Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o En Vivo

El objetivo general de este procedimiento es monitorear eventos mitocondriales individuales, como destellos de superóxido y fluctuaciones de potencial de membrana, in situ o in vivo, para lograr una evaluación en tiempo real de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante. Esto se logra exponiendo primero el músculo esquelético en la extremidad trasera del ratón. A continuación, se obtienen imágenes confocales de lapso de tiempo de los músculos esqueléticos in vivo.

A continuación, se perfunde el corazón del ratón y se obtienen imágenes mediante microscopía confocal. Finalmente, se procesan las imágenes y se analizan los datos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran destellos individuales de superóxido mitocondrial y fluctuaciones potenciales de membrana en músculos esqueléticos, in vivo o en corazón perfundido a través de imágenes de lapso de tiempo y confocales bidimensionales.

La principal ventaja de esta técnica sobre los músculos existentes, como la evaluación de la función mitocondrial en el aislamiento de mitocondrias, es que esta técnica permite la evaluación en tiempo real de la función mitocondrial individual en una condición fisiológicamente relevante. Demostramos que este método es crítico como un cuchillo, un animal o un tejido de cuchillo Las imágenes confocales son difíciles de aprender porque es un procedimiento más empinado y complicado. Después de preparar una solución salina balanceada isotónica o IBSS, Krebs HENSEL Light Buffer o KHB e instrumentos quirúrgicos de acuerdo con el protocolo de texto, anestesiar a un ratón con una inyección intraperitoneal de pentobarbital y realizar un pinzamiento en el dedo del pie para confirmar que el animal está sedado.

Con una navaja, retire el vello de una de las extremidades traseras antes de desinfectar el sitio con etanol al 70%. A continuación, haga una incisión en la piel a lo largo del lado exterior de la extremidad para exponer los músculos de la anemia gástrica. Luego, con pinzas afiladas, levante suavemente el epimisio y use unas tijeras para hacer una incisión a través de él.

Diseccione más para eliminar el epimisio y exponer las fibras musculares debajo de él. Agregue 500 nanomolares de tetraetilo, éster metílico de varilla dominada o TMRM al IBSS y sumerja el músculo en la solución durante 30 minutos. Después de cargar TMRM en el músculo, lave el músculo con IBSS sin TMRM usando un objetivo de aceite de 40 x.

Coloque el ratón de lado en la platina del microscopio confocal y sujete la extremidad posterior de modo que el músculo esquelético expuesto quede en una cámara hecha a medida contra el cubreobjetos. A continuación, presione suavemente la pierna para hacer un contacto estrecho entre el tejido y el cubreobjetos y sumerja los músculos expuestos en IBSS utilizando una profundidad de píxeles de ocho bits y una frecuencia de muestreo de un segundo por fotograma, registre un escaneo en serie bidimensional del músculo. Recopile imágenes secuenciales excitándolas primero a 405 nanómetros y recopilándolas a más de 505 nanómetros.

Luego se emociona a 488 nanómetros mientras se recolecta a más de 505 nanómetros. Para la excitación de doble longitud de onda de MT. CCP YFP, utilice la excitación secuencial a 405, 488 y 543 nanómetros, y recoja la emisión a 505 a 5, 45,505 a 5, 45 y más de 560 nanómetros, respectivamente. Para obtener imágenes de excitación de triple longitud de onda de M-T-C-P-Y-F-P y TMRM para obtener imágenes del corazón del ratón, inyecte al animal 200 unidades de heparina.

Después de esperar 10 minutos y sacrificar al ratón mediante toracotomía, extraiga rápidamente el corazón, los pulmones y el timo adheridos a él. Transfiera rápidamente el tejido implantado al SII helado. A continuación, identifique los lóbulos del timo y pélelos suavemente.

Para exponer la aorta ascendente, extirpe el pulmón y el timo y aísle la aorta extirpando cuidadosamente cualquier tejido circundante. A continuación, haz un corte en el extremo superior de la aorta ascendente antes de la primera rama del arco aórtico. Luego, con dos pinzas de microsutura, sostenga suavemente la pared de la aorta para exponer la luz y colóquela con cuidado en una cánula.

Use una pinza de microvasos para mantener la aorta en su lugar y atar rápidamente las suturas alrededor de ella. Retire la pinza y use fórceps para verificar cuidadosamente que la punta de la cánula esté por encima de la raíz aórtica. Asegure lazos adicionales si es necesario para mantener el corazón en su lugar.

