Name: Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprenda a monitorizar eventos mitocondriales individuales como destellos de superóxido y fluctuaciones del potencial de membrana en músculo esquelético y corazón perfundido de ratón mediante microscopía confocal in vivo.

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Los autores desean agradecer a los Dres. Heping Cheng, Huiliang Zhang y Stephen Kolwicz por sus valiosos comentarios y apoyo técnico en el desarrollo de este método. Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH y el Bono de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón para WW.

1. Preparación experimental <ol><li> Preparar la solución isotónica salina equilibrada (50 ml) que contenía: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, 2,5 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl 2 y 10 mM de HEPES (pH 7,2) para obtener imágenes de músculo esquelético in vivo. </li><li> Preparar 1 L de tampón de Krebs-Henseleit (KHB) que contiene: NaCl 118 mM, 5,3 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4, 0,5 mM de EDTA y 25 mM de NaHCO3. </li><li> Burbuja la KHB con gas que contiene 95% de O2 / 5% de CO 2 durante 10-15 min antes de la adición de 2 mM de CaCl2. Añadir sustratos metabólicos (por ejemplo, 10 mM de glucosa y piruvato 0,5 mM). </li><li> Preparar los instrumentos quirúrgicos mediante la esterilización de la abrazadera, tijeras, fórceps y en etanol al 70% y luego enjuagar en esterilizada ddH 2 O. </li><li> Encienda el sistema de perfusión cardíaca, ajuste la temperatura del baño de agua y bomba de circulación, ajuste la velocidad de la bomba peristáltica a 6 ml / min. </li><li> Burbuja del KHB con 95% de O2/ 5% de CO 2 de gas, y controlar la velocidad de flujo y la temperatura (37 ° C, por una sonda de temperatura de fibra óptica) del efluente. El sistema necesita unos 20 minutos para el gas y la temperatura de equilibrio. </li></ol> 2. Imagen confocal de los músculos esqueléticos en Vivo <ol><li> Anestesie ratón con pentobarbital (80 mg / kg, ip). El animal llegará a la anestesia quirúrgica (sin respuesta a la pizca dedo del pie) dentro de 10 a 15 min y permanecer en este estado durante 1 a 1,5 horas, suficiente para la formación de imágenes in vivo de los músculos esqueléticos. </li><li> Eliminar los pelos en una de las extremidades posteriores y esterilizar la piel con etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión en la piel a lo largo del lado exterior de la extremidad para exponer los músculos gastrocnemio. </li><li> Levante el epimisio suavemente con un fuerte fórceps y hacer una incisión a través de él con unas tijeras. Además diseccionar para eliminar el epimisio y exponer las fibras musculares debajo de ella. </li><li> Para la carga in vivo de TMRM en el esqueletomuscular, incluyen TMRM (500 nM) en la solución salina balanceada isotónica para sumergir el músculo durante 30 minutos y luego lavar a cabo por la solución de indicador libre. </li><li> Ponga el ratón en su lado en el microscopio confocal (Zeiss LSM 510) escenario y sujetar la extremidad trasera en una posición que el músculo esquelético expuesto se enfrenta contra el cubreobjetos que forma el fondo de la cámara. El cubreobjetos está en entre el tejido muscular y el objetivo invertida (aceite de 40X). </li><li> Pulse la pierna hacia abajo suavemente para hacer contacto estrecho entre el tejido y el cubreobjetos. Sumerja los músculos expuestos en solución salina balanceada isotónica. </li><li> Graba dos (2D, xy) confocal de imágenes tridimensionales en una frecuencia de muestreo de un segundo por fotograma. La intensidad de cada píxel se digitaliza a una profundidad de 8 bits. Por lo general, una exploración de serie contiene 100 marcos. </li><li> Recoge imágenes secuenciales por primera excitante a 405 nm y recogiendo a&gt; 505 nm entonces a 488 nm mientras que la recogida de&gt; 505 nm de longitud de onda dual excitation de imagen de mt-cpYFP. Utilice la excitación secuencial a 405, 488 y 543 nm, y recoger emisión a 505-545, 505-545, y&gt; 560 nm, respectivamente, para el triple longitud de onda de excitación de formación de imágenes de MT-cpYFP y TMRM. </li></ol> 3. Imagen confocal de corazón perfundido Ratón <ol><li> Inmediatamente después de la formación de imágenes in vivo de los músculos esqueléticos, inyectar el ratón con 200 unidades de heparina (IP). Diez minutos más tarde, la eutanasia el ratón por toracotomía y rápidamente quitar el corazón con los pulmones y el timo se le atribuye. </li><li> Quite rápidamente el pulmón en tampón enfriado con hielo. Identificar los lóbulos del timo y pelar suavemente hacia atrás para exponer la aorta ascendente. </li><li> Retire el timo y aislar la aorta quitando cuidadosamente cualquier tejido circundante. </li><li> Haga un corte en el extremo superior de