Name: Medición de calcio total en neuronas por Sonda de Electrones X-ray microanálisis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a medir calcio total en neuronas cultivadas mediante microanálisis con sonda de electrones EPMA. Esta técnica de criomicroscopía analítica permite cuantificar concentraciones elementales con resolución subcelular en mitocondrias.

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Nos gustaría dar las gracias a la Sra. Christine A. Winters por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Neurociencia Básica del Programa de Investigación Intramural NINDS, NIH (Z01 NS002610).

El método descrito aquí se ha desarrollado utilizando instrumentos específicos, herramientas y software. Debido a que los laboratorios no va a utilizar la misma configuración experimental del enfoque es generalizado en lo posible. 1. Congelación Rápida El método analítico que se describe es absolutamente dependiente de enfoques criogénicos para: 1) el &quot;criofijación&quot; de las células o tejidos de una manera que preserva cuantitativamente la distribución de los componentes del tejido difusibles y elementos químicos como lo fueron en células vivas en el instante de la congelación , y 2) la preparación de ultrafina cryosections adecuado para formación de imágenes y análisis en un TEM. Estas técnicas se describen brevemente a continuación, pero los detalles necesarios para reproducir estos procedimientos en otros laboratorios están más allá del alcance de este artículo. Los lectores interesados ​​se denominan excelentes artículos recientes 9,14. Atención: En esta sección se describe el uso del jabón letano efied, que es altamente inflamable y potencialmente explosivo; se deben tomar las precauciones adecuadas. Operador también debe estar familiarizado con nitrógeno líquido (LN 2) las precauciones de seguridad, incluyendo la capa protectora de laboratorio, gafas y guantes cryoresistant. Nota: Aquí y en todas partes, todas las herramientas (pinzas, etc) que se utilizan para manejar muestras congeladas deben refrigerarse en LN 2 antes de su uso para evitar la descongelación accidental. Las células cultivadas sobre cubreobjetos <ol><li> Prepare un dispositivo de congelación de inmersión por condensación de etano gaseoso a -160 ° C en la LN 2 refrigerado por pocillo central. Llenar hasta la marca y tapar el pozo con la tapa basculante de aluminio cuando no esté en uso. </li><li> El uso de cuñas de papel de filtro, seque cubreobjetos de plástico de células cultivadas bajo condiciones apropiadas experimentalmente a una fina película acuosa. Seque desde el borde a fin de evitar el contacto con el tejido, la película residual ideal, determinado por ensayo y error, es tan delgada como sea posible pero sin then cuanto a evaporarse y permitir el secado de la superficie del tejido. </li><li> Sosteniendo el cubreobjetos por el borde con una pinza de sujeción, sumerja rápidamente en etano líquido, ya sea manualmente o utilizando el émbolo gravedad-alimentado. </li><li> Coloque el cubreobjetos congelado en un recipiente de espuma de poliestireno en las inmediaciones de LN 2, lo suficientemente grande para manipular el número deseado de cubreobjetos en recipientes de almacenamiento a largo plazo. Se recomiendan las latas con tapón de rosca de aluminio que no se aprovechan bajo LN 2. </li></ol> La congelación rápida de rodajas de cerebro cultivadas <ol start="5"><li> Bajo un microscopio de disección, ver y orientar una rebanada del hipocampo organotípicos, sin molestias y todavía unido a la inserción de la membrana cultura. Coloque los puntos de referencia en la membrana cerca del borde de la rebanada con un tipo Sharpie negro pluma y fotografía. </li><li> Todavía bajo el microscopio, cortar aprox. 