Name: Membrana-COLUMNA: una herramienta bioquímica para identificar las interacciones proteína-proteína de Proteínas de la Membrana En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende a identificar interacciones proteína-proteína de membrana in vivo mediante reticulación con formaldehído, purificación por afinidad y espectrometría de masas. Este método detecta interacciones transitorias de baja afinidad en diversos organismos.

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Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 y SFB940 a SH

Nota: La información detallada sobre los buffers que fija el Protocolo se encuentra disponible en la Tabla 1. 1. La fijación de las interacciones proteína-proteína por formaldehído entrecruzamiento en células vivas <ol><li> Para comenzar a preparar los medios de crecimiento, las soluciones madre y tampón P1 <ol><li> Preparar medio 500 ml: El medio debe ofrecer condiciones que apoyan la interacción entre la proteína cebo membrana y las proteínas de la presa. Además, un experimento debe realizarse en condiciones en que no se espera interacción (por ejemplo, sin entrecruzamiento). Nota: Se comparan las interacciones proteína-proteína en bacterias estresadas y no estresadas. Por lo tanto, preparamos 500 ml de medio Luria Bertani (LB) (Tabla 1) que complementamos con un agente de inducción de estrés (por ejemplo, NaCl 0,5 M) en un matraz Erlenmeyer de 2 l. Para el control, se utiliza medio normal LB con NaCl 0,17 M (pH 7,0). </li><li> Preparar tampón Tris (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0) y 0,1 M de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH de la solución de stock 8,0 (Tabla 1). </li><li> Prepare el tampón P1. Disolver la sacarosa a una concentración final de 0,5 M en tampón Tris. Esterilizar tampón P1 por filtración y almacenarlo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Se cultivan las células que expresan la proteína cebo membrana con un Strep-tag de fusión C-terminal de un vector. Inducir la expresión de proteínas de cebo de la membrana durante un tiempo suficiente. Nota: Se inducen la expresión de proteínas cebo membrana bacteriana en la fase temprana-log (a 600 = 0,3) mediante la adición de 250 l 1 M isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a 500 ml de medio (concentración final: 0,5 mM) . Para permitir una expresión suficiente, nos Incubar las bacterias hasta que la última fase-log (A 600 = 1,2). </li><li> Preparar para cada cultura dos vasos de centrífuga con un volumen mínimo de 300 ml cada uno y colocarlos en hielo. </li><li> Realice formaldehído entrecruzamiento. CAUCIÓN: El formaldehído es altamente tóxico Recomendamos trabajar bajo una campana de seguridad.. <ol><li> Transferir el recipiente de cultivo bajo una campana de seguridad. Dividir cada muestra en dos muestras, una omisión de reticulación (- X) y uno incluyendo el formaldehído de reticulación (X +). Añadir 4 ml de solución de formaldehído al 37% a la cultura de 250 ml hasta alcanzar una concentración final de 0,6%. </li></ol></li><li> La transferencia de los recipientes de cultivo de vuelta y hacer crecer las células durante 20 minutos más que antes. </li><li> Llene sus culturas en los tubos de centrifugación bajo una campana de humos seguridad. Recoger las células por centrifugación a 3000 xg durante 30 min. </li><li> Desechar el sobrenadante con la pipeta cuidadosamente bajo una campana de humos seguridad. Recoger tóxico sobrenadante que contiene formaldehído y disponer de ella adecuadamente. </li><li> Con el fin de alcanzar un rendimiento óptimo durante la preparación de proteína de membrana, preparar esferoplastos