Método de preparación de diapositivas para preservar la arquitectura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares

Este método de preparación de portaobjetos tridimensional conserva la disposición de la cromatina en 3D de las células, como se ha demostrado con las células germinales testiculares de ratones. En primer lugar, perfore los túbulos feroces para eliminar los materiales citoplasmáticos y mejorar la accesibilidad de los reactivos de tinción, como los anticuerpos y las sondas de pescado. Después de fijar los materiales nucleares, disocie mecánicamente las células germinales con fórceps y cisocie las muestras en portaobjetos.

A continuación, adquiera datos con múltiples secciones Z para cubrir un núcleo en 3D cuando se aplican estratégicamente como resultado de preparaciones de portaobjetos en 3D. Usando COT, un pez de ARN puede mostrar ARN nuclear naciente para detectar las regiones transcripcionalmente activas en el núcleo. Desarrollé este método cuando estaba en el laboratorio de genes del Hospital General de Massachusetts.

En ese momento, optimicé el método de preparación de portaobjetos para la visión fluorescente de ARN de algodón para la hibridación, también llamada pez para detectar nacent. ARN. Las sondas de algodón pueden hibridar secuencias repetitivas en intrones y tls y visualizar el sitio de transcripción activa. Los peces de algodón AR requieren la preservación de la distribución de ARN nuclear.

El punto clave de este método de preparación correcto es que los pasos de la ización deben continuar con la etapa de fijación. Para eliminar el fondo plásmico de Cy, desentrañe los túbulos OUS de un testículo roto en PBS en hielo, transfiera varias piezas de túbulos de cinco a 10 milímetros de longitud a 500 microlitros de tampón CSK con 0.5% tritton X 100 e incube durante seis minutos en hielo. Ahora transfiera todos los túbulos a una solución de P-F-A-P-B-S al 4% en un pocillo de un plato de cuatro pocillos, incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, incube todos los túbulos en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Configure las cámaras de citocentrifugado y citocentrifugado durante los períodos de incubación en la parte posterior de un portaobjetos de vidrio, transfiera todos los túbulos a 30 microlitros de PBS. Luego, use las puntas de dos pinzas para desgarrar los túbulos en pedazos.

Corta los túbulos en dirección horizontal recortando los túbulos entre las puntas de dos pinzas y tirando de las pinzas horizontalmente. Después de agregar 30 microlitros de PBS, mezcle la suspensión pipeteando, luego transfiérala a un tubo de microcentrífuga y agregue PBS hasta un volumen total de 1,3 mililitros. Ahora aplique 100 microlitros de la suspensión a cada una de las cámaras de centrifugado del cito. Cito.

Gire las muestras a 2000 RPM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Seque los portaobjetos en una mesa de laboratorio durante unos minutos a temperatura ambiente utilizando un frasco de coplan que contenga PBS. Lave los portaobjetos durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, transfiera los portaobjetos a etanol al 70% durante al menos dos minutos. En una reacción de 20 microlitros, agregue 100 nanogramos capturados, sonda de NA 1D, 20 milimolares de ribonucleótidos y complejo de vanadilo y tampón de hibridación. Usando una máquina de PCR, incubar durante 10 minutos a 80 grados centígrados, seguido de prea.

Pie de rodillas a 42 grados centígrados hasta que esté listo para usar. Ahora deshidrate sucesivamente los portaobjetos en etanol al 80% durante dos minutos, seguido de etanol al 100% durante dos minutos. Seque los portaobjetos completamente en la mesa de laboratorio a temperatura ambiente.

Ahora coloque la corredera en una cámara de la caja de puntas a 42 grados centígrados. A continuación, centrifugar brevemente las sondas de prenecesidad y pipetearlas directamente sobre los portaobjetos deshidratados. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos para el paso de hibridación de al menos seis horas a 42 grados centígrados.

Precalentar las soluciones de lavado en frascos coplan a 42 grados centígrados durante 30 minutos en un baño de agua con una cuchilla de afeitar, quitar el cubreobjetos del borde del portaobjetos sin rayar las muestras, sumergir progresivamente los portaobjetos en la solución de lavado durante cinco minutos cada uno. Empezando por el primer tarro de coplan que contiene dos XSSC y 50%form amid, seguido del segundo tarro de coplan que contiene dos XSSC y 50%form amid. Y luego los dos últimos frascos que contienen dos XSSC.

A continuación, añada 20 microlitros de medios de montaje DPI a las muestras y coloque un cubreobjetos. Presione suavemente el cubreobjetos y seque el material de montaje adicional con un pañuelo de limpieza. En este experimento, se realizó la captura de un pez de ARN para detectar simultáneamente la transcripción naciente y la inmunotinción de proteínas que se localizan en la inmunohistoquímica del cuerpo XY.

En esta SRP, los espermatocitos detectaron la proteína heterocromatina CCB X one y también una forma fosforilada de la variante de histonas H dos A X en el cuerpo XY. Los peces resultantes capturaron una señal acumulada en las regiones cromáticas en extensiones superficiales tratadas con solución hipotónica. La estructura tridimensional de la cromatina se interrumpe y todos los ejes cromosómicos mióticos se pueden capturar dentro de un solo plano Z.

Sin embargo, la preparación del portaobjetos en 3D conserva la estructura intacta de la cromatina siguiendo este procedimiento. Este método de preparación correcto es aplicable para peces de ADN y ARN con inmunofluorescencia, y la combinación de estos métodos de detección.