5 x 5 mm cuadrados de membrana con cortes individuales centradas en las plazas. Evite tocar la rebanada o doblar el membrane. </li><li> Montar un trozo de membrana soportada, amortiguado por un ¼ de la almohadilla de agar de diámetro, en un disco de aluminio diseñada por encargo para adaptarse a una cryoultramicrotome (descrito más adelante). Rápidamente congelar la rebanada por neumáticamente impulsándola contra un bloque de zafiro LN 2 enfriado por medio de un dispositivo de &quot;congelación Slam&quot; personalizado. </li><li> Mover a almacenamiento como se describe para las células cultivadas. </li></ol> 2. Cryosectioning Advertencia: producir con éxito cintas secas cortadas de secciones ultrafinas, mientras que sencillo y lógico, requiere de un entrenamiento, paciencia y mucha práctica. <ol><li> Hornear un cryoultramicrotome equipado con un cryoattachment y enfriar a -135 ° C. </li><li> Cortar cubreobjetos congelados en aprox. 3 x 3 mm cuadrados utilizando un escalpelo afilado previamente enfriada. Incrustar piezas con culturas hacia arriba en un líquido &quot;cryoglue&quot; viscoso (una mezcla 01:06 de etanol y 2-propanol 11), en la norma 3pins de aluminio de diámetro mm diseñado para adaptarse a la tirada de muestras microtomo. Evite fugas cryoglue sobre la superficie de cultivo. Solidificar cryoglue mediante la reducción de la temperatura Caja criogénica a ≤ -160 ° C. <ul class="lalpha"><li> Por cortes de cerebro congelado, fije firmemente discos directamente a un mandril espécimen medida por medio de un collar de tornillo. </li></ul></li><li> Recorte las áreas seleccionadas de las muestras congeladas - por ejemplo, áreas de células ricas en piezas cubreobjetos o áreas identificadas de rebanadas - para un aprox. Cara del bloque 250 x 250 micras y aproximadamente 100 micras de profundidad utilizando una herramienta de diamante de corte. </li><li> Cintas Dry-corte de secciones delgadas de CA. -160 ° C usando un diamante cryoknife 35 °, esencialmente como se describe en referencs 4, 9. Velocidad de corte y superficie libre del cuchillo se determinan empíricamente, un buen punto de partida es 0,4 a 0,6 mm / seg a 9 °. El espesor nominal, es decir, muestra de antemano, de secciones hidratados is típicamente 80 nm, aunque secciones son en realidad 1,5-2.0x más gruesa, debido principalmente a la compresión. Para seccionamiento satisfactoria, un dispositivo antiestático es esencial. Coloque la punta de ionización de los dispositivos de 0,5 a 1 cm del borde de la cuchilla y ajustar la potencia de salida hasta que se producen cintas satisfactorias de secciones. </li><li> Emplear indagaciones pestañas pegando (con epoxi) pestañas para aplicadores de madera. Usando una sonda de este tipo, recoger y secciones de transferencia de la parte de atrás del cuchillo sobre, películas de soporte Pioloform carbono recubierto de resplandor descargada emitidos más de 100 de malla de las redes de cobre doblado y que descansan sobre un indio sobre de aluminio-medio doblado en un estante detrás de trabajo el cuchillo. Veces más de la mitad superior de la parrilla y el sobre, presione con una herramienta de prensado en frío. </li><li> Transferencia de rejillas envueltos a una celda de la malla conveniente y tienda en una lata de aluminio como se describe en el paso 1.4. </li></ol> 3. Criotransferencia de muestras para el microscopio electrónico El instrumento básico para EPMAen este laboratorio es un microscopio electrónico analítico operado a 120 kV y equipado para criomicroscopía, es decir, diseñado con un vacío limpio, espécimen-área anticontaminator, una cámara digital 2K x 2K de alta sensibilidad y soporte de la muestra criotransferencia. Compruebe de antemano la alineación microscopio y las condiciones de funcionamiento en ambos modos de bajos y de gran aumento y confirme una columna de vacío satisfactoria, idealmente ≤ 10 -7 Torr. Ponga a punto de ser necesario. <ol><li> Compruebe que el aislamiento por vacío del componente de Dewar del cryoholder es satisfactoria. Bomba según sea necesario. </li><li> Enfriar la cryoholder a su temperatura mínima, por lo menos 160 º C, mientras que en alto vacío dentro de la platina del microscopio, suelte el cable de conexión al titular a su caja de control. Incline el goniómetro 45 ° hacia la derecha antes de retirar el soporte para minimizar LN 2 derramar en el operador y microscopio superficies. </li><li> Prepare el cryoworkstation sobremesa enfriando el aislar integrald taza a ≤ 160 ° C. </li><li> Transferencia (quickly!) la cryoholder