Name: Luminométricos levadura y Xenopus ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprende a examinar la mecanosensibilidad del canal iónico TRPV4 usando levaduras transgénicas con luminometría de aequorina y ovocitos de Xenopus con técnicas de electrofisiología de voltaje y patch clamp.

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Nos gustaría dar las gracias a Andrea Kremsreiter por su excelente asistencia técnica. El trabajo en nuestro laboratorio es apoyado por el NIH GM096088 y el Vilas Confianza de la Universidad de Wisconsin - Madison.

1. Métodos luminometría Levadura Utilice cepa BYYT de Saccharomyces cerevisiae. Es un yvc1-tok1-derivado de BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transformar las células con los plásmidos pEVP1/Aeq Aequorina que expresan-Leu seleccionable y la rata TRPV4-expresión de plásmido-ura seleccionable p416GPDV4, como se describe en Batiza et al. 26 y Loukin et al. 24 Use métodos estándar de la construcción del plásmido y la transformación 27 . La cepa de levadura y plásmidos están disponibles bajo petición. <ol><li> Cultura 2 ml de células de levadura durante toda la noche a fase de post-logarítmica en un agitador 30 ° C en Leu-URA-&quot;DCD&quot; medio de abandono 28 (una variante sulfato-empobrecido del medio de CMD-Leu-ura 29), suplementado con sorbitol 1M . Inocular 200 l de estos cultivos en 1,8 ml de medio fresco suplementado con 2 mM de la Luciferin coelenterazina. Crecer en la oscuridad a temperatura ambiente durante otras 24 horas sin agitación. </li><li> Medir la osmolaridad de la cultura (típicamente a 1400 mOsM) y otras soluciones (a continuación) utilizando un osmómetro de presión de vapor. </li><li> Alícuota de 20 l de cultivo fresco en un tubo luminómetro 12 mm para un solo tubo luminómetro. </li><li> Para el choque hipotónico, añadir 200 l de una solución, que contiene 25 mM de NaEGTA (pH 7,2) o nombres (pH 7,2) y NaCl 500-100 mM, (osmolaridad total de 1,200-400 mOsM) dependiendo del grado de descarga deseada. Monitorear continuamente la luminiscencia antes y por lo menos 120 segundos después de la downshock osmótica, sólo interrumpido por la breve operación de dilución. Registro de salida luminómetro en un ordenador de escritorio como unidades relativas de luminiscencia (RUL). </li></ol> Aunque no para el estudio de TRPV4 transgénico, hemos utilizado una variante del protocolo anterior en un sistema automatizado para examinar las respuestas de un gran número de cepas de levadura. Estudio of las respuestas a la hipo-30 o hiperosmóticos 31 estímulos del deletome levadura (la colección de 4906 de la levadura deletants de un solo gen) utilizando un luminómetro de microplacas y analizadas con el software correspondiente ha sido un éxito. 2. y 3. Métodos de ovocitos Electrofisiología Electrofisiología utiliza métodos básicos 32. PCR amplificar el marco de lectura abierta de tipo salvaje o mutante TRPV4 utilizando alta fidelidad PfuUtra polimerasa e integrado en pGH19 33. Esto implica una inserción precisa de la ORF entre los 5 &#39;y 3&#39; UTRs de el gen β-globina de Xenopus y aguas abajo de un promotor de la ARN-polimerasa de T7. Linealizar el constructo de aguas abajo de la UTR 3 &#39;y utilizado como plantillas en una reacción in vitro de la polimerasa de ARN de T7 en. Utilizar técnicas de biología molecular estándar 34. Utilice ovocitos V-VI de la etapa de X. laevis. La cría de animales, ovariecto parcialmi, la eliminación del sobre defolliculation y vitelina siga los procedimientos estándar 32,33,35. Inyectar 2-40 ng de ARNc por oocito solución usando un microinyector automática Drummond Nanoinject II. Inyectar ~ 30 ovocitos por cada conjunto de experimentos. Después de la inyección de ARNc de TRPV4-, incubar los ovocitos en el medio ND96 con gentamicina (100 mg / ml) y 1 M rojo de rutenio 14. 