Name: Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprende a utilizar química click para medir cambios en la transcripción del ARN en células infectadas con el virus de la fiebre del Valle del Rift MP-12. Este método no radioactivo permite visualizar resultados mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo.

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Agradecemos RB Tesh para proporcionar el ratón policlonal anti-RVFV antisuero y M. Griffin del UTMB Citometría de Flujo Core Facility para ayudar con la citometría de flujo. Esta labor fue apoyada por 5 U54 AI057156 a través del Centro de Excelencia de la Región Occidental, NIH subvención R01 AI08764301, y la financiación del Centro Sealy para el Desarrollo de Vacunas de UTMB.BK fue apoyado por el James W. McLaughlin Fondo de Becas en UTMB.OL fue apoyado por R. Hilleman Early-Stage Premio Investigador Carrera Maurice.

Análisis de la transcripción por microscopía de fluorescencia 1. Infectar las células con el MP-12 y la etiqueta de ARN naciente con la UE <ol><li> Lugar 12 mm cubreobjetos redondos en placa de cultivo tisular de 12 pocillos, un cubreobjetos por pocillo. </li></ol> Nota: Si las células tienen problemas para la adhesión a cubreobjetos, la capa con poli-L-lisina (MW ≥ 70000) antes de colocar en los pozos. Para este objetivo, cubreobjetos de sumergir en una solución estéril de 0,1 mg / ml en H2O de poli-L-lisina durante 5 min. Enjuague cubreobjetos con H2O estéril y secar al aire durante al menos 2 horas. <ol start="2"><li> Para las células de semillas 293 en cubreobjetos, añadir x 10 células 4 5 en 1 ml de medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) por pocillo. Incubar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% CO 2 S / N. </li><li> Infectar las células con MP-12 a una multiplicidad de infección (MOI) de 3. Incluya por lo menos dos<html> pozos no infectados: uno de los dos pozos servirán como el control no infectado, y el otro serán tratados con actinomicina D (ActD) en el paso 1.5 como un control para la supresión transcripcional. Retire medio de crecimiento y se diluye el stock de virus de manera que el volumen total añadido a cada pocillo es de 200 ml. Incubar durante 1 hora en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> Nota: En vez de infectar a las células, las células también se pueden transfectar con ADN plásmido o in vitro sintetizan ARN que codifica una proteína viral específica. Para este objetivo, transfectar células con un reactivo de transfección química apropiada de acuerdo con las instrucciones del fabricante y continúe en el paso 1.5 a 16 h después de la transfección. Es aconsejable para optimizar las condiciones de transfección y el tiempo de incubación antes de su etiquetado ARN y la fijación. <ol start="4"><li> Eliminar el inóculo y se añade 1 ml de medio de cultivo fresco por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 15 hr. </li></ol>ove_content &quot;&gt; Nota:. Si la adaptación de este protocolo para el uso con otro virus, es aconsejable llevar a cabo un experimento de curso de tiempo para determinar el momento óptimo para el etiquetado de ARN y la fijación Configurar este curso de tiempo de modo que los tiempos de infección están escalonadas y todos muestras pueden ser etiquetados, se fijaron, y se tiñeron en el mismo tiempo. <ol start="5"><li> En 15 horas después de la infección (hpi), sustituya medio de cultivo con medio que contenía 1 mM UE. Para uno de los pozos de infección simulada, también añadir 5 g / ml de ActD. Esto servirá como el control para la supresión de la transcripción, como ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente de ADN. Células Volver a la incubadora. </li><li> A los 16 hpi, eliminar el medio y lavar los cubreobjetos de una vez con 1 ml de PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / l, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) por pocillo. Fijar las células mediante la adición de 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) por pocillo e incubando durante 30 min a TA. </li></ol>Nota: Para preparar la solución de fijación PFA 4%, se disuelven 10 g de paraformaldehído en 150 ml de H 2 O se calienta a 60 ° C en un agitador