Un ensayo de una sola mosca por el comportamiento de forrajeo en Drosophila

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los cambios de comportamiento desencadenados por la privación de alimentos en la mosca adulta Salala Melanogaster. Esto se logra primero matando de hambre a las moscas durante 18 a 24 horas. El segundo paso es cargar moscas individuales en cámaras de comportamiento, cada una de las cuales contiene una fuente de olor atractiva en su centro.

A continuación, un sistema informático con una cámara digital rastrea la posición de cada vuelo a lo largo del tiempo y los registra. Sus coordenadas para su posterior análisis de datos. El paso final es determinar la latencia de cada mosca para llegar a la fuente de olor utilizando un software personalizado.

En última instancia, este ensayo de comportamiento de búsqueda de alimentos de alto rendimiento se puede utilizar para estudiar la relación entre la función del circuito neuronal y las respuestas conductuales. La principal ventaja de este ensayo sobre el método existente, al igual que los compañeros de equipo, es que cuantifica el comportamiento quimiotáctico en moscas individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas en neurobiología, como qué circuitos neurológicos son importantes para el comportamiento quimiotáctico y cómo estos circuitos neurológicos son moderados por el estado fisiológico interno del animal.

El objetivo de este método es obtener grandes conjuntos de datos de comportamiento en poco tiempo. Aunque este método nos ha dado información sobre el comportamiento de búsqueda de alimento, también se puede utilizar para estudiar otros comportamientos, como la localización de alimentos. La demostración visual de este método es fundamental.

El manejo adecuado de las moscas y la ejecución del software informático son esenciales para el éxito de este experimento. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener un poco de dificultad al principio porque se necesita algo de tiempo y paciencia para aprender a manejar las moscas con suavidad, lo que demuestra que el procedimiento será solo para la aguja. Póngase en contacto con un técnico de mi laboratorio antes de la recolección de moscas.

Cría las moscas experimentales en condiciones controladas de temperatura y humedad en un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas. El día de la explosión de la EEC, anestesiar las moscas bajo dióxido de carbono antes de sexarlas bajo un microscopio. Se pueden utilizar varios criterios básicos para diferenciar entre hombres y mujeres.

Los machos tienen un parche de cerdas negras en sus cuatro patas llamadas crestas sexuales que las hembras no tienen. Además, la punta del abdomen del macho está cubierta por una cutícula oscura y muestra genitales que no se ven en las hembras, recoja moscas hembras y colóquelas junto con cuatro o cinco machos de ojos blancos en nuevas limas de alimento con un máximo de 30 moscas por vial de edad. Las moscas durante dos a cinco días preparan las cámaras para la inanición de moscas empujando primero un solo pañuelo hasta el fondo de un frasco de plástico vacío, empapando completamente el tejido con agua destilada.

A continuación, utilice un objeto para empujar el pañuelo y exprima suavemente el exceso de agua. Invierta el vial para desechar el agua sobrante. Debe haber suficiente agua para mantener a las moscas hidratadas y la cámara de inanición húmeda, pero no lo suficiente como para ahogar a las moscas.

Aproximadamente de 18 a 24 horas antes de que comience el experimento, transfiera las moscas del frasco de comida a una cámara de inanición y tape el vial. Almacene los viales en condiciones controladas de temperatura y humedad durante la noche hasta que comience el experimento. Prepare una solución agro al 1% agregando 100 miligramos de aros a baja temperatura de fusión a 10 mililitros de agua destilada.

En un frasco de vidrio. Caliente la solución agrícola en un microondas hasta que comience a hervir, pero antes de que hierva, detenga el microondas y agite el matraz una vez. Repite este paso dos veces más hasta que el aros se haya disuelto por completo.