2. Dos Electrodo abrazadera de voltaje <ol><li> Tire de borosilicato pipetas de registro de vidrio de precisión desechables Micropipetas 100 l individualmente con un extractor de pipeta. </li><li> Tire tanto voltaje de medición y electrodos de pipeta corrientes inyección se tiran a tener una abertura punta de ~ 1 m de diámetro. </li><li> Electrodos de reposición con 2 M KCl resultante en 0,1-0,2 resistencia mΩ. Montarlos en Headstages HS2A, que junto con una abrazadera de baño virtual con conexión a tierra VG-2Ax100, están conectados a una interfaz GeneClamp 500 amplificador a través de un digitalizador Digidata 1440. Adquirir<html> datos utilizando el software pClamp10. </li><li> Coloque el ovocito para ser probado en un baño de 1 ml en una cámara de plástico fabricada montada en el escenario de un microscopio de disección con 20 aumentos. La solución del baño es virtual a tierra por un puente de agar 3 M KCl y un cable de plata clorada colocado cerca del ovocito y conectado a una etapa de tierra virtual VG-2A. </li><li> Construir la cámara para la perfusión continua con tubos de plástico como de entrada y salida de solución. Conectar el tubo de entrada está conectado a un sistema de perfusión fabricada, que es un múltiple de seis conchas 50 ml de jeringa, cada uno lleno con una solución diferente. Tipos de alimentación por gravedad de cualquier solución particular se controla para ~ 2-3 ml / min utilizando &quot;Keck&quot; abrazaderas de rampa en los tubos. </li><li> Montar los dos electrodos con sus Headstages sobre micromanipuladores. Realice las penetraciones de electrodo del ovocito por micromanipulación. </li></ol> 3. Patch Clamp Examen de directo mecanosensibilidad &quot;&gt; Los métodos básicos de patch clamp incluyendo la preparación de la pipeta, la formación GΩ-sello, y formación de en-célula o modos extirpados son aquellos en los Hamill et al. 36 y Conn 32. <ol><li> Llenar pipetas de vidrio de borosilicato con una abertura ~ 1 m de diámetro en la punta (número de burbujas 5-6) con 98 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, y 10 mM de K +-HEPES, pH 7,2. </li><li> Coloque la pipeta de pinzamiento zonal a través de un tubo de plástico a una jeringa de 5 ml y por medio de una junta en T, también a un manómetro. Utilice un ordenador para manejar tanto el electrodo y las salidas de manómetro. Adquirir datos a 10 kHz, y luego jugar de nuevo a través de un filtro de ocho polos Bessel a 1 kHz para el análisis. </li><li> Diferentes parches pueden ser extirpados de la misma ovocito repetidamente. Esta práctica hace que el análisis de la actividad molecular de TRPV4 más eficiente y confiable. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Como se dijo en la introducción, los métodos comúnmente utilizados para estudiar las funciones TRPV4 veces resultaron en inconsistencias y controversias. Los dos conjuntos de métodos descritos aquí ofrecen algunas ventajas y pueden complementar los métodos existentes. Mientras describimos sólo los estudios sobre TRPV4, los métodos pueden ser extendidos para estudiar otros canales iónicos también. 1. Métodos luminometría Levadura Levadura en ciernes tiene una Ca <su...

