Name: Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a cultivar embriones de ratón en un sistema sin suero oxigenado para estudiar el desarrollo embrionario. Este método permite manipular el desarrollo manteniendo la viabilidad y evitando componentes desconocidos del suero.

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Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Julie Gordon y el Dr. Nancy Manley por sus consejos útiles con la técnica de cultivo. Este trabajo ha sido apoyado por la Fundación del Niño Glaucoma y Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.

Ratón cultivo de embriones: Todos los procedimientos experimentales se realizaron en estricto acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud siguiendo el protocolo # A2010 07-119, el cual fue revisado y aprobado por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión, que mantiene continua supervisión regulatoria. 1. Preparación de medios de cultivo <ol><li> Preparar medio de cultivo utilizando los medios de comunicación y suplementos de células madre disponibles en el mercado en las siguientes cantidades: Maravilla DMEM, Reemplazo golpe de gracia suero (KSR) (10%), N-2 del Suplemento (1x), Albúmina de Suero Bovino (2%), penicilina ( 50 UI / ml), estreptomicina (50 mg / ml) y anfotericina-B (1,25 g / ml). El medio de cultivo preparado es similar a la descrita previamente 15 con los siguientes cambios: la adición de antimicóticos y usando dos veces la concentración de antibióticos (para los detalles de los reactivos y equipos específicos, ver Liº de Materiales). Nota: La concentración de los antibióticos que se utilizó anteriormente (. Moore-Scott, et al 15) fue suficiente para los cultivos de embriones llevaron hasta un 24 período de tiempo hr. Sin embargo, cuando se continuó la cultura más allá de las 24 horas, experimentamos contaminación del cultivo y esto fue controlado con éxito por la duplicación de la concentración del antibiótico. </li><li> Guarde los componentes de los medios a 4 º C o a -20 ° C según las recomendaciones del fabricante. KSR y N-2 Suplemento deben almacenarse en alícuotas a -20 ° C para evitar los ciclos de congelación y descongelación. Golpe de gracia DMEM una vez abierto debe ser utilizada dentro de 30 días de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Antes de su uso, calentar los componentes en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Preparar los medios de comunicación en condiciones estériles. Desinfectar la superficie de todo el equipo y las botellas que contienen los componentes de los medios con un 70% de rociado de alcohol antes de colocarlos en la campana de cultivo. </li><li> Los componentes de medios se pueden mezclar ya sea en un vaso de precipitados estéril o directamente en el sistema de filtro (Corning). Primero se debe agregar el polvo de albúmina para el golpe de gracia DMEM. Mezclar bien agitando suavemente hasta que la albúmina se disuelva completamente. A continuación, añadir el suplemento N-2, KSR y los antibióticos y mezclar bien usando una pipeta. Luego filtrar esterilizar los medios de comunicación utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 micras con succión de vacío. Distribuir el medio en 50 ml tubos cónicos y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Los medios de comunicación, una vez preparadas se deben usar dentro de 4-5 días para la cultura. </li></ol> 2. Preparación del Equipo de Cultura <ol><li> Esterilizar los frascos de cultivo de vidrio y tapones de goma. Envuelva las botellas de cultivo en una lámina de aluminio y los tapones de goma en un vaso de agua y esterilizar en autoclave. </li><li> Esterilizar la cámara de cultivo (unidad de precisión Incubadora) con 70% de pulverización de alcohol y se calienta a 37 ° C antes de comenzar la cultura. La cámara de cultivo es equipped con un disco de rodadura en el centro que sostiene los frascos de cultivo. El flujo de gas en la cámara está regulada por un medidor de presión y la velocidad de flujo se puede ajustar mediante la observación del flujo de salida de burbujas de aire a través del agua en un tubo de vidrio en el extremo. Este aparato de cultivo botella rodando es una versión modificada del aparato original introducidos por Nueva Cockroft y 17. </li><li> Conectar un cilindro de gas que contiene una mezcla de gases de 95% de O2 / 5% de CO 2 a la cámara de cultivo y ajustar el flujo de gas a &quot;una burbuja de aire por segundo&quot; que da una velocidad de flujo de 50 cc / min y asegura el suministro de oxígeno adecuado para los embriones de cultivo. </li></ol> 3. Embrión de ratón Recogida y preparación para la Cultura <ol><li> Para obtener embriones de