Name: In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Aprende a evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos mediante un ensayo de cocultivo in vitro. Este método permite cuantificar la respuesta inmune en infecciones de mucosas usando monocapas epiteliales y ensayos de mieloperoxidasa.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por los NIH (1 R01 AI095338-01A1).

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
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<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
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<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
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<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
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<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
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<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
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<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La migración de neutrófilos a través de las superficies epiteliales de la mucosa es una característica común en la patología de la enfermedad después de la infección con patógenos bacterianos3. La metodología descrita en este documento ofrece un enfoque rápido y directo para aislar experimentalmente este evento discreto utilizando un sistema de ensayo de cocultivo in vitro derivado de células humanas que modela una característica del proceso inflamatorio desencadenado por infecciones bacterianas. Este...

Las superficies mucosas sirven como barreras físicas e inmunológicas proporcionando protección contra las amenazas externas generalizadas en el medio ambiente1,2. Esta barrera epitelial protectora puede verse comprometida cuando los organismos patógenos invaden2. En el caso de un patógeno bacteriano, este encuentro a menudo instiga un proceso inflamatorio al activar el sistema inmune innato y desencadenar una rápida movilización de granulocitos de primer respondiente conocidos como neutrófilos2-4. Los agentes quimiotácticos que facilitan el reclutamiento de neutrófilos son producidos en parte por las células epiteliales de la mucosa que buscan librar al huésped del patógeno infractor2-4. La infiltración excesiva o no resuelta de neutrófilos en la superficie epitelial de la mucosa puede causar una patología significativa1,5. Esto es una consecuencia del daño tisular inespecífico causado por el arsenal de neutrófilosantibacterianos 5-7. En tales casos, la capacidad de la separación bacteriana de neutrófilos es eclipsada por la destrucción del tejido del anfitrión durante un insulto infeccioso.  La interrupción de la función de barrera epitelial protectora puede conducir a una mayor exposición del tejido subyacente a microorganismos y/o toxinas, exacerbando aún más la patología de la enfermedad8,9. Estas consecuencias se pueden observar en múltiples sistemas de órganos, incluyendo el pulmón y el tracto digestivo1,5. Además, las condiciones inflamatorias no infecciosas tales como episodios severos de asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y enfermedad inflamatoria intestinal (EII) están marcadas por la ruptura patológica de la barrera epitelial de la mucosa por una respuesta neutrófila excesiva4,5,10-12.
El complejo proceso de reclutamiento de neutrófilos después de la infección de la mucosa implica varios pasos compartimentados1,5,13,14. En primer lugar, los neutrófilos deben salir de la circulación a través de una serie de interacciones célula a célula que faciliten la migración trans-endotelial1,13. Los neutrófilos navegan a continuación por el espacio intersticial existente que contiene la matriz extracelular1,14. Para alcanzar la luz de la mucosa infectada, los neutrófilos deben entonces migrar a través de la barrera epitelial1,4,5. Este intrincado fenómeno de varios pasos se investiga a menudo en conjunto utilizando modelos animales in vivo de infección15. Tales modelos son útiles para establecer la necesidad de factores específicos, tales como quimiocinas, moléculas de adhesión o vías de señalización que participan en el proceso general, pero son en gran medida inadecuados para resolver las contribuciones moleculares críticas para cada paso compartimentado distinto16. Los sistemas cocultivos in vitro que modelan la migración trans-endotelial, trans-matriz o transepitelial de neutrófilos han sido particularmente útiles en este sentido1,14,16,17.
Se ha desarrollado un robusto sistema de ensayo de cocultivo con el fin de descifrar los mecanismos responsables de la migración transepitelial de neutrófilos en respuesta a la infección patógena18-22. Este modelo consiste en infectar la superficie apical de las capas de células epiteliales humanas polarizadas con un patógeno bacteriano seguido de la aplicación de neutrófilos humanos recién aislados a la superficie basolateral18-22. Los neutrófilos migran a través de la barrera epitelial en respuesta a productos quimiotácticos derivados de la epitelial secretados después de una infección patógena18,21-23. Este sistema modelo se ha empleado utilizando cultivos epiteliales intestinales y pulmonares expuestos a patógenos bacterianos específicos del tejido apropiado y ha revelado nuevos mecanismos moleculares probablemente importantes para el proceso de reclutamiento de neutrófilos durante la infección de la mucosa3,8,19,24-28. La fuerza de este modelo de cocultivo in vitro es que un enfoque reduccionista permite al investigador manipular experimentalmente el patógeno, la barrera epitelial y / o neutrófilo en un sistema bien controlado, altamente reproducible y bastante barato. La información obtenida de este enfoque puede aprovecharse eficazmente para realizar análisis enfocados de eventos compartimentados durante el reclutamiento de neutrófilos utilizando modelos de infección in vivo 22,29,30.
Este artículo demuestra los pasos múltiples necesarios para el establecimiento acertado de este modelo reproducible para explorar la migración transporte-epitelial inducida patógeno del neutrófilo. Las barreras epiteliales del pulmón infectadas con el patógeno Pseudomonas aeruginosa se ofrecen en este artículo; sin embargo, otros epitelios y patógenos del tejido se pueden substituir con modificaciones de menor importancia. La siembra y el cultivo de capas polarizadas de células epiteliales pulmonares en filtros de transwell permeables recubiertos de colágeno invertido se detallan aquí, al igual que el crecimiento de P. aeruginosa patógeno y el aislamiento de neutrófilos de la sangre entera. Cómo estos componentes se combinan para observar la migración transepitelial inducida por patógenos neutrófilos se presenta junto con controles positivos y negativos apropiados para establecer un ensayo reproducible. La versatilidad de este acercamiento para examinar varios aspectos de la migración transporte-epitelial inducida patógeno del neutrófilo se discute referente a estudios específicos en la literatura.