TRP (potencial de receptor transitorio) comprenden siete subfamilias de canales de cationes que sirven funciones sensoriales 1,2. En los mamíferos, TRPV, la subfamilia vanilloid de TRP, tiene seis variedades. TRPV4 (tipo 4) 3,4 responde al calor, ciertos productos químicos, hinchazón osmótica, o esfuerzo de corte. El gen TRPV4 se aisló repetidamente por el candidato-gen y / o clonación de expresión 5-8. El último método siguió la respuesta del producto génico a la hipo-osmolaridad. TRPV4 se expresa en casi todos los órganos y funciones en el desarrollo, fisiología, o patología de muchos tipos de células dispares 3,4. Llama la atención son las mutaciones TRPV4 autosómicos dominantes humana&gt; 50, provocando neuropatías periféricas y / o displasias esqueléticas (anormalidades en el desarrollo del esqueleto) 9-11. Oscilan Las displasias esqueléticas de leves tipo brachyomia 3 (tipo-3 enanismo), displasia espondilometafisaria tipo Kozlowski, a Severe displasias, algunas causando la muerte neonatal o embrionario. Aunque parecen posibles toda clase de mecanismos, ninguno explica la diversidad, la complejidad, variabilidad y superposiciones ocasionales de estas enfermedades 4. Al igual que otros canales TRP 1, TRPV4 es un tetrámero. En rata o TRPV4 humana, cada subunidad está constituida por 871 residuos. Su elemento central es el de seis hélices transmembrana (S1-S6), lo que probablemente se disponen de una manera similar a canales de K + dependientes de voltaje. Hay, S1 a S4 formar un dominio periférica y la S5 y S6 forman el dominio de poro de permeación. Entre S5 y S6 de TRPV4 es una hélice de poro corto seguido por la secuencia de LDLFKLTIGMGDL, cuatro de los cuales presumiblemente convergen para formar el filtro de cationes. El segmento citoplasmático N-terminal de 470 residuos contiene 6 repeticiones de anquirina, conocidos por unirse a proteínas o ligandos pequeños. El segmento citoplásmico 152-residuo C-terminal incluye una secuencia de unión a calmodulina-entre otros sitios posibles que se unen OTsus elementos 3. TRPV4 es un canal catiónico que excluye esencialmente aniones 1. Aunque su función fisiológica es para transducir estímulos a Ca 2 + afluencia, que también es permeable a otros cationes con una secuencia de permeabilidad Eisenman IV, favoreciendo divalente a un Ca P: P Na ~ 7 12. Conductancia de un canal rectifica a ~ 90 pS hacia afuera y hacia adentro ~ 40 pS 6,13,14. Heteróloga expresada actual (abajo) se puede activar por hipo-osmótica hinchazón, tensión de corte o calor 15. También es activado por los ácidos grasos poliinsaturados 16,17 y el éster de forbol sintética 4αPDD 18. En la actualidad, el agonista más potente es GSK1016790A 19 y antagonista es GSK2193874, eficaz en 10 -9 a 10 -8 M 20, ambas descubiertas por el alto rendimiento, la pequeña pantalla-molecular. Dos áreas clave de la investigación TRPV4 permanecen confusos: (1) A pesar de que TRPV4 es estudiado en gran medida por su mechanosensitivity, su base molecular es controversial. Un modelo describe hipo-osmolaridad de alguna manera activa la fosfolipasa A2 (PLA2) para producir el ácido graso poliinsaturado (PUFA) de ácido araquidónico (AA), que se convierte en ácido epoxieicosatrienoicos (EET) por una epoxigenasa, y la unión de EET activa TRPV4 16, 17. Sin embargo, sí TRPV4 se ha demostrado que responden directamente a estiramiento de la membrana 14 (a continuación), que proporciona una explicación más simple. (2) Las patologías mutantes TRPV4 son desconcertantes. En la base, es necesario saber si las enfermedades se deben a la pérdida, la reducción o el aumento de las actividades de canal. Incluso en este caso, la literatura está lejos de ser clara. Aunque se reportaron múltiples alelos esquelético-displasia tener actividades más altas, (ganancia de función, GOF) 4,21, varios se informó que han reducido las actividades (pérdida de la función, LOF) 10,22. Un estudio sistemático de 14 alelos que los ha encontradotodas las mutaciones se GOF (continuación) 23. La afirmación de que algunos son LOF parece contradecir el