ratón de tipo salvaje, hemos utilizado ratones de C57BL/6J y CD-1 (Charles River Laboratories) cepas fondo genético. </li><li> Compruebe los ratones hembra para tapones vaginales cada mañana los días. El mediodía del día de encontrar the tapón vaginal debe ser considerado como E0.5 dpc (días post coito). </li><li> Recoger los embriones de ratón en E10.5 dpc por la eutanasia de los ratones embarazadas siguiendo protocolos estándar. Los ratones fueron sacrificados utilizando un dispositivo de inhalación de CO 2 según lo especificado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) Directrices para la Eutanasia de los Animales (2013). Para asegurarse de la muerte, la dislocación cervical se realizó después de la exposición al CO 2. </li><li> Pulverizar etanol al 70% en la superficie ventral abdominal para evitar que se pegue de pelo abdominal para los instrumentos. A continuación, abra la cavidad abdominal ventral utilizando un afiladas tijeras contundente de operación y un par de 4-3/4 en microdissecting fórceps para localizar el útero. El uso de un 4 en fórceps microdissecting levantar todo el útero y la separan del cuerpo mediante el corte con una luz de tijeras de funcionamiento en el cuerpo uterino y en las puntas de los cuernos uterinos. </li><li> Enjuagar rápidamente todo el útero en 1x PBS calentó a 37 ° Cpara eliminar cualquier adherencia de sangre hacia el útero y colocar inmediatamente en DMEM calentó a 37 ° C en una placa de Petri. Esterilice los instrumentos en un 70% de pulverización de etanol antes de su uso posterior. Nota: se recomienda el precalentamiento de la soluciones incluyendo la PBS, DMEM y el medio de cultivo y manteniéndolas a 37 ° C durante todo el procedimiento. </li><li> Bajo un microscopio de disección, el útero debe segmentariamente disecado con una luz de tijeras de funcionamiento. Esto da lugar a pequeñas aberturas en cada lado del útero segmentado a través del cual un par de pinzas microdissecting modificados (extremos romos) se puede insertar suavemente para ensanchar la abertura. Esto permite la exposición de la decidua de la placenta, que luego se puede quitar rasgando suavemente con un par de pinzas microdissecting para exponer el saco vitelino parietal (PYS) con la membrana de Reichert. El uso de uno de los bordes de las pinzas perforar suavemente la membrana de Reichert junto con los PYS y separada de la ªe subyacente saco vitelino visceral (VYS) capa para exponer los embriones con VYS intactas. El cono ectoplacentario y los derivados trofoectodermo se pueden eliminar ya sea con la decidua placentaria o con la membrana de Reichert. Se debe tener cuidado para evitar la ruptura de la VYS como los embriones se salgan inmediatamente. </li><li> Los embriones con VYS intactos deben ser transferidos a una placa de Petri que contiene el medio de cultivo se calentó a 37 ° C utilizando una pipeta de transferencia de plástico. Nota: Traslado al medio de cultivo inmediatamente después de la separación del útero ayuda para un mejor desarrollo del embrión en la cultura. </li><li> Una pequeña abertura se debe hacer en el saco vitelino con un par de pinzas microdissecting evitando los vasos sanguíneos principales. Un fuerte par de pinzas se puede utilizar para hacer la abertura por la perforación suavemente en un área adyacente a la región de la cabeza. Alternativamente dos pares de pinzas romas pueden ser usados ​​para sostener el saco vitelino y suavemente romper para hacer una pequeña abertura.Luego ampliar suavemente la abertura mediante la ampliación con las pinzas a un tamaño lo suficiente para que la cabeza embrionaria. La membrana amniótica que está terminando de cerca el embrión se celebrara suavemente lejos del cuerpo y desgarrado utilizando un par de pinzas. La cabeza embrionario y después todo el embrión se deben exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la integridad de la vasculatura embrionaria con la de la yema de salida 15. Nota: Cualquier daño a la vasculatura del saco vitelino puede afectar potencialmente el desarrollo del embrión en el cultivo. Tales embriones con vasculatura dañada no deben utilizarse para la cultura y pueden ser utilizados para la organización de los embriones que luego pueden ser descartados. </li><li> Criterios de estadificación embrionarias: Examine los embriones bajo el microscopio de disección y agrupar por criterios morfológicos, incluyendo el cuerpo y el tamaño de la cabeza, las extremidades y la morfología de los ojos y el escenario contando el número de somitas (s) durante al menos dos embriones de cada grupo. &lt;strong&gt; Nota: Por lo general, los embriones obtenidos a partir de la misma camada muestran diferencias en el