<table><tbody><tr><td>Células NCl-H292</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medio</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PAO1</td><td>ATCC#</td><td>47085</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC</td><td>#39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) líquido</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>sin calcio y magnesio</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10% añadido al medio de cultivo</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x: 10.000 unidades de penicilina y 10.000 &micro; g de estreptomicina por ml.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>50 ml de alícuotas se almacenan congeladas a -20 &ordm;C.&nbsp; La alícuota en uso se puede almacenar en 4 &ordm; C a corto plazo.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>Solución estéril, sin calcio ni magnesio</td></tr><tr><td>Azul</td> de <td>tripán Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>Acciones = 0,4%</td></tr><tr><td>Colágeno, cola de rata</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>También se puede aislar en el laboratorio directamente de las colas de ratas utilizando protocolos estándar</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>Componente de una solución de tampón de citrato 1 M y citrato ácido dextrosa (ACD)</td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>Componente de tampón de citrato 1</td></tr><tr><td>M Dextrosa anhidra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>Componente de la solución de citrato ácido dextrosa (ACD)</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>Componente del tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC)</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>Componente del tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>Componente del tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC)</td></tr><tr><td>HBSS(+) polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>Componente clave de HBSS+</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Componente de HBSS+</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>Siga las instrucciones del proveedor para recubrir las puntas de pipeta de vidrio</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) sal de diamonio (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>Componente clave de la solución de sustrato ABTS</td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno al 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Componente de la solución de sustrato ABTS</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP o fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>Se debe preparar una solución madre de 10 mM en DMSO y almacenar alícuotas a -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>Gelatina Tipo B</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>Agar de aislamiento de Pseudomonas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>Seguir fabricante s instrucciones para hacer placas PIA</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>Opcional, puede mejorar la pureza de los neutrófilos</td></tr><tr><td>Placa de migración de 24 pocillos</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>Placa de lavado de 24 pocillos</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>Se puede reutilizar si se empapa en etanol al 70% y se lava a fondo antes de la reutilización</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Soportes permeables Transwell&nbsp;</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3415</td><td>Policarbonato; Diámetro: 6,5 mm; Área de crecimiento: 0,33 cm2; Estilo de plato: plato de 24 pocillos; Tamaño de poro: 3.0 y micro; m</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>Cada placa de Petri contiene 24 Transwells invertidos de 0,33 cm2 &nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 0,2 &mu; m filtro / matraz</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td><td>Para esterilizar una solución de citrato ácido dextrosa (ACD)</td></tr><tr><td>5-3/4 en vidrio Pipeta Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Puntas de recubrimiento con Sigmacote antes de usar</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Invertoskop</td> Curvado y Dentado <td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max Lector de microplacas</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Las superficies mucosas sirven como barreras protectoras contra organismos patógenos. Las respuestas inmunitarias innatas se activan al detectar patógenos que conducen a la infiltración de tejidos con células inflamatorias migratorias, principalmente neutrófilos. Este proceso tiene el potencial de ser destructivo para los tejidos si es excesivo o se mantiene en un estado no resuelto.  Los modelos ines vitro cocultivos se pueden utilizar para estudiar los mecanismos moleculares únicos implicados en la migración transepitelial inducida por patógenos neutrófilos. Este tipo de modelo proporciona versatilidad en el diseño experimental con la oportunidad de manipulación controlada del patógeno, barrera epitelial o neutrófilo. La infección patógena de la superficie apical de monocapas epiteliales polarizadas crecidas en los filtros permeables del transwell instiga la migración basolateral a apical fisiológico relevante del transporte-epitelial de neutrófilos aplicados a la superficie basolateral. El modelo in vitro descrito en este documento demuestra los múltiples pasos necesarios para demostrar la migración de neutrófilos a través de una monocapa epitelial pulmonar polarizada que ha sido infectada con patógeno p. aeruginosa (PAO1). La siembra y el cultivo de transwells permeables con las células epiteliales derivadas humanas del pulmón se describen, junto con el aislamiento de neutrófilos de sangre humana entera y el cultivo de PAO1 y de K12 E. coli no patógeno (MC1000).  El proceso de emigración y el análisis cuantitativo de los neutrófilos migrados con éxito que se han movilizado en respuesta a la infección patógena se muestran con datos representativos, incluidos controles positivos y negativos. Este sistema modelo in vitro puede ser manipulado y aplicado a otras superficies mucosas. Las respuestas inflamatorias que implican la infiltración excesiva del neutrófilo pueden ser destructivas a los tejidos del anfitrión y pueden ocurrir en la ausencia de infecciones patógenas. Una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que promueven la migración transepitelial del neutrófilo con la manipulación experimental del sistema in vitro del análisis del cocultivo descrito adjunto tiene potencial significativo para identificar las blancos terapéuticas nuevas para una gama de enfermedades infecciosas de la mucosa así como inflamatorias.