fenotipo de TRPV4-/ - ratón knockout, que son viables o fértiles, con sólo pequeños defectos, a pesar de una pérdida completa de la función TRPV4. Una parte de estas controversias tiene origen metodológico. Los laboratorios usan diferentes métodos, o variantes de un método, y emplean diferentes normas de juzgamiento. Por lo general, TRPV4 se expresa transitoriamente en células de mamífero en cultivo (HEK, CHO, HeLa) y el surgimiento de interior [Ca 2 +] sobre agonista o estimulación hipotónica está registrada con el colorante fluorescente sensible a Ca + 2, Fura-2. El exceso de confianza en este ensayo fluorométrico ha sido criticada 1. El nivel de expresión en diferentes poblaciones, necesita ser controlado y documentado la distribución en el mismo, así como la concentración de colorante eficaz,. Más fiable es los exámenes electrofisiológicos directos. Incluso esto, como commonly practica, también no está exenta de problemas. Debido a que los niveles de expresión en células cultivadas individuales son difíciles de controlar, las corrientes de células enteras tienen grandes variaciones. Además, puesto que las corrientes son pequeñas, las estadísticas fiables tendrán que depender de muestras de gran tamaño, a menudo no es práctico. Rara vez se han realizado los exámenes Patch-clamp. Algunas de estas grabaciones muestran racimos de estallidos de actividad que componen la evaluación estadística desafiante 16,17. Para comprender mejor el mechanosensitivity molecular, se han desarrollado dos sistemas adicionales para examinar TRPV4. (1) Para aislar TRPV4 lejos de sus socios de mamíferos habituales, hemos expresado TRPV4 rata en ciernes de levadura 24. La expresión funcional de TRPV4 en este contexto evolutivamente distantes mostró que aún podría responder a la fuerza osmótica sin sus socios habituales. Debido a que la levadura no hace PUFAs como AA o EET, y su genoma no tiene genes PLA2 o epoxigenasa, esta expression también muestra que no se requieren para TRPV4 para detectar la fuerza. Tener TRPV4 en los eucariotas biológicamente más susceptibles moleculares también permite la manipulación eficiente de avanzar-o revertir-genéticos 25. (2) Para los análisis biofísicos en profundidad de TRPV4, expresamos TRPV4 en ovocitos de Xenopus. A diferencia de las células cultivadas, que producen sub-nA a nA (10 -10 a 10 -9 A) corrientes, un oocito expresa corrientes en μA de (10 -6 a 10 -4 A). Señal mucho más grande sobre el ruido permite una mejor cuantificación y la comparación con más confianza. TRPV4, así expresado, también se puede examinar como moléculas individuales utilizando un patch clamp. Un único ovocito permite el muestreo de parches repetido, de nuevo haciendo una cuantificación más fiable. Estos estudios mostraron que la propia canal TRPV4 directamente puede ser activado por fuerza de estiramiento de la membrana 14. Los análisis también mostraron que 14 alelos representativos esquelético-displasia son todas las mutaciones con ganancia de función. Además, el degree de este constitutiva Ca 2 + fugas es paralelo a la gravedad de las enfermedades esqueléticas 23. Debido a su novedad y utilidad, los procedimientos detallados de estos dos métodos se ensamblan aquí para permitir repeticiones en futuras investigaciones sobre TRPV4 o canales similares.

<table><tbody><tr><td>Osmómetro de presión de vapor</td><td>Wescor</td><td>Wescor 5500</td><td>Logan, UT, EE. UU</td></tr><tr><td>. Luminómetro de un solo tubo Sirius&nbsp;</td><td>Titertek-Berhold</td><td>Sirius</td><td>Huntsville, LA, EE. UU.</td></tr><tr><td>Luminómetro de microplaca</td><td>Titertek-Berthold</td><td>Mithras LB940</td><td>Huntsville, LA, EE. UU.</td></tr><tr><td>Software de luminometría</td><td>Titertek-Berthold</td><td>MikroWin2000</td><td>Huntsville, LA, EE. UU.</td></tr><tr><td>Pinza de parche y software</td><td>Axon Instrument</td><td>HS2A headstage, VG-2Ax100 abrazadera de baño virtual con conexión a tierra, amplificador GeneClamp 500, digitalizador digidata 1440, Software pClamp10</td><td>Union City, CA, EE. UU.