desarrollo en el útero y se diferencian en el tamaño corporal, características morfológicas y número de somitas. Sin embargo, se encontró que los embriones agrupados por nuestros criterios morfológicos generalmente exhiben número somite similares (± 1). Por esta razón, no es necesario contar somitas para cada embrión ya que esto sería retrasar el tiempo para el inicio de la cultura. Nota: No utilizar los embriones que se utilizaron para contar los somitas para la cultura. Contar las somitas después de comenzar el cultivo durante otros embriones con el fin de evitar el retardo de tiempo en el inicio de la cultura. Los embriones que se retrasaron a la cultura después de la separación del útero por lo general presentan un escaso desarrollo. </li><li> La transferencia de los embriones de inmediato a una placa de Petri con medio de cultivo fresco calentado a 37 ° C y llevarlo a la campana de cultivo, donde los embriones de nuevo deben ser transferidos a una placa de Petri con cultur estérilmedios electrónicos antes de ponerlos en los frascos de cultivo con medio para iniciar el cultivo. Nota: Las múltiples transferencias de medios de comunicación para los embriones antes de la cultura ayuda en la prevención de la contaminación como los diferentes pasos de recogida de embriones y la disección se realizaron bajo un microscopio de disección que no fue instalado en la campana de cultivo. Nota: Cuando el tamaño de la camada es grande (&gt; 12 embriones), proceso de la mitad de los embriones y comenzar la cultura o los puso en un plato con medio de cultivo y colocarlo en una incubadora de CO 2 a 37 ° C. Cuando los embriones fueron dejados afuera por períodos más largos (&gt; 35 a 40 min) observamos los latidos del corazón para reducir la velocidad y esto afectará el desarrollo posterior en la cultura. </li></ol> 4. El cultivo de embriones de ratón <ol><li> Abra los frascos de cultivo en autoclave en la campana de cultivo y adecuadamente etiquetarlos. Transferencia de 3 ml de medio de cultivo se calentó a 37 ° C a cada uno de tas botellas y luego los embriones de ratón se deben transferir suavemente en los frascos de cultivo utilizando pipetas de transferencia de plástico estériles. Los frascos de cultivo deben entonces ser tapados con tapones de goma que ayudan a mantener las botellas de cultivo para el disco móvil en el aparato de cultivo. Nota: Los frascos de cultivo con los medios de comunicación se pueden preparar y se colocan en el disco de rodadura del aparato de cultivo antes de la eutanasia de los ratones. Esto acorta el tiempo para la transferencia de embriones en los frascos de cultivo. Nota: Los embriones de ratón se pueden cultivar de forma individual o como cocultivos con dos o tres embriones en la misma botella de cultivo. </li><li> Los frascos de cultivo deben realizarse asépticamente al aparato de cultivo a 37 ° C y herméticamente ellos enganchan en los agujeros en el disco de rodadura con los tapones de goma. Encienda el disco de rodadura para girar a una velocidad constante de 35 revoluciones por minuto (rpm), que permite la flotación libre de la EMBRyos en los medios de comunicación y también ayuda en el intercambio de gases liberados por el tejido embrionario. El gas desde el cilindro conectado a la cámara de cultivo fluye a través del disco de rodadura y los tapones de goma en los frascos de cultivo. </li><li> Cultura de los embriones para 16-40 horas y regularmente comprueban para la salida del gas y la temperatura de la cámara de cultivo. Nota: la manipulación de embriones de ratón en cultivo: Dejad que los embriones consiguen adaptarse a las condiciones de cultivo durante al menos 30 min. Luego los embriones que funcionan mal y que muestra los latidos del corazón débiles pueden ser descartados y los embriones restantes pueden ser utilizados para estudios posteriores de manipulación. Manipulaciones de embriones, tales como 5,9,16 electroporación, microinyección 18, la implantación de bolas 16, el tratamiento de drogas y otros procedimientos se pueden realizar en este momento. Se realizó con éxito la implantación de bolas de agarosa afi-gel tratados con ciertas moléculas de señalización para estudiar su papel en el desarrollo del ojo antes de tiempo. Los embriones después demanipulaciones pueden ser devueltos de nuevo en un medio fresco y continuaron en la cultura. </li><li> Vuelva a colocar los medios de cultivo totalmente con medio fresco a intervalos específicos después de 9-10 horas y 18-19 horas de cultivo en que se continuó el cultivo durante 40 h. Nota: Cultura reemplazo de medios puede no ser necesaria si la cultura es detenido por 16-18 horas. </li><li> Medidas de éxito en la cultura: la supervivencia embrionaria en la cultura debe ser determinado por los latidos del corazón visible y la circulación sanguínea en el cuerpo, mientras que el crecimiento embrionario en la cultura debe ser evaluado por un aumento en el tamaño corporal, el número de somitas y el desarrollo morfológico de la cabeza, las extremidades, el corazón y los ojos. </li><li> En el útero desarrollado embriones en E11.0 dpc (~ 40-41 s) y E12.0 dpc (~ 49-50 s) se debe utilizar como controles para la comparación de los embriones cultivados durante 16-18 horas y 38-40 horas, respectivamente. </li><li> El desarrollo embrionario en diferentes momentos durante el cultivo y para en etapas útero puede CAPTureD bajo microscopio de disección. Software de imágenes al contado se utilizó para capturar las imágenes y luego procesados ​​en el programa de procesamiento de imágenes. </li></ol>

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Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C. El desarrollo del embrión fuera del útero era críticamente dependientes de varios factores en cada paso durante el procedimiento desde el momento en el útero se aisló a partir de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura (Figura 1). El factor más importante que influyó en ...

In vitro, utilizando métodos de cultivo de embriones en su conjunto son muy adecuados para estudiar los mecanismos involucrados en la organogénesis embrionaria que son difíciles de acceder en el útero de señalización. Embriones enteros proporcionan la integridad de los tejidos y el apoyo adecuados para las interacciones de tejidos que son cruciales para la aparición oportuna de los mecanismos esenciales de señalización para diferentes procesos celulares durante la organogénesis. Mientras que los cultivos de embriones enteros proporcionan una plataforma para una gran cantidad de aplicaciones, tales como estudios de trasplante, las manipulaciones genéticas y de tejidos, estudios de implantación del grano, los estudios toxicológicos, etc., Los sistemas de cultivo de embriones utilizados actualmente son principalmente dependientes de suero para el crecimiento y mantenimiento de los embriones en la cultura de 1-9. El suero se ha utilizado como uno de los principales componentes que van desde 10-100% de los medios de cultivo 6-8, 10, 11.; Sin embargo, la composición de suero no está bien definida y puede variar de animal a animal y cada vez que se recogió el suero. Si bien la preparación de laboratorio de suero es mucho tiempo e implica procedimientos estrictos, suero adquirido comercialmente exhibe una gran variabilidad entre los distintos lotes y aumenta los costes de experimentación. Sumado a esto, el suero puede contener factores desconocidos, tales como factores de crecimiento, hormonas u otras proteínas, que pueden afectar potencialmente el resultado de ciertos experimentos, especialmente aquellos que involucran el estudio de las moléculas de señalización importantes en las interacciones de tejidos. Los estudios han demostrado que la adición de suero a la cultura puede potencialmente alterar los niveles intracelulares de ciertas moléculas de señalización tales como monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y de las proteínas implicadas en la señalización mitogénica y la fosfoinositida 3 (PI-3)-quinasa vías de señalización 12-14. Contrariamente a esto, un sistema de cultivo libre de suero proporciona las ventajas de ambiente libre de antígenos,abstinencia de enzimas biológicamente activas que pueden alterar los procesos celulares y permite la coherencia entre experimentos. En el presente estudio, se utilizó un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado a la cultura de la etapa de mediados de la gestación de embriones enteros en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C 15,16. Los embriones de ratón cultivados durante 16 a 40 h bajo estas condiciones definidas exhiben la progresión en el desarrollo morfológico de cuerpo y diferentes estructuras embrionarias generales tales como el corazón, las extremidades, el cerebro y los ojos que indica los niveles apropiados de la proliferación celular, la migración, la diferenciación y las interacciones de tejido. El análisis molecular del desarrollo embrionario en el cultivo para uno de los sistemas de órganos complejos como el ojo reveló el desarrollo ocular para ser consistente con la observada en el tejido ocular en EMBRyos en desarrollo en el útero (Kalaskar y Lauderdale, en preparación). Por lo tanto nos muestran que los embriones de ratón en cultivo en la etapa mitad de la gestación, exhiben crecimiento progresivo y el desarrollo morfológico comparable a la observada en los embriones en desarrollo en el útero.