enfriado desde microscopio para crio estación de trabajo. Repliegue escudo heladas del titular. </li><li> Recuperar bajo LN 2 un sándwich rejilla de almacenamiento y el lugar en la mesa de trabajo de la cryoworkstation. Un anillo de retención para el pocillo de muestra del titular también se coloca sobre la mesa. </li><li> Abra el sobre de indio y mover la rejilla plegable cerrado al pozo del espécimen cryoholder. Asegure la rejilla con el anillo de retención con la herramienta de llave suministrada y cerrar el escudo de escarcha. </li><li> Quite rápidamente la cryoholder del cryoworkstation y colocarlo en la bolsa de aire del microscopio y pasar por la secuencia de bombeo lo más rápido posible. En la inserción, debe haber una interrupción mínima de la columna de vacío. </li><li> Goniómetro Retorno a 0 ° de inclinación. Volver a conectar y reenergize la caja de control y confirme que la temperatura de la muestra es ≤ 150 ° C. </li><li> Vuelva a llenar el Dewar delContenedor de muestras y permitir que el vacío y la temperatura para recuperarse plenamente. </li></ol> 4. Inspección Visual de las secciones <ol><li> Repliegue el escudo helada del soporte para exponer la muestra y encienda el haz de electrones. </li><li> Visualmente evaluar la muestra a bajo aumento, por lo general 250X, y la baja iluminación. Como se ilustra en la Figura 1, las secciones deben ser delgada y lisa, no plegado o superposición, plana y bien unido a la película de soporte, y generalmente no oscurecido por barras de la rejilla. </li><li> Opcionalmente fotografiar secciones seleccionadas. (NOTA: Reducir al mínimo la exposición del haz, ya que las secciones congeladas hidratado son muy susceptibles al daño inducido por haz.) Utilice la etapa automatizado goniómetro digital para almacenar coordenadas de las secciones seleccionadas. </li></ol> 5. La liofilización de las Secciones <ol><li> De secado por congelación secciones mediante el aumento de la temperatura titular a ca. -100 ° C durante ~ 30 min. </li><li> Recool titular a -160 ° C o menos. </li><li&gt; Antes de imágenes, apague la unidad de control cryoholder y cable controlador físicamente desconexión para evitar la imagen de deriva debido al ciclo térmico y / o captador de vibraciones. </li></ol> 6. Obtención de imágenes de células y orgánulos Imágenes estructurales de las secciones liofilizados se obtienen a ca. -160 ° C como en dosis bajas, las imágenes para bajar de cero grabados digitalmente utilizando una cámara CCD de exploración lenta 2k x 2k controlado por software apropiado. <ol><li> Active la EM en modo hi-mag. </li><li> Elija e imagen en ~ 2000 X (como TIFF, ver Figura 2) celdas seleccionadas y áreas subcelulares de interés en las secciones de alta calidad cuyas ubicaciones fueron registrados y almacenados previamente. (NOTA: Las secciones secas ahora son sustancialmente menos frágiles y menos susceptibles al daño por haz de electrones. </li><li> Evaluar las imágenes con el fin de seleccionar las regiones de interés (ROI) para el análisis de rayos X. Este paso se puede realizar opcionalmente fuera de línea, en cuyo caso la EM se puede girarfuera y el espécimen se dejó calentar hasta temperatura ambiente. </li></ol> 7. Adquisición de Rayos X Spectra Espectros de rayos X se puede grabar utilizando cualquiera de los diversos comercial o de diseño personalizado de rayos X sistemas de análisis mínimamente consistentes en una placa de rayos X (EDX) detector de dispersión de energía, asociados electrónica del pulso en el procesador y el software de adquisición y visualización compatible. (El sistema utilizado en esta práctica se describe en la Tabla 1.) <ol><li> Configurar la EM para la adquisición de rayos X mediante la inserción del detector EDX en la columna (si es necesario), la retirada de la apertura del objetivo, y la inserción y el centrado de las aberturas radiación parásita. Ajuste el cryoholder a la temperatura más baja a la que se evita la contaminación de escarcha de la muestra, pero por lo menos por debajo de -100 ° C. </li><li> Incline el soporte de 20 ° hacia el detector. </li><li> En condiciones de formación de imágenes de campo amplio, y asumiendo uno tiene la intención de analizar la matriz de un individual mitocondrias, elija una mitocondria para el análisis, se mueve hacia el centro del campo y el enfoque. </li><li> Vaya al modo de contado (en algunos microscopios sólo convergen el haz usando segundo enfoque del condensador) y aumentar la intensidad del haz de aprox. 