</td></tr><tr><td>Manómetro</td><td>Bio-Tec</td><td></td><td>Winooski, VT, EE. UU.</td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Modelo P-97</td><td>Novata, CA, EE. UU</td></tr>. <tr><td>Microinyector</td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoinject II</td><td>Broomall, PA, EE. UU.</td></tr><tr><td>Luciferina celenterazina</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Carlsbad, CA, EE. UU</td></tr>. <tr><td>ARN polimerasa T7 reacción</td><td>Ambion</td><td>mMessage mMachine</td><td>Austin, TX, USA</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rojo de rutenio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipetas&nbsp;</td><td>Micropipetas Drummond</td><td>de 100 microlitros</td><td>Broomall, PA, EE. UU</td></tr><tr><td>. PfuUtra polimerasa de alta fidelidad&nbsp;</td><td>Stratagene</td><td></td><td>La Jolla, CA, Estados Unidos</td></tr></tbody></table>

luminométricos levadura y xenopus ovocitos electrofisiológicos exámenes del mecanosensibilidad molecular de trpv4

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potenciales familia vanilloid, tipo 4) es ampliamente expresado en tejidos de vertebrados y se activa por varios estímulos, incluyendo por fuerzas mecánicas. Ciertas mutaciones causan TRPV4 ósea hereditaria compleja o patologías neuronales en humanos. De tipo salvaje o mutante TRPV4 los transgenes se expresan comúnmente en células de mamífero cultivadas y se examinaron por Fura-2 fluorometría y por los electrodos. En cuanto al mecanismo de mechanosensitivity y las bases moleculares de las enfermedades, la literatura actual es confuso y controvertido. Para complementar métodos existentes, se describen dos métodos adicionales para examinar las propiedades moleculares de TRPV4. (1) Rata TRPV4 y un transgén aecuorina se transforman en levadura en ciernes. Un choque hipo osmtic de la población transformante produce una señal luminométrica debido a la combinación de aecuorina con Ca 2 +, lanzado a través del canal TRPV4. Aquí TRPV4 está aislado de sus proteínas asociadas mamíferos habitualesy revela su propio mechanosensitivity. (2) ARNc de TRPV4 se inyectó en oocitos de Xenopus. Después de un período de incubación adecuado, la corriente TRPV4 macroscópica se examinó con una pinza de voltaje de dos electrodos. El aumento de la intensidad después de la retirada de osmoticum inerte del baño de los ovocitos es indicativa de mechanosensitivity. Los microamperios (10 -6 a 10 -4 C) Las corrientes de ovocitos son mucho más grandes que las subnano a nanoamperio (10 -10 a 10 -9 C) Las corrientes de células cultivadas, produciendo cuantificaciones más claras y las evaluaciones de más confianza. Corrientes microscópicas que reflejan las actividades de proteínas de los canales individuales también pueden ser directamente registrados bajo una grapa de parche, en el de las células o el modo extirpado. Lo mismo oocito ofrece varias muestras de parches, lo que permite la replicación de mejores datos. Succiones aplicadas a los parches pueden activar TRPV4 evaluar directamente mechanosensitivity. Estos métodos también deben ser útiles en el estudio de otros tipos de canales TRP.

En un experimento típico luminometría, una gama de 400-1,200 mOsM choques hipotónicas abajo se logra mediante la adición de 200 l de soluciones de choque de diferente osmolaridad baja a 20 l de cultivo a 1.400 mOsM. La actividad TRPV4 es evidente cuando el RLU de la experimental se comparó con la de dos controles negativos: células de levadura transformadas con el plásmido p416GPDV4 vacía o una que contiene el gen TRPV4 con una mutación en el filtro de iones (Figura 1) 24. <p cla...

Para complementar los métodos comúnmente utilizados para el estudio de TRPV4, dos métodos se describen: Su mechanosensitivity puede ser estudiado por Ca 2 +-luminometría aecuorina en la levadura transgénica a partir del desafío hipo-osmótica. También puede ser examinado en TRPV4-ARN inyectado ovocitos de Xenopus por células enteras de fijación de voltaje de dos electrodos o parche abrazadera en en-célula o el modo extirpado.