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Reemplazo</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stock: 100x</td></tr><tr><td>Albúmina, de Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Stock: 100%</td></tr><tr><td>Antibiótico - Solución Antimicótica</td><td>Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td>Stock: Penicilina (10.000 UI/ml); Estreptomicina (10.000 y micro; g/ml; Anfotericina (250 y micro; g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp; &nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de incubadora de precisión</td><td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge, Inglaterra</td><td>Id.No. 840-374</td><td></td></tr><tr><td>botellas de vidrio para unidad giratoria</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicona Rubber Cork</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 cilindro</td><td>AirGas Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección Stemi SV11 Apo Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora con camisa</td><td>de agua Forma</td><td>Scientific Modelo: 3110</td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo</td><td>Cabinas de seguridad biológica Nuaire Clase II TipoA2</td><td>Modelo: Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>Balanza de pesaje IsoTemp205</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>AG285</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 50 ml</td><td>Tijeras de operación ligeras Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de operación</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de operación afiladas-romas&nbsp;</td>Pinzas de microdisección <td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr>, <tr><td>4 pulgadas</td><td>Pinzas</td> de microdisección <td>Roboz RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>- Hudson (cWALD), 4-3/4 pulgadas</td> Pinzas de microdisección <td>Roboz</td><td>RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>(5/45)</td><td>Roboz</td><td>RS-5005</td><td>Modificado - Las puntas afiladas se hicieron romas</td></tr><tr><td>Pinzas de microdisección (5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5060</td><td>Modificado - Las puntas afiladas se hicieron romas</td></tr><tr><td>Pinzas de microdisección (55)</td><td>Roboz</td><td>RS-5063</td><td>Modificado - Las puntas afiladas se hicieron romas</td></tr><tr><td>Bandeja de instrumentos</td><td>Roboz</td><td>RT-1401S</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de la bandeja de instrumentos</td><td>Roboz</td><td>RT-1401L</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri-100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>087571Z</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri-60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri-35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtro ( 0.22 y micro; m Acetato de celulosa)-150 ml</td> Sistema <td>de filtro Corning</td><td>431153</td><td></td></tr><tr><td>(0,22 y micro; m Acetato de celulosa)-250 ml</td> Sistema <td>de filtro Corning</td><td>430756</td><td></td></tr><tr><td>(0,22 y micro; m Acetato de celulosa)-500 ml</td><td>Pipeta Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>D57849</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica-10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica desechable-25 ml</td><td>Pipeta de transferencia Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>- 7,7 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>202-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron utilizando un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado en un sistema de cultivo de botella de laminación oxigenada. Los embriones de ratón en E10.5 fueron cuidadosamente aislados del útero con saco vitelino intacto y en un proceso que implica la maniobra quirúrgica precisa los embriones se exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la continuidad vascular del embrión con el saco vitelino. En comparación con los embriones preparados con saco vitelino intacto o con el saco vitelino se eliminan, estos embriones exhiben tasa de supervivencia superior y la progresión del desarrollo cuando se cultivan en condiciones similares. Se demuestra que estos embriones de ratón, cuando se cultivan en un medio definido en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C durante 16-40 horas, muestran un crecimiento y desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero. Creemos thes el método será útil para los investigadores que necesitan para utilizar el cultivo de embriones conjunto para estudiar las interacciones de señalización importantes en la organogénesis embrionaria.