Mantenga la solución de Aros en estado líquido manteniendo el matraz caliente en una placa caliente. Ajustado a 50 grados centígrados, agregue 990 microlitros de la solución de aro al 1% y 10 microlitros de vinagre de sidra de manzana a un tubo de radiogoniometría invertido de 1,5 mililitros. Para hacer una solución de vinagre de sidra de manzana al 1%, agite la solución hasta que se mezcle antes de colocarla en una incubadora de baño seco configurada a 50 grados centígrados, configure la sala de pruebas en las condiciones deseadas, como temperatura y humedad.

Encienda el panel LED de 660 nanómetros. Enjuague los tamices y las placas de prueba con agua caliente y caliéntelos en un horno de secado hasta que se evapore toda la humedad. Fresco. Los tamices y las placas hasta la temperatura de la sala de pruebas.

Antes de comenzar los experimentos, coloque un plato poco profundo encima de la placa difusora y llénelo con agua para aumentar la humedad local y enmascarar el agua en la gota de aros. Finalmente, coloque los tamices sobre el plato de agua. La placa de prueba está hecha de acrílico transparente y consta de seis arenas de prueba.

Un deslizador contiene cámaras de retención que permiten la carga de moscas, la contención temporal y la liberación simultánea de seis moscas en sus respectivas cámaras. Al comienzo del experimento, los puntos de mira grabados en el centro de cada arena en la placa indican que los odorantes deben pipetearse. Inserte los deslizadores en la placa de prueba acrílica.

Deslice suavemente el aspirador en el vial más allá del tapón de algodón y permita que unas seis moscas entren en el aspirador. Es fundamental ser lo más amable posible al manipularlos. Se puede aprovechar la táctica fotográfica, el comportamiento de las moscas para inducir moscas, para caminar hacia el aspirador apuntando la abertura del vial hacia una fuente de luz tenue.

Si es necesario, se puede aplicar una succión suave para aspirar aproximadamente seis moscas hembra. Evite seleccionar moscas macho de ojos blancos. Inserte la punta del aspirador en el primer orificio de la placa de prueba.

Permita que una sola mosca pase a la celda de retención y avance suavemente el deslizador hacia adelante para cargar otra mosca en el siguiente orificio. Continúe hasta que las moscas. Ocupa las seis celdas de retención del plato.

A continuación, pipetee cinco microlitros de una solución de vinagre de sidra de manzana al 1% directamente en el centro del punto de mira en la cara interior de la placa de prueba. Para centrar la placa de prueba, abra el archivo llamado Herramienta de posicionamiento vi. Ejecute el archivo haciendo clic en la flecha blanca en la esquina superior izquierda de la pantalla.

Coloque la placa de prueba en la parte superior del sib de manera que la abertura de la arena mire hacia el piso del SIV y el objetivo de olor esté en el techo de la placa. Alinee los puntos de mira de la placa de prueba con los aires cruzados en la pantalla del monitor cuando se haya completado la alineación. Aborte la ejecución haciendo clic en el punto rojo ubicado cerca de la esquina superior izquierda del monitor para rastrear y registrar las coordenadas de la mosca.

Durante cada prueba de búsqueda de alimentos, abra el archivo del software de adquisición. Seguimiento de moscas seis vi. Ejecute el archivo haciendo clic en la flecha blanca en la esquina superior izquierda del monitor.

Asigne un nombre al archivo y, a continuación, haga clic en Aceptar. Avanza los deslizadores en las cámaras de prueba para liberar las moscas en las arenas de prueba. Tenga cuidado de no mover las cámaras de prueba, ya que esto conducirá a un registro incorrecto de las coordenadas.

Haga clic en iniciar y asegúrese de que la única fuente de luz en la cámara de prueba sea el panel LED. Una vez finalizado el ensayo, retire el tamiz y la cámara de comportamiento. Levante la placa de prueba del tamiz y elimine las moscas sumergiendo la placa en hielo.

Limpie suavemente la placa con agua caliente y elimine cualquier residuo de agros. Coloque las placas de prueba en un horno de secado para eliminar la humedad. Ventile el área de prueba encendiendo un pequeño ventilador durante aproximadamente dos minutos.