3 nA (medido con una taza de Faraday o similar) en un lugar de 100 nm. </li><li> Inicie el software de adquisición de espectro y empezar 100 seg adquisiciones, que se puede ver el tiempo en directo en la pantalla del monitor. Ahorra espectro registrado (Figura 2). Se prefiere el formato de la EMSA estándar de la industria. </li><li> Apague el EM y transferir el archivo (s) de múltiples espectros a una (sin conexión) estación de trabajo de análisis. </li></ol> 8. Análisis de X-ray Spectra Análisis cualitativo Un espectro EDX (Figura 2, recuadro) es esencialmente un gráfico XY de la intensidad de rayos X de energía vs. Spectra contiene información cualitativa y cuantitativa sobre la composición elemental de tanalizó el volumen, en la que la energía &quot;característica&quot; de un pico identifica el elemento que da lugar a que el pico mientras que la intensidad refleja la cantidad de ese elemento. Los picos característicos montan en la parte superior de un fondo que varía lentamente, el &quot;continuum&quot;. (La leyenda de la Figura 2 se analiza más detalles sobresalientes de espectros EDX.) La energía de los colectores de pico para toda la tabla periódica están definidos por la estructura electrónica conocida de elementos, por lo tanto, todos los enlaces de software EDX a una base de datos que identifica automáticamente los componentes de un analito. En un contexto fisiológico, los elementos de interés general que se adaptan bien al análisis EDX incluyen Na (K α en 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) y Ca (3,69 keV). <ol><li> Tome ventaja de la base de datos de software disponible y las rutinas de asignación de picos para identificar los principales elementos en los espectros. En una muestra biológica esperar encontrar picos de Na, Mg, P, S, Cl, K y Ca. (ATENCIÓN:Los dos últimos elementos se superponen!) </li></ol> Análisis cuantitativo El análisis cuantitativo de los espectros EDX consiste en extraer el área integrada de los picos identificados y convertir este valor a una concentración. Para el análisis biológico, el enfoque establecido es el método pico / continuo Pasillo 4,7,10, que se aprovecha del hecho de que la intensidad del continuo (definido anteriormente y en la Figura 2) es proporcional a la masa seca del volumen analizado . Por lo tanto, la relación de pico de área de zona / continuo, cuando se compara con la misma relación en los espectros de las normas de composición conocida, especifica la concentración en el compartimento celular específico. Tenga en cuenta que este enfoque proporciona concentraciones en unidades de moles por peso, por lo general expresa en mmol / kg de peso seco. Esta unidad es inusual y para la interpretación puede requerir la conversión adicional a, por ejemplo, mmol / L de peso húmedo o / mg de proteína mmol, como se describe ELsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Extracto de las áreas de pico (y estimaciones de error) de elementos biológicos entre Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), es decir, Na, Mg, P, S, Cl, K y Ca, utilizando una de las rutinas de ajuste integrado en el software de análisis (véase la Tabla 1, especialmente la nota 4). Este laboratorio utiliza Simplex o múltiple de mínimos cuadrados apropiado. Tenga en cuenta que este ajuste requiere una cuidadosa atención a la resolución de la superposición entre K y Ca picos (ver Figura 2). </li><li> Integrar el continuo entre 1,45 a 1,61 keV. Regiones libres de interferencia alternativos pueden ser utilizados. </li><li> Calcular proporciones pico / continuo y luego concentraciones en comparación con las normas. Propagar errores a través del análisis. </li><li> Utilice el software estadístico estándar y las fórmulas para calcular los promedios que reflejan la variabilidad biológica. </li></ol>