Luminométricos levadura y Xenopus ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

El objetivo general del siguiente experimento es examinar la sensibilidad mecánica del canal de cuatro iones trip V. Esto se puede lograr transformando células de levadura con el gen trip V four y examinando la entrada de calcio inducida hipotéticamente a través de un transgénico extraño utilizando un luminómetro. Esto también se puede examinar con el abordaje electrofisiológico.El CRNA Trip V four se genera primero y se inyecta en los citos xenopus después de la incubación. Los citos se examinan mediante una pinza de voltaje de dos electrodos en el desafío hipotónico. Para examinar la sensibilidad de los mecanos a nivel de un solo canal, se aplica succión a los parches de membrana extirpados de los citos.Soy el profesor Jin Kung. Anteriormente, las actividades de los cuatro canales iónicos del viaje B fueron demostradas en gran medida por URA para el mito de fluorescencia desarrollado aquí, proporcionando alternativas poderosas y cuantitativas para examinar la sensibilidad mecánica del viaje B cuatro. El primer método que adoptamos para el uso de lum lum es a través de agua transgénica para examinar la sensibilidad mecánica de Trip V four en levaduras en ciernes.En el segundo método con enfoque electrofisiológico, se examinan las propiedades de Trip V four para la expresión apta del tributo V four CRNA en XUS Cytes. El método básico de electrofisiología de los citos, como la eliminación de la membrana de Vilin y la formación de sellos propios, ya se ha demostrado en un trabajo de Brown y colaboradores en esta misma revista en 2008, aquí se mostrarán los pasos adicionales necesarios para estudiar la sensibilidad mecánica de Triv four. Este es mi compañero de trabajo, el Dr. Jin Fcon.Demostrará el uso de la geometría Tlum, así como la fabricación de las pipetas de inyección, el llenado de pipetas con solución de CRNA y la inyección de la solución en los sitios antiguos. Además, demostrará la grabación de almejas parche en celular y en modo extirpado de adentro hacia afuera. También mostró la activación del canal mecanosensible nativo de la membrana del sitio O, así como los resultados de la activación de heterólogos.Comience este procedimiento cultivando dos mililitros de células de levadura durante la noche hasta la fase postlogarítmica en medio de abandono DCD Lu Yura, suplementado con un molar de sorbitol en un agitador de 30 grados Celsius. Al día siguiente inocular 200 microlitros del cultivo en 1.800 microlitros de medio fresco, suplementado con dos micromolares Lucifer. Luego, Risine crece en la oscuridad a temperatura ambiente durante otras 24 horas sin agitar justo antes de la dilución.Mida la osmolaridad del cultivo enriquecido con sorbitol de un molar y del cloruro de sodio utilizando un OSM ter de presión de vapor. A continuación, alícuota 20 microlitros de cultivo fresco en un tubo luminométrico de 12 milímetros para un luminómetro de un solo tubo. Para el choque hipotónico, agregue 200 microlitros de solución que contenga 25 milimolares de sodio EGTA a pH 7.2 o MES de sodio a pH 7.2 y 500 a 100 milimolares de cloruro de sodio a 20 microlitros del cultivo a 1, 400 Milli Osmo monitoree continuamente la luminiscencia antes, durante y al menos 120 segundos después del choque osmótico descendente, interrumpido solo por la breve operación de dilución, registre la salida del luminómetro en la computadora como unidades de luminiscencia relativa.En este procedimiento, tire de una micropipeta con un extractor de pipetas. La micropipeta debe tener un vástago largo bajo un microscopio de disección. Pellizque con cuidado el vástago de la micropipeta tirada en el punto adecuado para crear una abertura.La abertura de la micropipeta debe tener unos 30 micrómetros de diámetro para facilitar el llenado y la expulsión de la solución de ARNC. Aquí están el microinyector y el soporte de pipeta. Este es el control con las funciones de absorción y expulsión claramente marcadas.Después de volver a llenar la pipeta con aceite mineral montado en el soporte, bájela en una gota de solución de ARNC. A continuación, llene la pipeta mediante un microinyector automáticamente bajo el microscopio de disección, seleccione un ovocito. A continuación, baje la micropipeta llena para que penetre en el ovocito.Una vez que se haya insertado la micropipeta en él, inicie la inyección de CRNA. Después de haber inyectado unos 30 citos, transfiéralos al medio ND 96 que contiene rojo de rutenio y gentamicina. A continuación, transfiéralos individualmente a una placa de 96 pocillos que contenga el medio ND 96 en el extremo.Colóquelos en la incubadora durante varios días para permitir la expresión del viaje V de cuatro canales. Se utilizan dos métodos electrofisiológicos para examinar la sensibilidad del mecanismo del disparo V cuatro. El