Apague el ventilador y cargue el siguiente grupo de moscas en la siguiente placa de prueba. Proceda a realizar el análisis de datos utilizando un software personalizado como se describe en el protocolo de texto. El software de análisis de datos y el diseño se utilizan para evaluar el rendimiento de cada mosca durante su prueba de 10 minutos de acuerdo con un conjunto de criterios de análisis.

Estos criterios se utilizan para determinar si los datos de cada mosca se utilizarán para el análisis de datos y están diseñados para eliminar aquellas moscas que no pueden realizar la tarea de búsqueda de alimentos debido a una lesión, enfermedad, estrés o falta de motivación, las moscas que están inactivas durante más de 300 segundos se consideran inactivas y se rechazan del conjunto de datos a menos que ya hayan logrado localizar la fuente de alimento o la exhibición. Una velocidad promedio superior a 10 milímetros por segundo durante al menos 100 segundos después del período de inactividad para seleccionar solo aquellas moscas que exhiben velocidades saludables durante las primeras etapas del olor activo. Solo se aceptan las moscas de búsqueda que se mueven dentro de un cierto rango de velocidades durante los primeros 50 segundos de la prueba, para el análisis de datos, se rechazan las moscas que no se mueven a través de los cuatro cuadrantes de la arena y se dirigen directamente a la fuente de alimento después de que comienza la prueba.

Se considera que las moscas que se acercan y se alejan de la fuente de alimento dentro de un radio de 10 milímetros durante un mínimo de 50 segundos han encontrado con éxito la fuente de alimento. El gráfico que representa la distancia de la mosca desde la fuente de olor a lo largo del tiempo se puede utilizar para evaluar este raro caso: arenas con artefactos visibles en posición de mosca. También se rechazan las trazas.

Los artefactos pueden ser creados por cualquier evento en el que el software de adquisición de datos detecte un objeto que no sea la mosca. A menudo aparecen como largas líneas rectas que se extienden a través de la arena o irradian desde su centro. Las moscas adultas hambrientas de 18 a 24 horas exhiben una mayor sensibilidad olfativa a los olores relacionados con los alimentos que sus contrapartes alimentadas.

Un gráfico del porcentaje acumulado de moscas que localizan con éxito una fuente de olor a comida muestra que el 30% de todas las moscas hambrientas tienen éxito en un período de 10 minutos. En contraste, solo el 7% de todas las moscas alimentadas lo hacen. Las moscas hambrientas deberían exhibir una atracción significativamente mayor por el vinagre que por un vehículo agrícola solo, y esta observación se puede utilizar para solucionar problemas en las condiciones de prueba.

Por ejemplo, cuando este experimento de búsqueda de alimentos se realizó a 32 grados centígrados con una humedad ambiental del 35% utilizando moscas de tipo silvestre, no se detectó ninguna diferencia significativa entre la atracción de las moscas al vinagre y el control de aros, esto probablemente se deba a una creciente atracción por el agua que se encuentra en la gota de agros a temperaturas de prueba más cálidas. Al aumentar la humedad de la prueba entre el 50 y el 60%, se corrigió este cambio de comportamiento y se restableció la diferencia significativa entre la atracción por el vinagre y el vehículo agropecuario. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 12 años, incluyendo la prueba experimental de 10 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las moscas con mucho cuidado para evitar lastimarlas o molestarlas. Recuerde que las placas de prueba y los tamices pueden estar extremadamente calientes cuando están en el horno de secado y, por lo tanto, deben retirarse mientras se usan guantes de cocina después de su revelado. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploraran los comportamientos quimiotácticos.

Esta técnica también se puede adaptar para estudiar la capacidad de la mosca para localizar otros objetos olores. Por ejemplo, se puede aplicar al estudio del comportamiento de localización de pareja en moscas macho. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo prepararse para el experimento, ajustar las condiciones experimentales, ejecutar el experimento y analizar el rendimiento de cada mosca, lo que en última instancia le proporcionará un gráfico acumulativo que muestra el porcentaje de moscas que han localizado con éxito la fuente de olor.