primero. Aquí, proporcionamos un protocolo para la formación de esferoplastos de bacterias Gram-negativos: <ol><li> Prepartampón E P2 (Tabla 1) a partir de polvo liofilizado. Disolver suavemente 2 mg de lisozima en 0,1 M EDTA, pH 8, en un tubo de 1,5 ml. Siempre prepare tampón P2 recién para el día del experimento. </li><li> Preparar tampón Tris con inhibidor de la proteasa (tampón P3). Para 10 ml de tampón Tris, añadir 0,1 ml de 1 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Tabla 1) a una concentración final de 10 mM. Utilice el tampón de inmediato, para garantizar el funcionamiento correcto de PMSF como inhibidor de la proteasa. </li><li> Resuspender los sedimentos celulares en 10 ml de Tris-tampón con inhibidor de la proteasa y la solución de la transferencia a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Añadir 1 ml de tampón P2 e incubar en hielo durante 30 min. </li><li> Recoger esferoplastos por centrifugación a 3000 xg durante 30 min y desechar el sobrenadante cuidadosamente. </li></ol></li><li> Incubar los pellets esferoplastos noche a -20 ° C. </li></ol> 2. Purificación de Strep-tag de proteínas de membrana (Bait) <ol><li> Coloque pellet esferoplasto en hielo. &lt;/ Li&gt; <li> Durante el tiempo de los pellets de esferoplastos se descongelan en hielo, preparar 10 ml de tampón P3 para cada preparación de esferoplastos. Disolver suavemente 1 mg de ADNasa I en 10 ml de tampón Tris. Añadir 0,1 ml de 1 M PMSF justo antes del uso. </li><li> Resuspender el sedimento en 6 ml de P3 recién preparada. Sonicar la muestra cuatro veces durante 1 min en hielo continuamente con 1 min de pausa entre cada ráfaga, con el fin de interrumpir esferoplastos. </li><li> Centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 10 min a restos celulares de la cosecha. Transferir el sobrenadante con una pipeta a un tubo de ultracentrífuga. </li><li> Pellet la fracción de membrana a 100.000 xg durante 30 min. Lavar el sedimento cuidadosamente en tampón Tris sin disolverla. Secar el tubo con un tejido de papel (por ejemplo pañuelos de papel). Evitar alterar el sedimento en cualquier momento. </li><li> Resuspender el sedimento (= membranas) con cuidado en 1 ml de tampón Tris. Utilice una alícuota de 20 l para determinar la concentración de proteína mediante el ensayo de BCA por ejemplo. En este paso, las membranas se pueden choque congelados en lilibras de nitrógeno y se almacenó a -80 ° C. </li></ol> 3. Purificación de Strep-tag Membrana Bait proteínas y SDS-PAGE <ol><li> Normalizar la concentración de proteína de la fracción de membrana a 5 mg / ml con tampón Tris. Tomar 2,5 ml de fracción de membrana (5 mg / ml) en un tubo de ultracentrífuga y añadir 0,25 ml de 20% de Triton X-100 para llegar a una concentración final de 2%, con el fin de solubilizar las proteínas de la membrana. Añadir una varilla de micro-magnético y se agita en hielo durante 1 h. Nota: Aunque en general tenemos buenos resultados utilizando Triton X-100 como detergente, puede ser útil para cambiar el detergente para la optimización. A este respecto, tenemos mejores resultados con los detergentes utilizados para la purificación funcional de la respectiva proteína cebo membrana. </li><li> Durante la realización de la etapa 3.1, preparar 50 ml de tampón W y 5 ml de tampón E a partir de (Tabla 1). Llenar hasta 10 ml 5x tampón W concentrado a 50 ml y añadir 150 l 20% de Triton X-100. <ol><li> Llenar 1 ml 5x buffeR E concentrado a 10 ml y añadir 30 l 20% de Triton X-100. Equilibrar una columna de flujo de 1 ml de Strep-Tactin gravedad SuperFlow con 8 ml de tampón de W. Nota: Es esencial para añadir el detergente que se usa para