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</ol>

Los autores informan de ningún conflicto de intereses.

El método analítico basado en microscopio electrónico de que aquí se presenta permite la detección, identificación, y cuantificación de varios elementos de interés biológico, incluidos Na, K, P, Ca y especialmente. Estos análisis pueden llevarse a cabo en subcelular, es decir, dentro de la orgánulo, la resolución debido a la capacidad de localizar e identificar estructuras de interés en imágenes de alta calidad de criosecciones preparados a partir de muestras congeladas rápidamente. Tenga en cuenta que no se re...

Los iones de calcio son, posiblemente, la entidad de señalización celular más importante y versátil en biología, que juega un papel esencial en los procesos normales tan diversos como la transmisión sináptica y la expresión génica. Por otro lado, el calcio es igualmente importante en la muerte celular. En particular, la desregulación del calcio es un factor clave en el daño neuronal en el ictus, Parkinson, Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas 3,5. Por lo tanto, es críticamente importante entender cuantitativamente cómo se distribuye de calcio dentro de las células, y cómo esto cambia después de estímulos fisiológicos o fisiopatológicos. Este objetivo se complica por el hecho de que el calcio se distribuye dinámicamente entre los dos estados físicos - libre en solución o unido a un sustrato - y que las concentraciones de calcio celular cambian a lo largo de varios órdenes de magnitud, como consecuencia de la estimulación. Si bien existen varias metodologías avanzadas disponibles para el análisis de free de calcio intracelular, la determinación de las concentraciones de calcio total en compartimentos intracelulares definidos se limita de manera realista a un enfoque, a saber, microanálisis de sonda de electrones (EPMA). EPMA es una técnica que las parejas un espectrómetro de rayos X para un microscopio electrónico de transmisión (TEM). El cañón de electrones TEM se centra una sonda electrónica submicras estacionaria en una región subcelular de interés y los rayos X de elementos específicos emitidos como resultado del bombardeo de electrones son recogidos y analizados (ver referencias 7, 4 para revisiones técnicas detalladas). Ventajas de EPMA incluyen sola resolución a nivel de orgánulo y sensibilidad submilimolar. En la práctica, sin embargo, requiere EPMA cryotechniques e instrumentos especializados para la preparación y análisis de muestras. Aquí se describen las herramientas, técnicas e instrumentos adecuados para la medición de calcio intracelular usando EPMA. Calcio intramitocondrial es de i especiall interés en cuenta el papel fundamental que desempeña la sobrecarga de calcio mitocondrial en las enfermedades neurodegenerativas.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS/MATERIALES</fuerte></td></tr><tr><td>cubreobjetos de plástico Thermanox</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Para placas de 6 pocillos</td></tr><tr><td>Cryopins</td><td>Leica Microsystems</td><td>16701952</td><td>Aplicadores de madera ranurada</td></tr><tr><td></td><td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas EM plegables</td><td>Ted Pella</td><td>4GC100/100</td><td>malla 100</td></tr><tr><td>Lámina de indio</td><td>Alfa Aesar</td><td>13982</td><td>0,25 mm de grosor</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dispositivo de congelación por inmersión</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de congelación Slam</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio criogénico para micrótomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de recorte</td> criogénico de diamante <td>Diatome</td><td>Cryotrim 45</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo criogénico de diamante</td><td>Diatome</td><td>Cryo 35</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo antiestático</td><td>Diatome</td><td>Hauf Static Line</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico</td><td>Carl Zeiss Microscopía</td><td>EM912 Omega</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de muestras criogénicas EM</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD de escaneo lento, 2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td><td>Sharpeye</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes</td><td>Olympus SIS</td><td>iTEM suite</td><td></td></tr><tr><td>ED detector de rayos X</td> Oxford <td></td><td>Instruments Linksystem Pentafet</td><td></td></tr><tr><td>Procesador de pulsos</td> Oxford <td>Instruments</td><td>XP-3</td><td></td></tr><tr><td>PCI tarjeta</td><td>4pi Systems</td><td>Spectral Engine II</td><td></td></tr><tr><td>Ordenador de sobremesa</td><td>Apple</td><td>Cualquier modelo</td><td></td>compatible con OS9</tr><tr><td>Software de análisis de rayos X</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>Software de hoja de cálculo</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li>El CF100 ya no se vende comercialmente, aunque la máquina está disponible en muchas instalaciones académicas, y Las máquinas completas o las piezas se pueden encontrar en línea.</li> <li>Un video tutorial para el soporte de criotransferencia CT3500 está disponible en <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li>El SEII está obsoleto; el motor espectral universal es un producto posterior compatible con PC con una funcionalidad comparable. 4PI ha dejado de fabricar y vender, pero sigue proporcionando soporte técnico al cliente. Los sistemas usados a menudo se encuentran en línea.</li> <li>El DTSA original ahora está obsoleto. El NIST ofrece en el dominio público un sucesor actualizado, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol> </td></tr></tbody></table>