la aorta ascendente antes de la primera rama del arco aórtico. </li><li> Sostenga la pared de la aorta suavemente con dos pinzas de micro de sutura para exponer la luz y coloque cuidadosamente la aorta en la cannula (PE50 tubo). La aorta se mantiene en su lugar con una abrazadera micro buque mientras las suturas se atan rápidamente alrededor de la aorta. </li><li> Retire la abrazadera, comprobar cuidadosamente la cánula con una pinza para asegurarse de que la punta de la cánula se encuentra por encima de la raíz aórtica. Lazos adicionales se añaden según sea necesario para mantener el corazón en el lugar. </li><li> Encienda la bomba peristáltica y perfundir el corazón a 1 ml / min. El corazón se reanudará superando a la perfusión. </li><li> Ajuste la posición del sistema de perfusión y poner el corazón en la platina del microscopio. La etapa tiene un adaptador que permite el calentamiento de la cámara que contiene el corazón. </li><li> Añadir 1 ml de solución de perfusión KHB en la cámara para sumergir parcialmente el corazón. Controle la temperatura de la cámara a 37 ° C. Eliminar efluente de la cámara de mediante el uso de una bomba peristáltica. </li><li> Aumentar la velocidad de la bomba peristáltica gradualmente para proporcionar un caudal suficiente (aproximadamente 2 ml / min) para el corazón. </li><li> Después de 10 min de estabilización, perfundir el heaRT con 10 blebbistatin M y 100-500 nM TMRM. Los latidos del corazón se ralentizará después de 10 min. </li><li> Aplicar una suave presión sobre el corazón para asegurar el contacto hermético de la corazón con el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara y para suprimir aún más los latidos del corazón. </li><li> Siga el mismo procedimiento con la imagen confocal de miocardio intacto tal como se describe en el paso 2.8 anterior. Ajuste con cuidado el plano focal para mostrar la imagen más clara posible. </li></ol> 4. Procesamiento de imágenes y análisis de datos <ol><li> Utilice las herramientas proporcionadas por el módulo &quot;Análisis fisiológico&quot; del software confocal para analizar los flashes y los cambios potenciales de membrana mitocondrial individuales. Este módulo se incluye a menudo en el software de adquisición de imágenes del sistema confocal y permite la determinación de ciertas áreas de la imagen, así como la salida de intensidad de fluorescencia con etiquetas de tiempo. </li><li> Abra la base de datos y, a continuación el archivo de imagen 2D en serie para ser analizados. </li><li> Haga clic en la &quot;Regiónde interés (ROI) significa &quot;para cambiar a la&quot; media de rendimiento de la inversión &quot;de modo. Haga clic en la&quot; zona de interés (ROI) significa &quot;cambiar a&quot; modo de media de rendimiento de la inversión &quot;. </li><li> Apagar la pantalla de otros canales excepto el canal de cpYFP 488 nm para la selección de los flashes. </li><li> Zoom en la imagen y mover manualmente barra deslizante para reproducir las imágenes en 2D de serie. </li><li> Identificar flashes superóxido mitocondriales individuales localizando el lugar donde la señal aumenta transitoriamente fluorescentes. Utilice la herramienta de ROI adecuado para marcar los flashes. La traza que muestra el cambio de fluorescencia en función del tiempo de cada ROI se mostrará junto a la imagen. </li><li> Después de seleccionar todos los flashes, encienda la pantalla de otros canales. Seleccione un retorno de la inversión en la imagen exterior de la célula para el fondo de la señal de resta. Salida de la fluorescencia media de cada retorno de la inversión junto con las etiquetas de tiempo. </li><li> Anote el número de flashes en cada uno de los archivos de imagen de escaneo de serie junto con el tiempo de ciclo y el área dela célula. Uso de Excel para calcular la frecuencia de flash como el número de destellos por 100 seg área de la celda / 1000 m 2. </li><li> Utilice un programa personalizado-desarrollado escrito en lenguaje de datos interactivo (IDL, ResearchSystems) para calcular los parámetros de cada destello (amplitud, tiempo hasta el pico y el tiempo de decaimiento). Software IDL está disponible comercialmente y el programa personalizado-desarrollado para el análisis de parámetros de flash se puede obtener de autor a petición. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Imaging eventos mitocondriales individuales en animales vivos o en los órganos perfundidos tiene ventaja significativa sobre los métodos tradicionales de evaluación de la función mitocondrial 17,19,21,22,24,25. La técnica descrita aquí puede lograr en tiempo real en la determinación in situ de la función mitocondrial en una condición fisiológica real en la resolución subcelular. Esto es particularmente útil, cuando se combina con otras mediciones, para estudiar sistémicamente el papel de las...