la solubilización en una concentración 10 veces por encima de la concentración micelar crítica (CMC) en cualquier tampón durante el procedimiento de purificación. </li></ol></li><li> Retire la varilla de micro-magnética de la muestra de solubilización y ultracentrífuga a 100.000 xg durante 30 min, para sedimentar la fracción de membrana insolubles. Eliminar el sobrenadante con una pipeta para su posterior purificación. </li><li> Cargar el sobrenadante a la columna. Ejecute la columna sólo con flujo por gravedad. Lavar la columna con 5 ml de tampón de W. Repita este paso de lavado 5x. </li><li> Eluir cebo proteínas de membrana con 1 ml de tampón E. Repita este paso de elución de 4x. </li><li> Concentrar las fracciones de elución 2, 3, y de 4 a 300 L con una unidad de filtro centrífugo. </li><li> Mezclar 200 l de cada muestra con 50 l 5x de SDS-PAGCarga de colorante E. Dividir cada preparado en 125 ml de alícuotas. Hervir una alícuota de cada preparación durante 20 min a 95 ° C, para revertir formaldehído enlaces cruzados. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos en el banco superior. </li><li> De carga 30 l de cada muestra a un solo carril de un gel de poliacrilamida-adecuado para inmunotransferencia. Use un marcador prestained peso molecular para la mejor orientación y ejecutar SDS-PAGE 10. </li></ol> 4. Análisis de inmunotransferencia para confirmar los compañeros de interacción <ol><li> Una vez paso 3.8 se completa, proteínas de transferencia a una membrana de nitrocelulosa por ejemplo semiseco. </li><li> Bloquear la membrana para evitar que el etiquetado no específica. Preparar tampón de bloqueo mediante el pesaje de albúmina de suero bovino (BSA) para lograr 3% en peso por volumen en solución salina tamponada con Tris suplementado con una concentración final de 0,05% de Tween-20 (TBS-T). Utilice un volumen suficiente de tampón de bloqueo para cubrir la membrana. Bloquear la membrana durante 1 hora a TA. </li><li> Diluir unand incubar el primer anticuerpo específico presa de proteínas como de costumbre. Utilice un anticuerpo unido a HRP como el segundo anticuerpo. </li><li> Desarrollar el inmunoblot utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia con una alta sensibilidad. Supervisar la señal utilizando un procedimiento de procesamiento de películas clásicas o equipos de imagen digital. </li></ol> 5. Los experimentos de alta resolución NanoLC-ESI-MS/MS identificar a los socios de interacción <ol><li> En caso de que ningún anticuerpo específico disponible para la presa de proteínas o compañeros de interacción desconocidos se debe identificar, utilizar la espectrometría de masas (MS) para la identificación. Con el fin de evitar la contaminación de la queratina, utilizar geles PREFABRICADOS DE HORMIGON para la separación de proteínas. </li><li> Silver Stain la SDS-PAGE usando un kit de tinción compatibles-MS de acuerdo con el protocolo del fabricante. Realice todos los pasos de tinción y lavado de tanques de vidrio. </li><li> Impuestos Especiales respectivas bandas y analizar estos por alta resolución LC / MS 9. </li></ol>

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Análisis COLUMNA membrana es un enfoque bioquímico que permite a uno para confirmar e identificar a este punto desconocidos compañeros de interacción de proteínas de membrana. COLUMNA membrana combina in vivo reticulación por formaldehído con la purificación de una proteína cebo membrana-Strep etiquetado. La combinación con inmunotransferencia facilita la confirmación de parejas de interacción predichas (Figura 2). Además, la combinación con el análisis de MS permite la identificación de los so...