medición de calcio total en neuronas por sonda de electrones x-ray microanálisis

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

En este artículo se describen las herramientas, las técnicas y los instrumentos adecuados para las mediciones cuantitativas de contenido elemental intracelular mediante la técnica conocida como microanálisis de sonda de electrones (EPMA). Calcio intramitocondrial es un enfoque particular debido al papel crítico que la sobrecarga de calcio mitocondrial desempeña en las enfermedades neurodegenerativas. El método se basa en el análisis de los rayos X generados en un microscopio electrónico (EM) por la interacción de un haz de electrones con la muestra. Con el fin de mantener la distribución natural de los elementos difusibles en especímenes de microscopía de electrones, EPMA requiere &quot;criofijación&quot; de tejido seguido de la preparación de secciones criogénicas ultrafinas. La congelación rápida de las células cultivadas o cultivos de cortes organotípicos se lleva a cabo por inmersión de congelación en etano líquido o por la congelación de golpe contra un bloque de metal en frío, respectivamente. Criosecciones nominalmente 80 nm de espesor se cortan en seco con un cuchillo de diamante en ca. -16076; C, montada en / rejillas de cobre Pioloform recubierto de carbono y cryotransferred en una crio-EM utilizando un soporte cryospecimen especializada. Después de la inspección visual y la cartografía de la ubicación a ≤ -160 ° C y la dosis de electrones de baja, cryosections congelados hidratado son liofilizada a -100 º C durante aproximadamente 30 min. Imágenes de nivel de Orgánulos de criosecciones secos se registran, también a baja dosis, por medio de una cámara CCD de barrido lento y regiones subcelulares de interés seleccionado para el análisis. Los rayos X emitidos desde ROI por un centrado, sonda de electrones estacionaria, de alta intensidad son recogidos por una placa de rayos X de dispersión de energía (EDX) espectrómetro, procesada por la electrónica asociada, y presentada como un espectro de rayos X, es decir, una gráfico de la intensidad de rayos X de energía vs. Software adicional facilita: 1) la identificación de los componentes elementales de sus &quot;características&quot; energías pico y huellas dactilares, y 2) el análisis cuantitativo mediante la extracción de las áreas de pico / fondo. Este documento concluye con dos ejemplos que ilustran típicaAplicaciones EPMA, una en la que el análisis de calcio mitocondrial proporcionado una visión crítica de los mecanismos de lesión excitotóxica y otro que revelaron la base de la resistencia a la isquemia.

Las células del cerebro típicamente sufrir una lesión excitotóxica como resultado de la liberación de neurotransmisores patológico que se produce en condiciones isquémicas. EPMA fue fundamental para descubrir cómo la capacidad de las mitocondrias neuronales para secuestrar grandes cantidades de calcio subyace al mecanismo de la lesión. La micrografía de electrones en la Figura 3 ilustra la apariencia de las mitocondrias en criosecciones liofilizados de las neuronas del hipocampo en cultivo congelados rá...

En este trabajo se describe la aplicación de la microscopía electrónica cryoanalytical para la medición cuantitativa de contenido de calcio total y su distribución en la resolución subcelular en muestras biológicas fisiológicamente definidos.