Desarrollo de embriones de ratón depende fuera del útero de múltiples factores a partir de la hora del útero está aislado del cuerpo a la vez que los embriones se cultivan. Como se representa en la Figura 1, el procedimiento implica una serie de etapas que incluyen, la separación del útero grávido del cuerpo (Figura 1A), el aislamiento de los embriones con saco vitelino intacta (Figura 1B), exteriorización de los embriones desde el saco vitelino ( Figur...

El suero utilizado en los cultivos de embriones contiene componentes desconocidos que pueden afectar el resultado de los experimentos sobre todo en los estudios que involucran interacciones de señalización. Aquí hemos utilizado un sistema de cultivo oxigenada libre de suero y mostramos que los embriones mitad de la gestación de ratón en cultivo de 16-40 horas exhiben desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero.

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un sistema de cultivo oxigenado libre de suero para estudiar y manipular aspectos específicos del desarrollo embrionario del ratón. Esto se logra aislando primero el útero con embriones de la madre ratón. El segundo paso es separar los embriones con un saco vitelino intacto de la decidua placentaria después de la disección segmentaria del útero.A continuación, los embriones deben exteriorizarse suavemente del saco vitelino mientras se mantiene la integridad de la vasculatura embrionaria. El paso final es cultivar los embriones en un aparato de cultivo con biberón rodante oxigenado sin suero a 37 grados centígrados durante un período de tiempo específico. En última instancia, todo este sistema de cultivo de embriones, que apoya el desarrollo de diferentes estructuras tanto a nivel morfológico como molecular, se puede utilizar para el estudio del desarrollo de embriones de ratón utilizando una variedad de técnicas.Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como el papel de diferentes mecanismos de señalización en la especificación del sulfato y la morfogénesis tisular en el embrión de mamífero en desarrollo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el aislamiento de embriones con un saco vitelino intacto y los pasos de ización posteriores o difíciles de aprender, cualquier daño en la vasculatura embrionaria o en la vasculatura osac puede afectar el desarrollo del embrión en el cultivo. Para comenzar, desinfecte todas las superficies de trabajo con alcohol al 70% y rocíe cada artículo antes de colocarlo en la campana de cultivo.Cuando esté listo, prepare el medio de cultivo y todos los suplementos necesarios para el procedimiento. Primero, agregue el polvo de albúmina al DMEM knockout y mezcle bien hasta que se disuelva por completo. A continuación, agregue el suplemento N two, KSR, y los antibióticos se mezclan bien y filtran la esterilización. Guarde los medios en tubos cónicos de 50 mililitros a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para usar Antes de comenzar la disección, precaliente las soluciones necesarias a 37 grados centígrados y manténgalas calientes durante todo el procedimiento.En este punto, las botellas de cultivo también deben prepararse y colocarse en el aparato de cultivo para pregasificarlas y mantenerlas a 37 grados centígrados. Esto también ahorrará tiempo en la transferencia de los embriones más adelante. Para comenzar, coloque el animal sacrificado sobre una superficie de trabajo estéril y rocíe la superficie abdominal ventral con etanol.Para evitar que el pelo se pegue a los instrumentos, abra la cavidad abdominal para localizar el útero. Levante el útero con fórceps y use tijeras ligeras para cortar el cuerpo uterino y las puntas de los cuernos uterinos. Para separarlo rápidamente, enjuague todo el útero con PBS tibio para eliminar la sangre e inmediatamente colóquelo en una placa de Petri llena de DMEM tibio.Esterilizar los instrumentos con etanol al 70% Antes de proceder bajo un microscopio de disección, diseccione segmentariamente