Para entender la función de una proteína que es esencial conocer sus compañeros de interacción. Varias técnicas clásicas están disponibles para la identificación de parejas de interacción de proteínas solubles. Sin embargo, estas técnicas no son fácilmente transferibles a proteínas de la membrana debido a su naturaleza hidrófoba 4. Para superar esta limitación, hemos desarrollado la membrana Strep-proteína interacción experimento (Membrana-COLUMNA) 6. Se basa en el método de columna vertebral, que era sólo es adecuado para proteínas solubles 7. Beneficios de membrana-espina dorsal de dos ventajas de la formaldehído agente de reticulación: primero, el formaldehído pueden penetrar fácilmente las membranas y por lo tanto genera una instantánea precisa de la interactoma de una célula viva 8. En segundo lugar, formaldehído enlaces cruzados pueden revertirse mediante ebullición 9. Aquí, estas dos ventajas se utilizan para identificar no sólo los IBP permanentes pero también transitorios de prot membranains 6. En breve, un Strep-etiqueta se fusiona al C-terminal de la proteína cebo integral de membrana. Las células que expresan la proteína cebo de membrana se incuban con formaldehído que los enlaces cruzados se aprovechan de las proteínas a la proteína cebo membrana (Figura 1). No son necesarias modificaciones de las proteínas de la presa. A continuación, la fracción de membrana se prepara. Por lo tanto, las proteínas de membrana se solubilizan por tratamiento con detergente y cebo proteínas son co-purificadas con sus proteínas presa utilizando la purificación por afinidad. Posteriormente, la reticulación se invierte por ebullición, y el cebo y sus proteínas presa co-eluidos se separan por SDS-PAGE. Finalmente, las proteínas presa pueden ser identificados por análisis de inmunotransferencia o espectrometría de masas.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehído</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>No debe tener más de un año de antigüedad</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit de ensayo de proteínas</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Varilla micromagnética</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 mm de longitud, 2 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>detergente estándar para solubilización</td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-maltósido</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>, el mejor detergente para solubilze CpxA</td></tr><tr><td>1 ml Strep-Tactin superflujo columna de flujo por gravedad</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Juego de tampones de purificación de proteínas Strep-tag</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>Contiene tampón W y tampón E</td></tr><tr><td>Filtro centrífugo Amicon Ultra-4</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscente</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Kit de tinción de plata</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireSilver Kit de tinción</td><td>Proteome Factory</td><td>P-S-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membrana-columna: una herramienta bioquímica para identificar las interacciones proteína-proteína de proteínas de la membrana en vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Las proteínas de membrana son esenciales para la viabilidad celular y son, por tanto, importantes objetivos terapéuticos 1-3. Desde que funcionan en los complejos 4, los métodos para identificar y caracterizar sus interacciones son necesarias 5. Con este fin, hemos desarrollado el Strep-proteína de membrana experimento de interacción, denominada membrana-COLUMNA 6. Esta técnica combina en vivo entrecruzamiento reversible mediante el formaldehído reticulante con la purificación por afinidad de una proteína de membrana de cebo-Strep etiquetado. Durante el procedimiento, las proteínas presa reticulados son co-purificadas con la proteína cebo membrana y posteriormente separados por ebullición. Por lo tanto, dos grandes tareas se pueden ejecutar en el análisis de las interacciones proteína-proteína (PPI) de las proteínas de membrana mediante membrana-COLUMNA: en primer lugar, la confirmación de un compañero de interacción propuesto por inmunotransferencia, y en segundo lugar, la identificación de nuevos socios de la interacción mediante el análisis de espectrometría de masas . Además, incluso lOW afinidad, IBP transitorios son detectables por esta técnica. Por último, la Membrana-ESPINA es adaptable a casi cualquier tipo de célula, por lo que es aplicable como herramienta de detección de gran alcance para identificar los IBP de proteínas de membrana.

Análisis COLUMNA membrana permite la co-purificación de proteínas de membrana y proteínas asociados transitoriamente interactúan. El co-purificación se logra mediante el uso de la formaldehído agente de reticulación. Dos parámetros son fundamentales para evitar inespecíficos enlaces cruzados: la concentración de formaldehído y el tiempo de reticulación. El uso suficiente, pero no excesiva de formaldehído puede ser fácilmente controlado por inmunotransferencia. Complejos de proteínas reticuladas-formaldehído se pueden se...

Un enfoque bioquímico se describe para identificar in vivo interacciones proteína-proteína (PPI) de proteínas de membrana. El método combina la reticulación de proteínas, purificación por afinidad y espectrometría de masas, y es adaptable a casi cualquier tipo de célula u organismo. Con este enfoque, incluso la identificación de los IBP transitorios se hace posible.