Medición de calcio total en neuronas por Sonda de Electrones X-ray microanálisis

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la microscopía electrónica analítica para medir cuantitativamente la concentración de elementos biológicamente importantes, como el calcio, a resolución subcelular en neuronas cultivadas. Esto se logra congelando primero rápidamente cultivos de células vivas y preparando secciones criogénicas ultrafinas. El segundo paso es transferir las secciones criogénicas a un microscopio electrónico analítico y liofilizarlas.Se requieren imágenes y espectros de rayos X de regiones subcelulares seleccionadas, incluidas las mitocondrias neuronales. El paso final es analizar cuantitativamente los espectros de rayos X para determinar las concentraciones elementales localizadas. En última instancia, este enfoque conocido como EPMA se utiliza para revelar cambios en las concentraciones y la distribución de calcio que subyacen a la señalización intracelular del calcio.La principal ventaja de esta técnica sobre métodos relacionados como la fluorescencia, la microscopía, la absorción de radioisótopos o la fotometría de llama, es la resolución a nivel de orgánulo único y la sensibilidad submilimolar. La demostración del procedimiento estará a cargo de la Dra. Natalia pva, científica sénior de nuestro laboratorio. Para comenzar, prepare un baño de congelación condensando etano gaseoso a menos 160 grados centígrados en el pozo central de un sistema enfriado con nitrógeno líquido.A continuación, seque el borde de un cubreobjetos que contenga células adheridas para eliminar todo el líquido, excepto una fina película. Tenga cuidado de no secar la muestra. A continuación, sujete el cubreobjetos por el borde y sumerja rápidamente la muestra en el etano líquido.Después de dos o tres segundos, retire la cubierta del etano y colóquela en un recipiente de espuma de poliestireno con transferencia de nitrógeno líquido. La cubierta congelada se desliza en un micrótomo criogénico antes de enfriarse a menos 135 grados Celsius. Corta los cubreobjetos congelados en cuadrados de tres milímetros por tres milímetros con un bisturí preenfriado afilado.A continuación, colóquelos boca arriba en un alfiler de aluminio de tres milímetros de diámetro en una mezcla de pegamento criogénico que consta de una parte de etanol y seis partes. Isopropanol. Solidifique el pegamento criogénico bajando la temperatura de la caja criogénica a menos 160 grados centígrados. A continuación, recorte las áreas ricas en celdas de la pieza deslizante de cobertura a una cara de bloque de aproximadamente 250 por 250 micras y una profundidad de 100 micras.Con una herramienta de recorte de diamante, corte en seco cintas de secciones delgadas a menos 160 grados Celsius con un cuchillo criogénico de diamante de 35 grados, como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, transfiera las secciones a la forma de peola recubierta de carbono descargada incandescente. Las películas de soporte funden sobre 100 rejillas de cobre plegables de malla colocadas en un sobre de indio abierto.La rejilla está cerrada. A continuación, el sobre y el sándwich se prensan con una herramienta de prensado enfriada antes de la transferencia criogénica de las muestras al microscopio electrónico. Enfríe el soporte criogénico a su temperatura mínima de al menos 160 grados centígrados negativos mientras se encuentra bajo alto vacío dentro de la etapa del microscopio.A continuación, incline el goniómetro 45 grados en el sentido de las agujas del reloj y retire el soporte. Transfiera rápidamente el soporte criogénico refrigerado del microscopio a la estación de trabajo criogénica refrigerada y retraiga el protector contra heladas del soporte. A continuación, transfiera la muestra al soporte criogénico.Asegure la rejilla con el anillo de retención con la herramienta de llave provista y cierre el protector contra heladas. A continuación, retire rápidamente el soporte criogénico de la estación de trabajo criogénica e insértelo en la esclusa de aire del microscopio. Realice la secuencia de bombeo lo más rápido posible con el soporte criogénico de muestras en su lugar.Vuelva a colocar el goniómetro en una inclinación de cero grados. Vuelva a conectar y vuelva a energizar la caja de control y confirme que la temperatura de la muestra sea menor o igual a menos 150 grados Celsius. Finalmente, vuelva a llenar el hacedor del portamuestras y permita que el vacío y la temperatura se recuperen por completo.Primero, evalúe visualmente el espécimen con un aumento de 250 veces y poca iluminación. Las secciones seleccionadas deben ser delgadas y lisas, no dobladas ni superpuestas. También deben ser planos, estar bien sujetos a la película de soporte y, por lo general, no estar oscurecidos por barras de rejilla.Utilice la platina del goniómetro digital para almacenar las coordenadas de las secciones seleccionadas. A continuación, aumente la temperatura del soporte a menos 100 grados centígrados durante 30 minutos para liofilizar las secciones y estabilizarlas y mejorar