disminuye a un flujo de corriente casi nulo debido al agotamiento del sustrato. Después de la reposición del sustrato. La densidad de corriente vuelve a aumentar con una densidad de corriente máxima más alta.

Después de varios ciclos de crecimiento, la densidad de corriente máxima es constante, lo que indica una formación de biopelícula en estado estacionario. Como el máximo del estado estacionario. El valor de la densidad de corriente depende de varios parámetros.

A menudo se considera una característica de los sistemas de electrodos de biopelícula microbiana electroactiva. La segunda característica operativa es la eficiencia ómica, que es el número de electrones registrados como flujo de corriente eléctrica por ciclo de lote alimentado relacionado con el número máximo teórico de electrones. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre cómo calcular la eficiencia de llamada, el flujo de corriente eléctrica y el número máximo teórico de electrones que se muestra.

Aquí hay un CV típico para condiciones sin rotación. A una velocidad de exploración alta, se muestra el CV de una biopelícula para velocidades de exploración altas en las que solo se puede identificar un par de picos y, por lo tanto, una FE potencial formal. Aquí. En general, el potencial formal de un par redox se puede calcular a partir del potencial máximo del pico de oxidación EPA y el pico de reducción de la especie respectiva EPC.

Al formar la media aritmética, consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre cómo calcular el potencial formal. Al aplicar una velocidad de escaneo lo suficientemente baja a la biopelícula idéntica, se pueden identificar hasta cuatro pares redox. Sin embargo, el CV sin rotación solo muestra todos los compuestos activos redox en el electrodo y, por lo tanto, la FE de los posibles sitios de transferencia de electrones extracelulares.

Solo el análisis del CV de rotación proporciona el EF de los sitios EET reales cuando se analizan más a fondo los CV sin rotación. Se pueden analizar otros parámetros característicos como la separación de picos, la corriente de pico máxima y la densidad de corriente de pico mínima. Estos parámetros, especialmente cuando se registran para diferentes velocidades de escaneo, se pueden utilizar para análisis mecánicos y cinéticos de los procesos de transferencia de electrones en los electrodos.

Sin embargo, este análisis cinético que está bien establecido para los sistemas químicos no es sencillo para las biopelículas microbianas electroactivas. Al realizar la medición de CV en presencia de sustrato, se obtiene un CV de rotación. Después de trazar los datos, se observa la curva bioelectrocatalítica típica en forma de S.

Al analizar más a fondo los datos, el máximo de la primera derivada o el punto de inflexión de la curva proporciona el EF potencial formal de los sitios EET reales. En el caso de una biopelícula dominada por una proporción delgada de Geobacter, se pueden observar dos puntos de inflexión. Posteriormente, la derivada muestra dos máximos correspondientes al potencial formal de los sitios EET activos bioelectrocatalíticos, que se denominan EF dos y EF tres respectivamente.

Este hallazgo también muestra que los procesos redox asociados con los potenciales formales EF uno y EF cuatro no están relacionados con la bioelectrólisis. A medida que la biopelícula crece y se vuelve más gruesa, el CV muestra solo un punto de inflexión. Este potencial formal EEF negativo 0,32 voltios frente a plata, cloruro de plata es aproximadamente igual a la media aritmética de los dos potenciales formales asignados al EET de la biopelícula delgada.

Este resultado muestra que el análisis CV fundamental proporciona información sobre la termodinámica de EET de una manera rápida y no invasiva. Una vez dominada, esta técnica se puede adaptar fácilmente a diferentes sistemas de interés y, dependiendo de los datos, permite una profundidad diferente de análisis de datos si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento y aprendiendo los conceptos básicos de la geometría de biopelículas microbianas, se pueden aprender fácilmente otros métodos como la telemetría de onda cuadrada o la espectroscopia de impedancia electroquímica, así como el análisis de datos en profundidad.