magnético con calefacción. Añadir 500 l de NaOH 1 M y seguir removiendo hasta que la solución se aclare. Filtrar la solución de PFA a través de un papel de filtro para eliminar las partículas y añadir 62,5 ml de tampón de fosfato (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM de Na 2 HPO 4, pH 7,4). Añadir H2O hasta un volumen total de 250 ml. Congelar a -20 ° C en alícuotas de un solo uso. <ol start="7"><li> Lavar una vez con 1 ml de PBS por pocillo. No se requiere tiempo de incubación para este y todos los pasos de lavado posteriores. Proceda inmediatamente al paso 2. </li></ol> Nota: Es importante para proceder inmediatamente con la reacción de click, como el ARN degenera si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados de tiempo, una pérdida de la señal de fluorescencia de RNA ya se puede observar si las células se mantienen durante 1 hora a 4 ° C . Del mismo modo, si porformando un experimento de evolución en el tiempo, asegúrese de etiqueta, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo. 2. Haga clic en la reacción para detectar ARN marcado <ol><li> Permeabilizar las células mediante la adición de 1 ml de 0,2% de Triton X-100 en PBS. Incubar durante 10 min a TA. </li></ol> Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 2.1 a 2.3 deben estar libre de nucleasa. <ol start="2"><li> Lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo. </li><li> Retire cubreobjetos de la placa de 12 pocillos y transferencia en cámara húmeda. Cubra cada portaobjetos con 50 - 100 l solución de tinción clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM de CuSO4, 20 mM de azida fluorescente [excitación / emisión máxima: 590/617 nm], ácido ascórbico 100 mM) cada uno. Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Para el montaje de la cámara húmeda, línea de la parte inferior de un cultivo de células o placa de Petri con un diámetro de 10 cm con una película de plástico de parafina. Forre el interior del borde de la diSH con toallas de papel húmedas. Coloque el cubreobjetos sobre la película de parafina plástico. Nota: Tenga cuidado de no dejar que los cubreobjetos se sequen durante este o cualquier otro paso en el protocolo. Lo mejor es añadir la solución de tinción a cada cubreobjetos directamente después de que se ha colocado en la cámara húmeda. Nota: Preparar la solución de tinción clic fresco inmediatamente antes de este paso. Las soluciones madre de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO4, y ácido ascórbico 500 mM se pueden almacenar a 4 ° C. Sin embargo, descartar cualquier solución de ácido ascórbico que se ha convertido amarillo. Nota: Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que coincida con los filtros de su microscopio de fluorescencia. <ol start="4"><li> Retire cubreobjetos de cámara húmeda y colocar en una placa de 12 pocillos frescos y lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo. </li></ol> Nota: si no dese desea la protección de las proteínas virales, cubreobjetos se puede montar y fotografiada después de este paso (vaya al paso 3.3). 3. La inmunofluorescencia para detectar la expresión de las proteínas virales <ol><li> Añadir 1 ml de tampón de bloqueo (3% (w / v) de suero de albúmina (BSA) en PBS bovina) a cada pocillo y se incuba durante 30 min a TA en la oscuridad. </li><li> Retire cubreobjetos de placa de 12 pocillos, de transferencia en cámara húmeda y cubra con 50 - 100 l de anticuerpo primario (anti-RVFV, una especie de regalo del Dr. RB Tesh, UTMB) diluido en tampón de bloqueo (1:500). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Cuando la adaptación de este protocolo para su uso con un virus diferente, determinar la dilución óptima para su anticuerpo primario primero. Nota: Como alternativa, este paso se puede realizar de O / N a 4 ° C en la oscuridad. <ol start="3"><li> Retire cubreobjetos de cámara húmeda y lugar de nuevo en placa de 12 pocillos y lavartres veces con 1 ml de PBS por pocillo. </li><li> Retire cubreobjetos de un lugar de 12 pocillos, en lugar cámara húmeda y cubierta con 50 - 100 l de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón conjugado con colorante fluorescente [excitación / emisión máxima: 495/519 nm]) diluido en tampón de bloqueo (1: 500). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Asegúrese de seleccionar un anticuerpo secundario que puede reconocer el anticuerpo primario y coincide con los filtros de su microscopio de fluorescencia. Nota: Si se desea, 200 ng / ml de DAPI se puede añadir a la dilución de anticuerpo secundario para visualizar los núcleos. <ol start="5"><li> Retire cubreobjetos de la cámara húmeda y lugar de nuevo en placa de 12 pocillos y lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo. </li><li> Montar cubreobjetos mediante la colocación de una gota (ca. 15 l) de Fluoromount-G en un portaobjetos de microscopio. Sumerja el portaobjetos en H 2 O, eliminar el exceso de H 2 O tocando ªlado de correo contra una toalla de papel, y el lugar de células del lado hacia abajo en la gota de Fluoromount-G. Deje secar al aire durante 5 minutos. </li></ol> Nota: Si formación de imágenes en un microscopio invertido, permitir Fluoromount-G para solidificar a 4 ° CO / N o colocar el cubreobjetos en el portaobjetos de un microscopio mediante el sellado del borde con esmalte de uñas transparente. Nota: diapositivas se pueden visualizar inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de una semana. 4. Adquisición de Datos <ol><li> De imagen usando un microscopio de fluorescencia. </li></ol> Nota: Asegúrese de seleccionar fluoróforos adecuados que se pueden visualizar utilizando su microscopio. Como referencia, los siguientes son los fluoróforos y conjuntos de filtros utilizados para la adquisición de las imágenes mostradas en esta publicación. DAPI: Filtro de excitación: BP 330-385 Dichromatic espejo: 400 DM Filtro de emisiones: LP 420 Filtro de excitación: BP 460-490 Dichromatic espejo: 505 DM Filtro de emisiones: LP 510 Fluoróforo con un máximo de excitación / emisión de 590/617: Filtro de excitación: BP 545-580 Dichromatic espejo: 600 DM Filtro de emisiones: LP 610 Análisis de la transcripción por citometría de flujo 5. Infectar las células con el MP-12 y la etiqueta de ARN naciente con la UE <ol><li> Semilla células 293 en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos en medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina). Incubar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que las células han alcanzado el 80 - 100% de confluencia. </li><li> Infectar las células con MP-12 a una moi de 3. Incluir al menos dos pozos infectados: uno de los dos pozos servirá como control no infectado, el otro serán tratados con ActD en el paso5.4. Retire medio de crecimiento y se diluye el stock de virus de manera que el volumen total añadido a cada pocillo es de 400 l. Incubar durante 1 hora en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Retire inóculo y añadir 2 ml de medio de cultivo fresco por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 12 hr. </li></ol> Nota: Si la adaptación de este protocolo para el uso con otro virus, es aconsejable llevar a cabo un experimento de curso de tiempo para determinar el momento óptimo para el etiquetado y la cosecha. Establecer este supuesto tiempo de modo que los tiempos de infección están escalonados y todas las muestras pueden ser etiquetados, se recogieron, y se tiñeron en el mismo tiempo. <ol start="4"><li> A las 12 hpi, sustituya medio de cultivo en un medio con 0,5 mM UE. Para uno de los pozos de infección simulada, también añadir 5 g / ml de ActD. Esto servirá como el control para la supresión de la transcripción, como ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente de ADN. Células Volver a la incubadora. </li><li> A los 13 hpi, lavar las células una vez que el ingenioh PBS y la cosecha por tratamiento con tripsina de las células. Lavar las células cosechadas tres veces con PBS que contenía 1 mM de EDTA (PBS-EDTA). </li></ol> Nota: Durante esta y las siguientes medidas, no centrifugar las células más rápidamente que 500 - 1000 xg para evitar la rotura celular. Centrifugar las células durante 1-2 min para sedimentar. Nota: Si se planea una inmunotinción superficie siguiendo la reacción de click, la cosecha utilizando una goma de policía o un raspador celular desechable en su lugar. <ol start="6"><li> Fijar las células mediante resuspensión en 1 ml de PFA