Las mitocondrias juegan un papel central en la bioenergética celular, la señalización de los radicales libres, la homeostasis redox, la regulación de iones, y la determinación del destino celular 1,2. Las mitocondrias a menudo acompaña a la disfunción y la base de la patogénesis de las enfermedades 3-6. Especialmente en los sistemas musculares tales como el corazón y los músculos esqueléticos, la respiración mitocondrial proporciona la mayoría de ATP para apoyar la regulación oportuna de calcio intracelular y robusto 7,8 desarrollo de la fuerza. Estos músculos poseen un gran número de mitocondrias, que a menudo ocupan hasta un 20-40% del volumen total de células y son &quot;fijos&quot; entre miofilamentos 2. A pesar de numerosos estudios, nuestra comprensión de la regulación de la función mitocondrial, específicamente in vivo y bajo condiciones fisiológicamente pertinentes, es limitada. Una de las razones es que la mayoría de los métodos desarrollados para la evaluación de la función mitocondrial depende de en VITRO o ex enfoques in vivo, tales como el control de la consumo de oxígeno de mitocondrias aisladas suplementado con sustratos artificiales, y la determinación indirecta de la función mitocondrial a través de la morfología (microscopía de electrones por ejemplo), actividad enzimática (por ejemplo, actividad de la aconitasa), o los niveles de ATP intracelulares 9-11 . Recientemente, los pequeños indicadores fluorescentes de moléculas con un enriquecimiento relativo mitocondrial se han aplicado para proporcionar una visión de las señales mitocondriales, incluyendo el potencial de membrana, calcio y especies reactivas de oxígeno (ROS), en células intactas 11-13. Por otra parte, varios proteína fluorescente verde (GFP) y redox basado en indicadores de ROS se han desarrollado para lograr una evaluación más específica de la redox intracelular de ROS compartimentada o señales de 14-16. Entre esto, hemos desarrollado un indicador codificado genéticamente dismutasa, la proteína amarilla fluorescente circular permutada y targeted en las mitocondrias (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP puede ser excitado a 405 o 488 nm con dos picos de emisión a 515 nm. La emisión a 488 nm de excitación es específicamente sensible a superóxido como se muestra por el anterior in vitro e in vivo calibraciones 17,18. La emisión a 405 nm de excitación se utilizó como control interno (por favor refiérase a la Figura 1 de la Ref. 17 para obtener información detallada sobre la emisión y excitación espectros de mt-cpYFP en diversas condiciones). Con la imagen confocal de lapso de tiempo, este indicador detecta reventar eventos de producción de superóxido, llamados destellos superóxido, en las mitocondrias individuales de células intactas. Flash superóxido sirve como una función compuesta de la respiración mitocondrial, acompañamiento transitoria despolarización de la membrana mitocondrial y la producción de ROS 17-20. Recientemente, hemos generado las pan-tejido mt-cpYFP ratones transgénicos utilizando el vector pUC-CAGGS-mt-cpYFP 17,19 en C57/BL6 fondo y verificado las expresiones fuertessión de este indicador en el corazón, los músculos esqueléticos y otros tejidos (Figura 2). Los ratones transgénicos estará disponible para los investigadores académicos interesados ​​previa solicitud y aprobación MTA por la Universidad de Washington. En este estudio, se describe en la formación de imágenes in situ de destellos superóxido en corazón Langendorff perfundidos, así como formación de imágenes in vivo de eventos de flash en los músculos esqueléticos de MT-cpYFP ratones transgénicos anestesiados 17,19. Esta tecnología permite la monitorización en tiempo real de eventos de producción de ROS mitocondriales individuales en un estado fisiológicamente relevante o in vivo 21,22. También es factible utilizar el sistema para controlar otros parámetros mitocondriales individuales tales como el potencial de membrana y de calcio con indicadores fluorescentes apropiados. Evaluación Además, simultánea o paralela de la función mitocondrial con eventos intracelulares (por ejemplo, los transitorios de calcio) o la función del corazón (por ejemplo,. Fracción de eyección) se puede lograr. Perturbaciones patológicas, tales como la isquemia y la reperfusión, se pueden aplicar al corazón perfundido para evaluar el impacto del estrés sobre la función mitocondrial solo en el miocardio intacto.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS</fuerte></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B592500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Acros Organics</td><td>AC34961-5000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-1</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T-668</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td colspan="4">Microscopio de barrido de línea confocal (LSM 510 Meta, Zeiss), versión de software 4.2 SP1 que incluye el módulo "Análisis fisiológico".</td></tr></tbody></table>