primer método es la pinza de voltaje de dos electrodos, y esta es la configuración en este paso.Extraiga las pipetas de registro para la medición de voltaje y la inyección de corriente de los vasos bólicos de 100 microlitros con un tirador de pipeta. Los electrodos de pipeta deben tener una abertura de punta de aproximadamente una micra de diámetro. A continuación, rellene los electrodos con cloruro de potasio de dos molares, lo que dará como resultado una resistencia de 0,1 a 0,2 mega.Móntelos en las etapas de cabeza HS two a. Estos dos son los micro manipuladores que sujetan el electrodo de control de voltaje y el electrodo de inyección de corriente, que junto con una pinza de baño virtual con conexión a tierra VG dos x 100 se conectan a una interfaz de amplificador de abrazadera de genes 500 a través de un digitalizador de dígitos 1440. Y los datos se adquieren utilizando el software P clamp 10.Sentada en la etapa del microscopio invertido se encuentra la cámara de registro para realizar una grabación, se coloca un citto de xenopus en la cámara y se insertan los dos electrodos en él mediante micromanipulación. La solución que baña el cite en la cámara de registro está en un flujo continuo a través de la gravedad. La alimentación de la entrada a la cámara se conecta a través de un tubo a un colector fabricado con un banco de cartuchos de jeringa.Cada cáscara se llena con una solución diferente. El contenido del baño se cambia cerrando o abriendo diferentes abrazaderas en el tubo. Cambiar el baño de una osmolaridad alta a una baja proporciona una forma de estimulación mecánica.Ahora, llene las pipetas de vidrio extraídas con la solución interna. La configuración de la pinza de parche es similar a la de la pinza de voltaje con el electrodo montado en la etapa principal y luego asegurado en el micromanipulador. Conecte la pipeta de pinza de parche a una jeringa de cinco mililitros y a un manómetro.El electrodo de pinza de parche se manipula sobre la superficie del ovocito. Después de la extracción de la membrana Vitale, aplique una succión continua para adherir el parche a la punta de la pipeta, lo que aumentaría la resistencia eléctrica al pulso de corriente de prueba. Cuando la resistencia es lo suficientemente grande como para indicar la formación exitosa de un sello giga, el electrodo con el parche se retira del ovocito para establecer el modo de registro de extirpado al revés.A continuación, aplique pulsos de succión en el parche extirpado. Existe un canal sensible de 40 picos de Siemens mecano, nativo del ovocito xenopus. Esta figura muestra la activación de estos canales cuando se aplica un pulso de succión en la membrana, los parches extirpados de los ovocitos expresan con éxito el viaje V cuatro.La activación de la conductancia unitaria de Siemens de 90 picos del viaje V cuatro se puede observar de manera similar. Aquí se muestra el viaje de rata V cuatro expresado en levadura que responde al choque hipotónico. Un choque hipotónico de 750 miliosmoles desencadena un gran aumento de luminiscencia en el rendimiento del viaje V cuatro T, pero no en el rendimiento T de un plásmido vacío o que lleva un viaje V cuatro con una mutación en su filtro de iones.Y aquí está la relación dosis-respuesta entre el choque hipotónico y la respuesta máxima. Las respuestas de la corriente macroscópica del ovocito completo a los estímulos hipotónicos se examinaron con una pinza de voltaje de dos electrodos. Las corrientes máximas de un ovocito que expresa niveles muy altos de tipo salvaje disparan V en pasos de voltaje de cuatro a 100 milisegundos en respuesta a la eliminación de 100 milimolares de sorbitol de la solución de baño de Osmo de 250 milimolares y la adición de tres micromolares de rojo de rutenio.La corriente máxima repetida aumenta con los estímulos hipotónicos y disminuye con el retorno a la solución isotónica o la adición del bloqueador de canales. Esta figura muestra la activación directa del tipo salvaje trip V four por el estiramiento de la membrana visto bajo la pinza del parche, una muestra de trazas crudas de calidad media de un parche extirpado de un ovocito que expresa el viaje V cuatro que muestra la activación por succión de mercurio aplicada a un parche extirpado del revés mantenido a 50 voltios positivos. La traza superior se muestra en una base de tiempo más rápida para mostrar la transición de corriente unitaria entre un nivel cerrado y un nivel abierto.Esta cinta de video debería brindarle una comprensión más concreta de cómo se pueden aplicar los métodos electrofisiológicos de luz, geometría y sitio O de levadura al estudio de la sensibilidad mecánica de tres cuatro canales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Luminométricos levadura y Xenopus ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4

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