al 4% y se incuba durante 30 min a TA. Consulte el paso 1.6 para obtener instrucciones sobre cómo preparar 4% PFA. </li><li> Lavar una vez con 1 ml de PBS-EDTA por pocillo. Proceda inmediatamente al paso 6. </li></ol> Nota: Es importante para proceder inmediatamente con la reacción de click, como el ARN degenera si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados de tiempo. Del mismo modo, si se realiza una vez cexperimento ourse, asegúrese de etiquetar, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo. 6. Haga clic en la reacción para detectar ARN marcado <ol><li> Permeabilizar las células mediante resuspensión en 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 en PBS. Incubar durante 10 min a TA. </li></ol> Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 6.1 a 6.3 deben estar libre de nucleasa. Nota: Si las células no hacen sedimentos correctamente durante este paso, aumentar el tiempo de centrifugación de 5 min. Comportamiento de sedimentación se mejorará una vez que las células se suspenden en tampón FACS (paso 6.4). <ol start="2"><li> Lavar una vez con 1 ml de PBS. </li></ol> Nota: No utilice EDTA en este paso, ya que esto quelar el Cu 2 + iones necesarios para la reacción de click. <ol start="3"><li> Resuspender las células en 200 l solución de tinción clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM de CuSO4, 200 nM azida marcado con colorante fluorescente [exclitación / máximo de emisión: 650/665 nm], ácido ascórbico 100 mM). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Preparar la solución de tinción clic fresco inmediatamente antes de este paso. Las soluciones madre de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO4, y ácido ascórbico 500 mM se pueden almacenar a 4 ° C. Sin embargo, descartar cualquier solución de ácido ascórbico que se ha convertido amarillo. Nota: Si las células se agrupan durante este paso, volver a suspender pipeteando arriba y abajo varias veces. Nota: Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que puede ser detectada por el citómetro de flujo. Nota: también preparar una muestra de las células infectadas que no están sometidos al procedimiento de tinción clic; éstos serán necesarios para la calibración del citómetro de flujo. Cualquier uso de la mitad de las células infectadas o incluir un adicional de infección así en el paso 5.2. Estos concélulas trol se immunostained en el paso 7.1. <ol start="4"><li> Lavar dos veces con tampón FACS (PBS que contenía 1 mM de EDTA y 0,5% (w / v) de BSA). </li></ol> Nota: Si no se desea inmunotinción de proteínas virales, las células se pueden analizar inmediatamente (continúe en el paso 8). 7. La inmunofluorescencia para detectar la expresión de las proteínas virales <ol><li> Resuspender las células en 200 l de anticuerpo primario (anti-RVFV) diluidos en tampón FACS (1:10.000) y se incuban durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li></ol> Nota: Como alternativa, este paso se puede realizar de O / N a 4 ° C en la oscuridad. Nota: También prepara una muestra de las células no infectadas que se sometieron al procedimiento de tinción clic, pero no se immunostained, éstos serán necesarios para la calibración del citómetro de flujo. Cualquier uso de la mitad de las células infectadas simuladas o incluir un bien no infectada adicional enpaso 5.2. Nota: Cuando la adaptación de este protocolo para su uso con un virus diferente, determinar la dilución óptima para su anticuerpo primario primero. <ol start="2"><li> Lavar las células dos veces en tampón FACS. </li><li> Resuspender las células en 200 l de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón conjugado con colorante fluorescente [excitación / emisión máxima: 495/519 nm]) diluido en tampón FACS (1:1.000) y se incuba durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li><li> Lavar las células una vez en tampón FACS. </li></ol> Nota: En este punto, las células pueden ser almacenadas O / N a 4 ° C en la oscuridad. 8. Adquisición de Datos <ol><li> Resuspender las células en 500 l de tampón FACS, transferencia en tubos de poliestireno de 5 ml y analizar utilizando un citómetro de flujo. Usa-12 MP células infectadas (ninguna reacción clic, sólo tinción anti-RVFV) y las células infectadas simuladas (haga clic reacción sólo) para calibrar el instrumento. </li></ol> Noe: Asegúrese de seleccionar fluoróforos que pueden ser detectados por el instrumento. Como referencia, las siguientes son las líneas de láser y conjuntos de filtros utilizados para la adquisición de los datos mostrados en esta publicación. Fluoróforo con un espectro de excitación / emisión de 495/519: Láser: 488 nm Filtrar: 530/30 Fluoróforo con un espectro de excitación / emisión de 650/665: Láser: 640 nm Filtrar: 670/20