imagen confocal de soltero mitocondriales superóxido parpadea en corazón intacto o en vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitocondria es un orgánulo intracelular crítico responsable de la producción de energía y la señalización intracelular en sistemas eucarióticos. La disfunción mitocondrial a menudo acompaña y contribuye a la enfermedad humana. La mayoría de los enfoques que se han desarrollado para evaluar la función mitocondrial y la disfunción se basa en in vitro o in vivo mediciones ex. Los resultados de estos experimentos han capacidad en la determinación de la función mitocondrial in vivo limitado. Aquí se describe un nuevo método que utiliza la microscopía confocal de barrido para la obtención de imágenes de los tejidos intactos en aminales en vivo, lo que permite la evaluación de la función mitocondrial solo de una manera en tiempo real en vivo. Primero, generamos ratones transgénicos que expresan el indicador dismutasa mitocondrial específica, la proteína fluorescente amarilla permutado circularmente (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestesiado ratón se fija en un adaptador de fase a medida y las imágenes con lapso de tiempo se toman fesde los músculos esqueléticos expuestas de la extremidad posterior. El ratón se sacrificó y posteriormente el corazón está configurado para perfusión Langendorff con soluciones fisiológicas a 37 ° C. El corazón perfundido se coloca en una cámara especial en la platina del microscopio confocal y se aplica una presión suave para inmovilizar el corazón y suprimir los latidos del corazón inducida artefactos de movimiento. Parpadea superóxido se detectan en tiempo real de imagen confocal en 2D a una frecuencia de un fotograma por segundo. La solución de perfusión puede ser modificado para contener diferentes sustratos de respiración u otros indicadores fluorescentes. La perfusión también se puede ajustar para producir modelos de enfermedades como la isquemia y la reperfusión. Esta técnica es un enfoque único para la determinación de la función de único mitocondria en tejidos intactos e in vivo.

De acuerdo con este protocolo, formación de imágenes in vivo de eventos mitocondriales individuales se puede hacer en los músculos esqueléticos de ratones anestesiados, seguido de formación de imágenes en situ en el corazón perfundido (Figura 1). El ajuste óptimo de las condiciones de formación de imágenes se asegurará de imágenes claras de los tejidos musculares intactas y con resolución única mitocondria (Figura 2). TMRM se utiliza a menudo para verificar la ubicació...

La microscopía confocal de barrido se aplica para obtener imágenes de los eventos mitocondriales individuales en el corazón perfundido o los músculos esqueléticos en animales vivos. Monitoreo en tiempo real de los procesos mitocondriales individuales, como accesos repentinos superóxido y potencial de membrana fluctuaciones permite la evaluación de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante y durante perturbaciones patológicas.

Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o En Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

El objetivo general de este procedimiento es monitorear eventos mitocondriales individuales, como destellos de superóxido y fluctuaciones de potencial de membrana, in situ o in vivo, para lograr una evaluación en tiempo real de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante. Esto se logra exponiendo primero el músculo esquelético en la extremidad trasera del ratón. A continuación, se obtienen imágenes confocales de lapso de tiempo de los músculos esqueléticos in vivo.A continuación, se perfunde el corazón del ratón y se obtienen imágenes mediante microscopía confocal. Finalmente, se procesan las imágenes y se analizan los datos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran destellos individuales de superóxido mitocondrial y fluctuaciones potenciales de membrana en músculos esqueléticos, in vivo o en corazón perfundido a través de imágenes de lapso de tiempo y confocales bidimensionales.La principal ventaja de esta técnica sobre los músculos existentes, como la evaluación de la función mitocondrial en el aislamiento de mitocondrias, es que esta técnica permite la evaluación en tiempo real de la función mitocondrial individual en una condición fis

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método eficaz para obtener información sobre la visualización de la inducción paracrina derivados de ROS endotelial Ca2 + de señalización se describe. Este método tiene la ventaja de medir paracrina derivados ROS provocó la movilización de Ca2 + en las células endoteliales vasculares en un modelo de co-cultivo.

Visualización de Ca Vascular 2 + Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS

Fusión mitocondrial se midió mediante el seguimiento de la equilibración de photoconverted matriz orientada GFP través de la red mitocondrial en el tiempo. Hasta ahora, sólo una célula podría ser sometido a un análisis cinético hora larga a la vez. Se presenta un método que mide simultáneamente varias celdas, y acelera así el proceso de recopilación de datos.

Una más rápida, de alta resolución, APMt-GFP-ensayo basado en la fusión mitocondrial Adquisición de datos cinéticos de varias celdas en paralelo mediante microscopía confocal

El objetivo es supervisar el estado redox mitocondrial de los corazones aislados dentro del contexto de la precarga fisiológica y presiones poscarga. Un modelo de trabajo biventricular corazón de conejo se presenta. De alta resolución espacio-temporal de imágenes de fluorescencia de NADH se utiliza para supervisar el estado redox mitocondrial del tejido epicárdico.

NADH fluorescencia de imágenes de biventricular aislada Trabajo corazones de conejo

Fuente: Kennedy, L. H., et. al. Visualización e imagen en vivo de orgánulos de oligodendrocitos en cortes de cerebro organotípicos utilizando virus adenoasociados y microscopía confocal. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra la imagen de las mitocondrias de oligodendrocitos en cortes de cerebro de ratón organotípicos. La loncha se coloca dentro de una cámara de baño con circulación continua de fluido y temperatura controlada. Después de configurar varios parámetros del microscopio confocal, se...

Imágenes confocales del movimiento mitocondrial dentro de los oligodendrocitos en cultivos organotípicos de cortes de cerebro

El análisis de la relación estructura-función mitocondrial es necesario para una comprensión profunda de los mecanismos reguladores de la funcionalidad mitocondrial. En este trabajo se describen y demuestran métodos específicos para estudiar la estructura y función mitocondrial en ovarios vivos y fijos de Drosophila.

Estudiar mitocondrial Estructura y función en Drosophila Los ovarios

Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.

Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Esta técnica describe un flujo de trabajo efectivo para visualizar y medir cuantitativamente el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido dentro de las células HeLa utilizando imágenes en vivo basadas en fluorescencia.

Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa

El peróxido de hidrógeno (H2O2) es tanto una fuente de daño oxidativo como una molécula de señalización. Este protocolo describe cómo medir el H 2 O2mitocondrial utilizando HyPer7 dirigido a mitocondrias (mtHyPer7), un biosensor radiométrico codificado genéticamente, en levaduras vivas. Detalla cómo optimizar las condiciones de obtención de imágenes y realizar análisis cuantitativos celulares y subcelulares utilizando software de libre acceso.

Obtención de imágenes de mtHyPer7, un biosensor radiométrico para el peróxido mitocondrial, en células vivas de levadura

Este protocolo describe un mecanismo para utilizar la microscopía óptica y electrónica correlativa para visualizar la interacción de mitocondrias y lisosomas marcados con mEosEM y APEX2, respectivamente.

Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas

Este artículo describe el uso de microscopía confocal e ImageJ para evaluar la dinámica de fisión/fusión mitocondrial a través de la fluorescencia de fotoconmutación Dendra2.

Evaluación de la dinámica de fisión/fusión mitocondrial en células tubulares proximales renales

Aprenda a monitorizar eventos mitocondriales individuales como destellos de superóxido y fluctuaciones del potencial de membrana en músculo esquelético y corazón perfundido de ratón mediante microscopía confocal in vivo.

Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o En Vivo

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