el útero con tijeras de operación ligeras para producir pequeñas aberturas a ambos lados. Inserte suavemente un par de pinzas de microdisección romas para ensanchar la abertura con la placenta decidua expuesta. Rasgue suavemente con un par de pinzas de microdisección para exponer el saco vitelino parietal con la membrana del riker.Use un borde de las pinzas para perforar suavemente ambos y separarlos del saco vitelino visceral subyacente para exponer los embriones. Con intactos, los sacos vitelinos viscerales deben transferirse inmediatamente a un medio de cultivo tibio después de la separación del útero. Para ayudar en el desarrollo del embrión en cultivo, haga una pequeña abertura en el saco vitelino con un par de pinzas afiladas perforando suavemente en un área adyacente a la región de la cabeza, teniendo cuidado de evitar los vasos sanguíneos principales.Alternativamente, se pueden usar dos pares de pinzas romas para sujetar el saco vitelino y rasgar suavemente para hacer una pequeña abertura. Expanda la abertura con las pinzas hasta un tamaño suficiente para que quepa la cabeza del embrión. Sostenga la membrana amniótica, envolviendo el embrión suavemente lejos del cuerpo y rasguíelo con un par de pinzas, la cabeza del embrión, y luego todo el embrión debe exteriorizarse suavemente del saco vitelino mientras se mantiene la integridad de la vasculatura embrionaria.Cualquier daño en la vasculatura del saco vitelino puede afectar el desarrollo y dichos embriones no deben usarse para el cultivo. A continuación, examine los embriones y agrúpelos según criterios morfológicos, incluyendo el tamaño del cuerpo y la cabeza, la morfología de las extremidades y los ojos. Escenificalos contando el número de somitas.Transfiera los embriones inmediatamente a una placa de Petri con medio de cultivo fresco y caliente, y llévelo a la campana de cultivo donde los embriones deben transferirse nuevamente a una placa de Petri Con medios de cultivo estériles trabajando en la campana de cultivo, use una pipeta de plástico estéril para insertar un embrión de ratón en cada frasco preparado anteriormente. A continuación, lleve los frascos de cultivo de forma aséptica al aparato de cultivo. Asegúrelos al disco rodante y encienda la rotación.Esto permite que los embriones floten libremente en el medio y también ayuda con el libre intercambio de gases. El gas fluye desde un cilindro cercano a la cámara y luego a las botellas a través del cultivo de corcho de caucho. Los embriones durante 16 a 40 horas y comprueban regularmente el flujo de salida de gas y la temperatura de la cámara de cultivo.Los medios de cultivo deben ser reemplazados completamente por medios nuevos en intervalos de tiempo específicos. Es mejor dejar que los embriones se adapten a las condiciones de cultivo durante al menos 30 minutos antes de realizar cualquier manipulación. Los embriones que tienen un rendimiento deficiente y muestran latidos cardíacos débiles se pueden descartar, y los embriones restantes que muestran buenos latidos cardíacos se pueden utilizar para estudios adicionales. Estas imágenes demuestran que los embriones en cultivo se replican en el desarrollo utero.Alrededor del 58% de los embriones cultivados presentan un desarrollo comparable al de los embriones desarrollados en el útero. Se observa un desarrollo intermedio en aproximadamente el 28% de los embriones C y el 14% de los embriones muestran un desarrollo pobre en cultivo D. Las diferencias de desarrollo ocurren cuando los embriones de ratón son embriones cocultivados que parecen similares al comienzo del cocultivo A y B muestran diferencias en su desarrollo embrionario. A las 16 horas, una vez dominada la A y B, esta técnica se puede realizar en 25 a 30 minutos para un tamaño posterior de 10 a 12 embriones.Hemos descubierto que este sistema de cultivo de embriones es una valiosa adición a nuestros estudios envivo del desarrollo embrionario.

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