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo proporcionado describe un método para medir el efecto de la infección viral en la transcripción de la célula huésped a través de la incorporación de uridina análogo de la UE en el ARN nacientes. Este método tiene varias ventajas sobre los métodos anteriores: es rápido, sensible, y no se basa en el uso de isótopos radiactivos. Además, el método puede ser adaptado para producir los datos cualitativos a través de microscopía de fluorescencia o de datos cuantitativos a través de citometría de flujo utilizando e...

<html> Tradicionalmente, la actividad transcripcional se ha medido mediante la incorporación de cualquiera radiactivo (3 H-uridina) 1 o halogenados (BRU) 2 nucleósidos en ARN nacientes. Estos análogos de uridina son absorbidos por las células, convertidos en uridina-trifosfato (UTP) a través de la vía de recuperación de nucleósido, y posteriormente incluidas en los ARN recientemente sintetizado. 3 H-uridina pueden ser detectados por autorradiografía, que puede llevar mucho tiempo, o de centelleo contando, que requiere un equipo especializado. Por otra parte, el uso de isótopos radiactivos puede no ser práctico en una serie de entornos de laboratorio, incluidos los laboratorios de alta contención de seguridad de la biotecnología. BrU se puede detectar a través de inmunotinción con anticuerpos anti-Bru, que pueden requerir la permeabilización áspera para garantizar el acceso del anticuerpo al núcleo o desnaturalización parcial de ARN, como la estructura secundaria del ARN podría ser un impedimento estérico para la unión de anticuerpos. _content &quot;&gt; El protocolo descrito aquí utiliza el Click recientemente desarrollado clic química 3 para medir la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12. química se basa en un cobre altamente selectiva y eficiente (I) catalizada por reacción de cicloadición entre un alquino y un resto azida 4,5. En este protocolo, ARN naciente en las células infectadas se etiqueta primero a través de la incorporación de uridina análogo de la UE. En un segundo paso, que se incorpora a la UE se detecta a través de la reacción con una azida fluorescente. Las principales ventajas de este método son (1) que no requiere el uso de isótopos radiactivos y (2) que no requiere la permeabilización dura o desnaturalización del ARN. Con un peso molecular de menos de 50 Da, el acceso de la azida fluorescente no esté impedido por el insuficiente estructura secundaria permeabilización o ARN. Además, los investigadores no están limitados en su elección de anticuerpos primarios cuando la combinación de la detección de ARN con una claseinmunotinción ical para las proteínas virales. Dos diferentes métodos se describen en este protocolo: uno para la visualización de la transcripción a través de microscopía de fluorescencia (pasos 1-4), y uno para la cuantificación de la transcripción a través de citometría de flujo (pasos 5-8). Ambos de estos métodos cosechadora etiquetado de ARN naciente con una inmunotinción intracelular de proteínas virales, lo que permite una correlación entre la actividad transcripcional y la infección viral en una base de celda por celda. Los autores han utilizado con éxito el protocolo que se describe aquí para determinar la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12 6, las células infectadas con diferentes MP-12 mutantes 7,8, 9, y las células infectadas con el virus Toscana (TOSV) 10. El protocolo descrito aquí puede ser fácilmente adaptado para el uso con diferentes virus y tiene el potencial de ser modificado para incluir la tinción de inmunofluorescencia de las proteínas virales o celulares específicas.