Varios estudios han demostrado que las capas epiteliales infectadas por patógenos facilitan la migración transepitelial de neutrófilos3,8,19,24-28,31,32. Esto ocurre a través de una inducción específica del patógeno de un gradiente quimiotáctico de neutrófilos derivado de células epiteliales3,23. Por ejemplo, la patogenicidad de P. aeruginosa que interactúa con la superficie apical de las células epiteliales pulmonares hace que un número sustancial de neutrófilos migren a través de la capa ...

La migración transepitelial del neutrófilo en respuesta a la infección bacteriana de la mucosa contribuye a lesión epitelial y a la enfermedad clínica. Se ha desarrollado un modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos y capas polarizadas de células epiteliales humanas cultivadas en filtros transwell para facilitar las investigaciones hacia el desentrañamiento de los mecanismos moleculares que orquestan este fenómeno.

In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar el número de neutrófilos que han atravesado una monocapa de células epiteliales en respuesta a la infección. Esto se logra mediante transpocillos codificantes de colágeno antes de cultivar cuidadosamente monocapas de células epiteliales utilizando la maniobra de filtro transpocillo invertido. Como segundo paso, se cultiva el patógeno bacteriano para infectar la superficie apical de la monocapa epitelial cultivada en los filtros transpocillos, lo que hace que las células epiteliales produzcan quimioatrayentes de neutrófilos endógenos.A continuación, los neutrófilos aislados de la sangre total se añaden al lado basolateral de las monocapas epiteliales infectadas cultivadas en filtros transpocillos para analizar la migración de los neutrófilos desde el lado basolateral al apical. Se obtienen resultados que muestran un aumento significativo en el número de neutrófilos migratorios transepiteliales observados en respuesta a monocapas epiteliales infectadas a partir de la cuantificación de mieloperoxidasa de neutrófilos migrados. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la maniobra del filtro transpocillo inve

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

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Aprende a evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos mediante un ensayo de cocultivo in vitro. Este método permite cuantificar la respuesta inmune en infecciones de mucosas usando monocapas epiteliales y ensayos de mieloperoxidasa.

In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

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