Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

El objetivo general de este procedimiento es identificar y caracterizar antivirales de moléculas pequeñas contra el virus de la lengua azul o BTV utilizando el ensayo de viabilidad celular basado en CPE. Esto se logra mediante el cribado primero de una biblioteca de compuestos antivirales mediante el ensayo basado en el efecto citopático o CPE con el reactivo de brillo del título celular. A continuación, se confirma la eficacia antiviral y se evalúa la citotoxicidad de los antivirales seleccionados mediante el ensayo de dosis-respuesta.

Finalmente, se lleva a cabo el ensayo de tiempo de adición para determinar la posible etapa del ciclo de vida viral de los antivirales seleccionados que conducen a los posibles mecanismos de acción. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran nuevos antivirales con CIE antiviral potente y baja citotoxicidad basados en el ensayo de dosis-respuesta y el ensayo de tiempo de adición. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el ensayo TCI D 50 en un ensayo de placa es que esta técnica proporciona un método sensible, robusto y altamente reproductivo en el método medible para detectar y categorizar antivirus contra ciertos virus, incluido el virus del gluten, que induce CP medible en las células infectadas células En preparación para el ensayo basado en CPE de células BSR mantenidas en DMEM suplementado, use un dispensador de selección de microflujo para Siembra 20 microlitros de células a 5.000 células por pocillo en un 384.

La microplaca de pocillo incuba las células durante dos o tres horas para permitir que se adhieran completamente a la placa, luego agrega compuestos antivirales a una concentración final de 10 micromolares a cada pocillo y mezcla completamente. Utilice el medio de ensayo para diluir la placa de BTV purificada y propagada hasta el título deseado y agregue cinco microlitros de BTV con el MOI denotado a cada pocillo para el control. Agregue cinco microlitros de medio de ensayo, coloque una caja húmeda que contenga la placa de ensayo en la incubadora e incube las células infectadas durante 72 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y 80 a 95% de humedad.

A continuación, saque la placa de ensayo de la incubadora, a continuación, descongele y equilibre el tampón CTG y el sustrato CTG liofilizado a temperatura ambiente. A continuación, reconstituya la solución homogénea de reactivo CTG mezclando el sustrato enzimático liofilizado y el reactivo tampón de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de equilibrar las placas de ensayo a temperatura ambiente durante 15 minutos, use un dispensador para agregar 25 microlitros de reactivos CTG a cada pocillo incube durante 15 minutos en la oscuridad antes de usar un lector multimodo con un tiempo de integración de 0,1 segundos para medir señales luminiscentes siembra 5, 000 células BSR por pocillo en una microplaca de 384 pocillos para el ensayo de dosis-respuesta usando 20 microlitros para el ensayo de eficacia antiviral y 25 microlitros para el ensayo de citotoxicidad.

Después de una incubación de dos a tres horas, asigne ocho réplicas para cada concentración de compuesto por ensayo, como se muestra aquí. Asigne la primera columna como el control positivo sin agregar compuesto o virus y la última columna como el control negativo agregando virus solo para el ensayo de eficacia antiviral compuestos diluidos a 50 micromolares en el medio de ensayo y a la segunda columna agregue 20 microlitros por pocillo. Utilizando una pipeta semiautomática de ocho canales.

Mezcle el compuesto cinco veces hasta una concentración de 25 micromolares. A continuación, transfiera 20 microlitros de la mezcla de la segunda columna a la columna tres y mezcle bien, lo que da como resultado una concentración de 12,5 micromolares. Repita esto dos veces.

Dilución seriada hasta la 11ª columna, que tendrá una concentración final de 0,04 micromolar. A continuación, añada cinco microlitros de medio a la columna uno como único control positivo de la célula y cinco microlitros por pocillo de BTV a la columna 12 como infección por BTV A. Adición de control negativo de cinco microlitros por pocillo de BTV desde la columna dos hasta la columna 11 para el ensayo de citotoxicidad, diluir el compuesto hasta una concentración inicial de 200 micromolares.

Agregue 25 microlitros por pocillo de compuesto a la columna dos y mezcle cinco veces para llevar la concentración a 100 micromolares. Lleve a cabo la dilución de la serie doble transfiriendo 25 microlitros de la columna dos a la columna tres vecina y continúe a través de la columna 12. Después de mezclar la columna 12, aspire y deseche 25 microlitros de la mezcla.

La primera columna es el único control de células para los ensayos de antivirales y citotoxicidad. Coloque una caja húmeda que contenga la placa de ensayo en la incubadora durante 72 horas y saque la placa después. A continuación, utilice el kit CT G para medir la viabilidad de la célula.