<table><tbody><tr><td>5-etinil-uridina</td><td>Berry Associates</td><td>PY 7563</td><td>se disuelve en DMSO para 100 mM de culata</td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos de 12 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina D (ActD)</td><td>Sigma</td><td>9415</td><td>se disuelve en DMSO para 10 mM de</td></tr><tr><td>stock Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA) </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>se disuelve en H2O para 100 mM de culata</td></tr><tr><td>DAPI </td><td></td><td>Sigma D-9542</td><td>se disuelve en H2O para 5 mg/ml de caldo</td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>azida fluorescente (Alexa Fluor 594-acoplada)</td><td>Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>azida fluorescente (Alexa Fluor 657-acoplada)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>se disuelve en H2O durante 500 mM </td></tr><tr><td>filtro de papel</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído </td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina (MW &#8805; 70000)</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>disolver en H2O para un caldo de 1,5 M, pH 8,5</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de fluorescencia Trypsin-EDTA Invitrogen <td>25200056p. ej. Citómetro</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de flujo Olympus IX71e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

usando click química para medir el efecto de la infección viral en el host-cell arn síntesis

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Muchos virus de ARN han desarrollado la capacidad para inhibir la transcripción célula huésped como un medio para eludir las defensas celulares. Para el estudio de estos virus, por lo tanto, es importante disponer de una manera rápida y fiable de medición de la actividad transcripcional en las células infectadas. Tradicionalmente, la transcripción se ha medido ya sea por la incorporación de nucleósidos radiactivos tales como 3H-uridina seguido por la detección mediante autorradiografía o recuento de centelleo, o la incorporación de análogos halogenados tales como uridina 5-bromouridina (BRU) seguido de la detección a través de inmunotinción. El uso de isótopos radiactivos, sin embargo, requiere un equipo especializado y no es factible en una serie de entornos de laboratorio, mientras que la detección de BrU puede ser engorroso y puede sufrir de baja sensibilidad. La química clic desarrollado recientemente, que consiste en una formación de triazol catalizada por cobre de una azida y un alquino, ahora proporciona un rápido y highly alternativa sensible a estos dos métodos. Haga clic en la química es un proceso de dos pasos en el que el ARN nacientes se etiqueta por primera incorporación de la uridina análogo 5-etiniluridina (UE), seguido por la detección de la etiqueta con una azida fluorescente. Estos azidas están disponibles como varios fluoróforos diferentes, lo que permite una amplia gama de opciones para la visualización. Este protocolo describe un método para medir la supresión transcripcional en células infectadas con el virus de la fiebre de Rift Valley (RVFV) cepa MP-12 usando química clic. Al mismo tiempo, la expresión de proteínas víricas en estas células se determina por inmunotinción intracelular clásica. Los pasos 1 a 4 detalle un método para visualizar la represión transcripcional a través de microscopía de fluorescencia, mientras que los pasos del 5 al 8 de detalle un método para cuantificar la represión transcripcional mediante citometría de flujo. Este protocolo es fácilmente adaptable para su uso con otros virus.

La proteína NE de RVFV (familia Bunyaviridae, género Phlebovirus) 11 inhibe la transcripción en general célula huésped a través de dos mecanismos distintos: (i) por secuestrante de la subunidad p44 del factor de transcripción basal TFIIH 11 y (ii) mediante la promoción de la degradación proteasomal de la p62 subunidad de TFIIH 6. El MP-12 cepa de la vacuna 13 RVFV se ha utilizado para los experimentos descritos en este protocolo desde el MP-12 cepa se puede m...