el contraste. A continuación, retroceda las muestras hasta 160 grados centígrados negativos o menos.Antes de las imágenes de alta resolución. Apague la unidad de control del soporte criogénico y desconecte físicamente el cable del controlador para evitar la deriva de la imagen debido a los ciclos térmicos o la captación de vibraciones. A continuación, active el microscopio electrónico en modo de gran aumento.Inspeccione las regiones subcelulares con un aumento de alrededor de 2000 veces que se encuentran dentro de secciones seleccionadas cuyas ubicaciones se almacenaron anteriormente. Grabe y almacene imágenes TIFF de áreas prometedoras. A continuación, evalúe las imágenes para seleccionar y anotar las regiones de interés para el análisis de rayos X.Una vez que se hayan seleccionado las regiones de interés, configure el microscopio electrónico para la adquisición de rayos X insertando el detector EDX en la columna, retirando la apertura del objetivo e insertando y centrando las aberturas de radiación parásitas. Incline el soporte 20 grados hacia el detector en modo puntual. Aumente la corriente del haz a alrededor de tres nanoamperios medidos en un punto de 100 nanómetros.Luego, eleve la temperatura del soporte criogénico a menos 100 grados Celsius o menos para evitar la contaminación por heladas en condiciones de imágenes de campo amplio. Elija una mitocondria para el análisis. Vuelva al modo puntual.Lanzar el software de adquisición de espectro y comenzar las adquisiciones número 102. Guarde los espectros registrados en el formato de archivo estándar EMSA. Muestree suficientes mitocondrias en diferentes células para garantizar un conjunto de datos estadísticamente significativo.Para analizar cualitativamente un espectro EDX, utilice una base de datos de software disponible y una rutina de coincidencia de picos como DTSA para identificar los elementos principales en los espectros. Identifique los elementos por las posiciones de energía características de sus picos. Los especímenes biológicos generalmente contienen sodio, casio, fósforo, azufre, cloro, potasio y calcio.Preste especial atención a los picos de calcio y potasio, ya que se superponen para el análisis cuantitativo. Comience por extraer el área integrada de los picos identificados utilizando cualquiera de los varios algoritmos de ajuste estándar, como el método simplex incorporado en DTSA, siguiente estimación de la masa seca integrando el continuo entre 1,45 y 1,61 kilo electronvoltios. Las regiones alternativas libres de interferencias, por ejemplo, de 4,0 a 5,0 kilo electronvoltios, se pueden utilizar para evitar señales no biológicas extrañas en la región del continuo primario.Por último, calcule las proporciones de picos sobre el continuo y conviértalas en concentraciones comparándolas con los estándares. Este enfoque se conoce como el método del pico Hall sobre el continuo. Aquí se muestra una micrografía de una neurona del hipocampo cultivada, congelada rápidamente después de la exposición a un estímulo citotóxico, que conduce a la apertura de canales iónicos y calcio en flujo.La mayoría de las mitocondrias que se muestran aquí parecen estructuralmente dañadas, ya que están muy hinchadas y contienen inclusiones pequeñas y oscuras. A continuación, se utilizó el microanálisis de sonda electrónica para realizar análisis elementales dentro y exclusivamente de las inclusiones mitocondriales. El estudio reveló que las inclusiones están compuestas en gran medida por cantidades extremadamente altas de calcio y fósforo.Esto explica su extraordinaria capacidad de amortiguación de calcio y por qué abrumar este mecanismo de amortiguación conduce a una sobrecarga de calcio que desencadena la muerte celular. El hipocampo, un área del cerebro crítica para el aprendizaje y la memoria, es un sitio importante de lesión después de la isquemia. La región funcionalmente distinta llamada CA tres es mucho menos vulnerable a la lesión isquémica que la adyacente sinápticamente conectada ca una región El microanálisis de sonda electrónica siguiendo los estímulos tóxicos de estos cortes mostró elevaciones de calcio mucho mayores en las neuronas vulnerables CA uno que en las neuronas CA tres resistentes.En consecuencia, las mitocondrias CA one exhiben lesiones y disfunciones extensas, lo que indica que la disfunción mitocondrial inducida por sobrecarga de calcio es un factor determinante en la vulnerabilidad selectiva de las neuronas CA uno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la concentración de calcio total en mitocondrias individuales de neuronas en cultivo utilizando el microanálisis de sonda de recolección.

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Aprende a medir calcio total en neuronas cultivadas mediante microanálisis con sonda de electrones EPMA. Esta técnica de criomicroscopía analítica permite cuantificar concentraciones elementales con resolución subcelular en mitocondrias.

Medición de calcio total en neuronas por Sonda de Electrones X-ray microanálisis

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