Utilice un software bioestadístico y gráfico para calcular el valor medio, la desviación estándar, las variaciones del coeficiente y el porcentaje de viabilidad celular para cada concentración de compuesto, y realice un análisis de regresión no lineal para determinar la EC 50 y CC 50 de cada compuesto. Prepárese para el momento de la adición o el ensayo TOA sembrando 5.000 células por pocillo en 15 microlitros en la columna uno a la 24 de un 384. Pozo de microplaca para cada compuesto.

Utilice las 24 columnas con ocho réplicas para cada punto de tiempo. Asigne la columna uno como control solo de células agregando 10 microlitros por pocillo del medio de ensayo, marque la columna 24 como una infección por el virus de la lengua azul solamente. Control negativo mediante la adición de cinco microlitros por pocillo de medio de ensayo y cinco microlitros por pocillo de virus a un MOI de 0,01.

En un volumen final de 25 microlitros por pocillo, seleccione las columnas pares de la columna dos a la 22 como columnas de evaluación de la eficacia antiviral en diferentes horas después de la infección o HPI en estas columnas, infecte las células con cinco microlitros por pocillo de BTV a un MOI de 0.01 a diferentes HPI, también agregue cinco microlitros por pocillo de compuesto diluido a un volumen final de 25 microlitros por pocillo para el denotado menos dos y menos un HPI. Agregue el compuesto a las células BSR antes de la infección por el virus de la lengua azul para obtener un HPI cero, agregue el compuesto y el virus de la lengua azul al cultivo simultáneamente. Paralelamente, designe las columnas impares del tres al 23 como controles compuestos solo correspondientes a los diferentes puntos de tiempo de estas columnas.

Agregue cinco microlitros por pocillo de medio de ensayo y cinco microlitros por pocillo de compuesto diluido en un volumen final de 25 microlitros por pocillo. Después de incubar las células a 72 HPI en la incubadora, saque la placa de ensayo y use el kit de brillo de título celular para determinar la viabilidad celular. Por último, utilice un software que procese las señales luminiscentes obtenidas a través del lector multimodo para determinar el valor medio.

S-T-D-E-V CV y porcentaje de viabilidad celular de protección para cada tratamiento utilizando el ensayo CPE para cuantificar el TP celular A en células vivas, identificamos previamente varios compuestos principales prometedores con una potente eficacia antiviral, baja toxicidad y alta selectividad. Por ejemplo, se determinó que el compuesto 0 5 2 tenía una EC 50 de 0,27 más o menos 0,12 micromolares y CC 50 de 82,69 micromolares, ambos con curvas regresivas típicas. Bajo el análisis de análisis de regresión no lineal, el SI 50 de C 0 5 2 se determinó que 306 en base a sus valores EC 50 y CC 50 la eficacia antiviral a escala nanomolar, baja toxicidad y, en consecuencia, alto SI 50 indicó que C 0 5 2 podría ser un antiviral potente y selectivo contra el BTV como se ve aquí, las células se infectaron con el virus de la lengua azul a un MOI de 0,01 en presencia de 10 concentraciones diferentes de C0, 5, 2, y la viabilidad celular se determinó a 72 HPI.

Usando el kit CTG, cada punto de datos representa medias y SD de cinco réplicas. Se utilizó el ensayo TOA para determinar las posibles etapas del ciclo de vida viral al que se dirigen los compuestos. Cuando se añadió C 0 5 2 una o dos horas antes de la infección por el virus de la lengua azul, la eficacia antiviral se mantuvo en la escala nanomolar, como se observa en esta figura.

Además, la viabilidad celular disminuyó aún más cuando se añadió C 0 5 2 a 32 y 48 HPI, lo que indica que C 0 5 2 podría actuar más allá de la etapa temprana del ciclo de vida viral, como la entrada del virus. Dado que el primer ciclo de replicación viral del virus de la lengua azul suele completarse en las células infectadas dentro de 24 HPI, nuestros resultados sugirieron que el C 0 5 2 podría actuar en las últimas etapas del ciclo de vida viral del virus de la lengua azul, como la replicación, el empaquetamiento, la maduración y la salida del virus. Mientras tanto, también es posible que C 0 5 2 actúe sobre la maquinaria celular del huésped que funciona durante las etapas posteriores del ciclo de vida viral.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo utilizar el mejor ensayo de CPE para identificar y categorizar los posibles antivirus contra los virus que inducen CPE medible después de la infección.