Este método describe el uso de la química clic para medir los cambios en la transcripción de la célula huésped después de la infección con el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) cepa MP-12. Los resultados se pueden visualizar a través de microscopía de fluorescencia cualitativamente o cuantitativamente obtenerse a través de citometría de flujo. Este método es adaptable para su uso con otros virus.

Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

El objetivo general del siguiente experimento es analizar la actividad transcripcional en células infectadas por virus. Primero, infecte las células 293 con el virus de la fiebre de Rift Valley, MP-12. Luego marque las células con el análogo de uridina 5-etinil-uridina, el cual se incorpora al ARN recién sintetizado. A continuación, acople el 5-etinil-uridina incorporado a una azida fluorescente para visualizar el ARN recién sintetizado. Los resultados obtenidos evaluaron las diferencias en la cantidad de ARN recién sintetizado entre células infectadas y no infectadas, basándose en microscopía fluorescente o citometría de flujo.A diferencia de la marcación con uridina tritiada o bromouridina, este enfoque de química click no requiere el uso de isótopos radiactivos. Asimismo, es más rápido y sensible que la inmunotinción con anticuerpos contra bromouridina. La idea para este método surge de nuestra necesidad de una forma rápida y confiable de medir la supresión de la transcripción en células infectadas con diferentes cepas del virus de la fiebre del Valle del Rift, MP-12.Coloque cubreobjetos redondos de 12 milímetros en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Luego siembre las células 293 en un milímetro de medio DMEM completo. Incube las células en un incubador humedecido a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante la noche. Según el diseño experimental, diluya el stock viral de manera que la infección de las células con MP-12 sea a una multiplicidad de infección de tres en un volumen total de 200 microlitros por pocillo. Asigne un pocillo como control no infectado y otro como control para la supresión transcripcional. Ahora, retire el medio de crecimiento. Añada el inóculo viral e incube durante una hora en el incubador humedecido. Aspire el inóculo. Añada un mililitro de medio de crecimiento fresco por pocillo e incube a 37 grados Celsius. A las 15 horas posteriores a la infección, reemplace el medio de crecimiento con medio que contenga un milimolar del análogo de uridina, 5-etinil-uridina. A uno de los pocillos infectados simuladamente, añada también cinco microgramos por mililitro del inhibidor de la síntesis de ARN dependiente del ADN, actinomicina-D. Regrese las células al incubador. A las 16 horas posteriores a la infección, retire el medio y lave los cubreobjetos una vez con un mililitro de PBS por pocillo. Fije las células con un mililitro de paraformaldehído al 4 % por pocillo. Enjuague una vez con un mililitro de PBS por pocillo.Para armar la cámara húmeda, forre el fondo de un recipiente de cultivo celular o una placa de Petri de 10 centímetros de diámetro con una película de parafina plástica. Forre el interior del borde del recipiente con toallas de papel húmedas. Para permeabilizar las células, agregue un mililitro de Triton X-100 al 0,2 % en PBS. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras tres lavados con PBS, transfiera los cubreobjetos a la cámara húmeda. Para la reacción de tipo "click" que permite detectar el ARN marcado, cubra cada cubreobjeto con 50 a 100 microlitros de solución de tinción "click" recién preparada. Incube durante una hora a temperatura ambiente y en la oscuridad.Añada un mililitro de PBS a los pocillos de una placa nueva de 12 pocillos y transfiera las laminillas a los pocillos. Lave dos veces más con un mililitro de PBS por pocillo. Para montar las células para microscopía de fluorescencia, coloque una gota de fluoromount-G sobre un portaobjetos. Sumerja la laminilla en agua, elimine el exceso de agua. Coloque la laminilla con la cara celular hacia abajo en la gota de fluoromount G y deje secar al aire durante cinco minutos.Según el diseño experimental, infecte las células 293 con MP 12 a una MOI de tres. Retire el medio de crecimiento y agregue el stock de virus diluido e incube durante una hora en un incubador humedecido a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Reemplace el inóculo con dos mililitros de