Membrana-COLUMNA: una herramienta bioquímica para identificar las interacciones proteína-proteína de Proteínas de la Membrana En Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar in vivo las interacciones proteicas de las proteínas de membrana a través de un experimento de interacción de proteínas estreptocócicas de membrana o columna vertebral de membrana. Esto se logra mediante reticulación in vivo utilizando el reticulante reversible para formaldehído. El segundo paso es purificar la proteína de cebo de membrana marcada con estreptococos junto con las proteínas de presa reticuladas.A continuación, la reticulación se invierte mediante ebullición. El paso final es la separación de la proteína de cebo de membrana y las proteínas de presa copurificadas mediante sulfato de sodio do desalinización, electroforesis en gel de poliacrilamida o página SDS. En última instancia, se utiliza el análisis de inmunotransferencia y espectrometría de masas para identificar las proteínas de la presa, lo que permite analizar las interacciones de las proteínas de membrana.Soy Sabina Hunka y hoy os enseñaremos la tecnología de membrana de la columna vertebral. La principal ventaja de esta tecnología sobre los métodos existentes, como el co IP, es que permite detectar incluso interacciones proteicas transitorias o de baja afinidad. Kline Shaana le demostrará el procedimiento.Ella es una de mis estudiantes de doctorado que desarrolló el protocolo Para comenzar este procedimiento, el cultivo de células bacterianas que expresan la proteína de cebo de membrana con una fusión de etiqueta de estreptococo terminal C induce la expresión de proteínas de cebo de membrana en la fase logarítmica temprana mediante la adición de 0,5 milimolares IPTG a 500 mililitros de medio para permitir una expresión suficiente. Incubar las bacterias hasta la fase logarítmica tardía. Prepárese para realizar la reticulación de formaldehído bajo una campana de gases de seguridad debido a la toxicidad del formaldehído.Transfiera el recipiente de cultivo debajo de una campana de gases de seguridad. Divida cada muestra en dos muestras, una que omita la reticulación y otra, que incluya la reticulación de formaldehído. Agregue cuatro mililitros de solución de formaldehído al 37% a un cultivo de 250 mililitros para alcanzar una concentración final de 0.6%Transfiera los recipientes de cultivo nuevamente y haga crecer las células durante 20 minutos más como antes.A continuación, llene los cultivos en tubos de centrífuga bajo una campana extractora de seguridad. Recoja las células por centrifugación a 3000 veces G durante 30 minutos. Eliminar el sobrenadante por decantación, en primer lugar, y en segundo lugar por succión.Usando una pipeta debajo de una campana de gases de seguridad, deseche los sobrenadantes y elimine adecuadamente el sobrenadante que contiene formaldehído tóxico. Para alcanzar un rendimiento óptimo durante la preparación de proteínas de membrana, primero, prepare las placas de Sphero para comenzar a disolver suavemente dos miligramos de lisozima en 0,1 molar E-D-T-A-P-H ocho en un tubo de 1,5 mililitros. Para preparar el tampón P dos, que debe hacerse fresco el día del experimento.Resus suspende los gránulos celulares en 10 mililitros de tampón de sacarosa tris recién preparado con inhibidor de la proteasa y transfiere la solución a un tubo cónico de 15 mililitros. Añadir un mililitro de tampón P dos e incubar en hielo durante 30 minutos. Recoja las placas de Sphero por centrifugación a 3000 veces G durante 30 minutos y deseche el sobrenadante.Incubar cuidadosamente los gránulos de Sphero plast durante la noche a menos 20 grados centígrados trabajando sobre hielo. Resus suspende el paladar Sphero Plast en seis mililitros de tampón recién preparado. P tres.Sonicar la muestra cuatro veces durante un minuto de forma continua en hielo con una pausa de un minuto entre cada ráfaga. Con el fin de interrumpir el Sphero plast centrífuga la muestra a 10.000 veces G durante 10 minutos para recoger los restos celulares después de la centrifugación. Transfiera el sobrenadante con una pipeta a un tubo de ultracentrífuga.Granular la fracción de membrana a 100.000 veces G durante 30 minutos. Lave cuidadosamente el pellet en tampón tris de 20 milimolares pH ocho sin disolverlo. A continuación, conduzca un tubo con un pañuelo de papel evitando perturbar el pellet en cualquier momento.Para resuspender el pellet que contiene las membranas, agregue un mililitro de tris, tampone una