Encienda la bomba peristáltica y perfunda el corazón. A un mililitro por minuto, el corazón volverá a latir tras la perfusión. Después de 10 minutos de estabilización, perfundir el corazón con 10 BLEs micromolares de estatinas y TMRM de 100 a 500 nanomolares.

Los latidos del corazón se ralentizarán después de 10 minutos. A continuación, ajuste la posición del sistema de perfusión y coloque el corazón en la platina del microscopio equipado con un adaptador para calentar la cámara a 37 grados centígrados. Agregue un mililitro de solución de perfusión de KHB en la cámara para sumergir parcialmente el corazón.

Utilice una bomba peristáltica para eliminar el efluente de la cámara. Aumentando gradualmente la velocidad de la bomba para proporcionar suficiente flujo al corazón para asegurar un contacto estrecho del corazón con el cubreobjetos y para suprimir aún más los latidos del corazón, aplique una presión suave sobre el corazón. Tome una imagen del órgano como se describió para el músculo anteriormente en este video, ajustando el plano focal para revelar la imagen más clara posible.

Utilizando el módulo de análisis fisiológico del software de microscopio confocal. Comience abriendo la base de datos generada automáticamente y luego el archivo de imagen 2D que se va a analizar. Haga clic en la región de interés o en el valor medio del ROI.

Para cambiar al modo de media de ROIs. Apague la visualización de canales excepto CP YFP a 488 nanómetros para seleccionar los flashes. Acérquese a la imagen y mueva manualmente la barra deslizante para reproducir las imágenes 2D en serie.

A continuación, identifique los destellos individuales de superóxido mitocondrial localizando el sitio donde la señal fluorescente aumenta transitoriamente. Utilice la herramienta de ROI adecuada para marcar los destellos que muestra el cambio de fluorescencia dependiente del tiempo de cada ROI que aparecerá junto a la imagen. Después de seleccionar todos los flashes, encienda la visualización de otros canales.

Seleccione un ROI en la imagen fuera de la celda para la sustracción de la señal de fondo. A continuación, emita la fluorescencia media de cada ROI junto con las etiquetas de tiempo. Registre el número de destellos en cada uno de los archivos de imagen de escaneo en serie junto con el tiempo de escaneo y el área de la celda.

Utilice Excel para calcular la frecuencia de destellos como el número de destellos por 100 segundos y por área de celda de 1000 micras cuadradas. Para calcular el tiempo de amplitud hasta el pico y el tiempo de decaimiento para cada destello. Utilice un programa desarrollado a medida para el análisis de parámetros flash que forme parte de un programa desarrollado a medida escrito en lenguaje de datos interactivo.

Utilizando este protocolo, se pueden realizar imágenes in vivo de eventos mitocondriales individuales en músculos esqueléticos de ratones anestesiados, seguidas de imágenes insi en el corazón perfundido. Como se muestra aquí. TMRM, que es un indicador de potencial de membrana mitocondrial, se usa a menudo para verificar la ubicación de M-T-C-P-Y-F-P y debe mostrar un patrón de superposición completo con la señal M-T-C-P-Y-F-P.

Sus espectros se distinguen de los de CP YFP, y mediante el uso del método de excitación secuencial, las señales de emisión de TMRM y M-T-C-P-Y-F-P no interferirán entre sí. Estas imágenes demuestran que un solo destello de superóxido mitocondrial acompañado de despolarización de la membrana se puede identificar en las imágenes de escaneo 2D en serie, que mostraron un aumento transitorio de la fluorescencia sobre las señales de fondo tanto en los tejidos del músculo esquelético como en el miocardio. Además de la alta resolución, también se requiere una intensidad de fluorescencia adecuada.

Esto se puede lograr modulando la intensidad del láser y la ganancia en los canales colectores. En general, la señal de fluorescencia basal de la célula se establece entre un tercio y un cuarto de la intensidad máxima del canal. Dado que el nivel de expresión de M-T-C-P-Y-F-P y la carga de TMRM pueden variar entre los animales, se deben realizar ajustes finos de las condiciones de imagen para cada experimento, tanto las perturbaciones fisiológicas como las patológicas, como los sustratos metabólicos.

La estimulación eléctrica, como se indica aquí, y la reperfusión isquémica se han utilizado para demostrar que la actividad del flash de superóxido responde a los cambios en el estado metabólico celular. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la anestesia bucal adecuada y la condición correcta del corazón perfundido. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la isquemia y la fusión, para responder preguntas adicionales, como la disfunción mitocondrial durante la leucemia miocárdica y la lesión por reperfusión.