medio de crecimiento fresco por pocillo e incube a 37 grados Celsius durante el tiempo óptimo para la marcación y recolección del virus. Luego, reemplace el medio de crecimiento con medio que contenga 0,5 milimolar de 5-etinil-uridina en uno de los pocillos mock infectados. Agregue también cinco microgramos por mililitro de actinomicina-D. Devuelva las células al incubador durante una hora. Tras un lavado con PBS, recoja las células mediante tripsinización. Lave las células recolectadas tres veces con PBS que contenga un milimolar de EDTA. Para fijar las células, resuspenda el precipitado en un mililitro de PFA al 4 % e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave una vez con un mililitro de PBS-EDTA por tubo. A continuación, permeabilice las células en 0,5 mililitros de Triton X-100 al 0,2 % en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave una vez con un mililitro de PBS libre de nucleasas. Para la reacción de tipo click, resuspenda el precipitado celular en 200 microlitros de solución de tinción click que contenga el colorante fluorescente. Si las células se agrupan, resuspenda mediante pipeteo. Incube durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave dos veces con tampón FACS.En este experimento, las células 293 fueron infectadas con MP-12 y un virus mutante de deleción que carece de la capacidad de suprimir la transcripción de la célula huésped. En las células infectadas simuladamente (mock), los núcleos aparecen de color rojo brillante debido a la transcripción en curso. Dado que las células solo fueron marcadas con EU durante una hora, seguida de fijación inmediata, la mayoría de los ARN permanecen en el núcleo. En contraste, cuando las células han sido tratadas con Actinomicina-D para inhibir farmacológicamente la transcripción, la fluorescencia roja de los núcleos se reduce notablemente. Esta fluorescencia también se reduce de manera similar cuando las células son infectadas con MP-12, pero no con el mutante de deleción, que no suprime la transcripción del huésped. Aquí, las células fueron transfectadas con ARNm sintetizado in vitro en lugar de infectarse con el virus vivo. La señal fluorescente roja en los núcleos indica que, en comparación con células no transfectadas, las células transfectadas con ARNm que codifica la proteína verde fluorescente no mostraron cambios en la actividad transcripcional. Solo la transfección con ARNm que codifica el factor de virulencia NSs del virus de la fiebre del Valle de Rift resulta en una disminución de la fluorescencia roja. Cuando se cuantifica, los datos de citometría de flujo obtenidos pueden representarse como diagramas de dispersión, con la señal fluorescente de la incorporación de EU en ARN recién sintetizado en el eje Y, y la señal de tinción anti-virus de la fiebre del Valle de Rift en el eje X. Las puertas de cuadrantes se establecieron de modo que la mayoría de las células infectadas simuladamente se ubicaran en el cuadrante superior izquierdo. La mayoría de las células tratadas con actinomicina-D se ubicó en el cuadrante inferior izquierdo, y la mayoría de las células infectadas se ubicó en la mitad derecha del gráfico. Cuando las células fueron infectadas con MP-12, el 81,5 % del total de células, o el 93 % de las células positivas para anti-fiebre del Valle de Rift, mostraron actividad transcripcional reducida. En contraste, cuando las células fueron infectadas con MP-12, clon 13-tipo, el 91,6 % del total de células, o el 97 % de las células positivas para anti-fiebre del Valle de Rift, mostraron actividad transcripcional comparable a la de las células infectadas simuladamente. Estos datos también pueden representarse en forma de un histograma para la etiquetación fluorescente de ARN mediante la incorporación de EU. A continuación, se pueden realizar otros métodos como la inmunotinción intracelular para visualizar la expresión de proteínas virales en estas células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la química click para visualizar la actividad transcripcional en células infectadas por virus, ya sea mediante microscopía fluorescente o mediante citometría de flujo.No olvide que trabajar con virus infecciosos puede ser extremadamente peligroso, por lo que debe tomar precauciones como usar equipo de protección personal adecuado y evitar la inhalación de aerosoles.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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