varilla micromagnética y vuelva a suspender el pellet, en parte con una pipeta revuelva en hielo durante una hora, use una alícuota de 20 microlitros para determinar la concentración de proteínas. Normalizar la concentración de proteínas de la fracción de membrana a cinco miligramos por mililitro con pipeta tampón tris 2,5 mililitros de la fracción de membrana a un tubo de ultracentrífuga y añadir 0,25 mililitros de Triton X 100 al 20% para alcanzar una concentración final del 2% con el fin de solubilizar las proteínas de membrana. Luego agregue una varilla micromagnética y revuelva con hielo durante una hora.Equilibre una columna de flujo de gravedad de superflujo de actina estreptocócica de un mililitro con ocho mililitros de tampón. W. Retire la varilla micromagnética de la muestra de solubilización y ultracentrífuga a 100, 000 veces G durante 30 minutos para granular la fracción de membrana insoluble después de que se complete la ejecución, retire el estado con una pipeta. Para una mayor purificación, aplique el sobrenadante a la columna utilizando el flujo por gravedad.Lavar la columna con cuatro mililitros de tampón W Repitiendo este paso de lavado cinco veces. Eluir las proteínas del cebo de membrana con un mililitro de tampón E.Repita esta elución. Paso cuatro veces, concentra las fracciones aludidas.De dos, tres y cuatro a 300 microlitros con una unidad de filtro centrífugo. Mezcle 200 microlitros de cada muestra con 50 microlitros de cinco tintes de carga de página como DS. Divida cada preparación en alícuotas de 125 microlitros antes de hervir.Una alícuota de cada preparación durante 20 minutos a 95 grados centígrados para revertir los enlaces cruzados de formaldehído. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos en el banco. Cargue 30 microlitros de cada muestra en un solo carril de un gel de poliacrilamida adecuado para inmunotransferencia.Utilice un marcador de peso molecular preteñido para obtener la mejor orientación y realice como página DS después de la transferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa. Bloquee la membrana para evitar el etiquetado inespecífico durante una hora. A temperatura ambiente, diluir e incubar el anticuerpo primario específico de la proteína de presa.Utilice un anticuerpo ligado a HRP como anticuerpo secundario y desarrolle el inmunoblot utilizando un kit de detección quimioluminiscente de alta sensibilidad. Monitoree la señal utilizando un procedimiento clásico de procesamiento de película o equipo de imagen digital. Si no se dispone de un anticuerpo específico para la presa, la proteína o una interacción desconocida, se deben identificar las parejas.Utilice la espectrometría de masas o MS para la identificación. Tiñe de plata la página SDS con un kit de tinción compatible con MS. De acuerdo con el protocolo del fabricante, realice todos los pasos de tinción y lavado en tanques de vidrio.Extirpar las bandas respectivas antes de analizarlas mediante LCMS de alta resolución como proteína de cebo. Se utilizó la proteína de membrana integral CPXA de VISIA coli. CPXA es una quinasa sensora y consta de un dominio sensor terminal N con dos dominios transmembrana que integran un dominio sensor citoplasmático extra grande y un dominio catalítico citoplasmático terminal C altamente conservado.Después de la estimulación, CPXA activa su regulador de respuesta afín, CPXR activado por CPXR se difunde para mediar la respuesta de la columna vertebral de la membrana. La etiqueta estreptocócica se fusionó con el extremo C de CPX. Un análisis de la membrana de la columna vertebral revela que el estreptococo CPXA se entrecruzó con otras proteínas o complejos de proteínas indicado por un frotis en la muestra tratada con formaldehído revelada.Sin tratamiento con formaldehído, este frotis está ausente. Además, una interacción proteica directa del estreptococo CPXA con su proteína reguladora de respuesta afín CPXR como proteína presa solo es detectable en presencia de formaldehído. Apoyando la especificidad de la reticulación de formaldehído con tinción de plata.Es evidente una banda que es específica para la muestra hervida. La flecha marca una banda que fue analizada por MS. Análisis y que confirmó a CPXR como el socio de interacción de CPXA. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar la purificación de afinidad pro y reticulación en espectrometría de masas para identificar socios de interacción de proteínas de membrana.

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