In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

El objetivo general del siguiente experimento es determinar el número de neutrófilos que han atravesado una monocapa de células epiteliales en respuesta a la infección. Esto se logra mediante transpocillos codificantes de colágeno antes de cultivar cuidadosamente monocapas de células epiteliales utilizando la maniobra de filtro transpocillo invertido. Como segundo paso, se cultiva el patógeno bacteriano para infectar la superficie apical de la monocapa epitelial cultivada en los filtros transpocillos, lo que hace que las células epiteliales produzcan quimioatrayentes de neutrófilos endógenos.

A continuación, los neutrófilos aislados de la sangre total se añaden al lado basolateral de las monocapas epiteliales infectadas cultivadas en filtros transpocillos para analizar la migración de los neutrófilos desde el lado basolateral al apical. Se obtienen resultados que muestran un aumento significativo en el número de neutrófilos migratorios transepiteliales observados en respuesta a monocapas epiteliales infectadas a partir de la cuantificación de mieloperoxidasa de neutrófilos migrados. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la maniobra del filtro transpocillo invertido para crecer e infectar las barreras epiteliales es poco convencional y, por lo tanto, puede ser menos accesible para que los grupos de investigación no familiarizados la establezcan en su laboratorio.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias que implican infecciones como la neumonía o la fibrosis quística, ya que se pueden desarrollar y probar nuevos tratamientos para disminuir la cantidad de migración transepitelial de neutrófilos, lo que puede mitigar los efectos deletéreos de la ruptura neutrofílica excesiva de las barreras mucosas. Junto con Mark, que es becario clínico en mi laboratorio, demostrarán el procedimiento el técnico superior Wahi Preza y el becario postdoctoral Michael Pesos. Para comenzar, retire el área de crecimiento de 0,33 centímetros cuadrados, Transwells con un tamaño de poro de tres micrómetros del empaque y coloque la placa de 24 pocillos que contiene 12 transwells boca abajo dentro de la campana.

Levante la placa inferior y colóquela a un lado. Los transpozos ahora estarán al revés. Descansando sobre la tapa de la llama de la placa de 24 pocillos, un hemostático para la esterilidad y dejar enfriar.

Usando el hemostático estéril transfiere los transpocillos a una placa de Petri de 150 por 25 milímetros, manteniéndolos en la posición invertida, pipetee 70 microlitros de una solución de colágeno preparada de 30 microgramos por mililitro en etanol en la membrana del filtro de cada superficie de transpocillo invertida. La tensión debe mantener este volumen de solución en su lugar, ya que no hay paredes alrededor de la membrana del filtro al acceder a la superficie de la parte inferior. Tenga cuidado de que la solución de colágeno no gotee por el costado del transpocillo y evite mover los transpocillos durante el procedimiento de recubrimiento. Deje la tapa de la placa de Petri abierta durante un mínimo de cuatro horas para permitir que el etanol se evapore para mantener la esterilidad durante este proceso.

Mantenga encendidos el ventilador de la campana y la luz ultravioleta después de empaquetar las células epiteliales como se describe en el protocolo de texto. Agregue 70 microlitros de la solución de células suspendidas Resus de un tubo de 15 mililitros a cada transpocillo recubierto de colágeno invertido. Mezcle la suspensión celular invirtiendo suavemente el tubo periódicamente para evitar que las células se depositen en el fondo del tubo de 15 mililitros mientras siembra los pocillos trans.

Una vez que todos los pocillos invertidos se hayan sembrado con células epiteliales, vuelva a colocar la cubierta de la placa de Petri y coloque cuidadosamente las células en la incubadora de cultivo de tejidos al día siguiente. Agregue un mililitro de medio en cada pocillo de la placa estéril original de 24 pocillos y use un hemostático esterilizado para voltear cada pocillo trans invertido en cada pocillo que contenga un mililitro de medio. Agregue 0,2 mililitros de medio en la cámara superior de cada pocillo trans y devuélvalo a la incubadora de cultivo de tejidos.

Retire de la incubadora la placa de 24 pocillos que soporta las capas epiteliales que se han cultivado en la parte inferior de las membranas del filtro Transwell durante al menos ocho días. Sujete el borde de cada pocillo trans con un hemostático y sáquelo de la placa de 24 pocillos. Invierta el transwell sobre un cubo de residuos para desechar los medios de cultivo de la cámara interior del Transwell.

Sumerja cada transwell en un vaso de precipitados de lavado que contenga la solución salina equilibrada de Hank's con calcio y magnesio o Hank's Plus para llenar la cámara interior del Transwell. A continuación, deseche el líquido de la cámara interior en un cubo de residuos. Repita este paso por un segundo.

Lavar en Hank's plus después de dos lavados. Coloque los Transwells en una nueva placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de Hank's Plus. En cada pocillo, observe la cámara superior de cada pocillo para evaluar la integridad de la capa de células epiteliales.

Hank's Plus no debe filtrarse ni llenar la cámara superior del Transwell cuando se coloca en el pozo de una placa de 24 pocillos que contiene un mililitro de Hank's Plus. Después de observar cuidadosamente cada transpocillo, agregue 0,2 mililitros de Hanks Plus en la cámara superior. Coloque la placa en la incubadora durante 30 a 60 minutos para equilibrar las capas de células epiteliales y realizar el ensayo de migración transepitelial de neutrófilos.

Agarre cada pocillo con un hemostático de la placa de 24 pocillos de Wash Transwells equilibrados en Hank's Plus y deseche el líquido en el pozo superior en un cubo de desechos. Coloque cada pocillo al revés en una placa de Petri de 150 por 25 milímetros en seis de los pocillos invertidos. Agregue 25 microlitros de Hanks plus a tres de los pozos transversales invertidos.

Infectar las células con 25 microlitros de Pseudomonas, arosa o Pao uno diluido en Hanks plus preparado como se describe en el protocolo de texto a los tres últimos transpocillos invertidos infectar las células con 25 microlitros de e Coli, K 12, o mc 1000 diluido en Hanks Plus también preparado como se describe en el protocolo de texto después de incubar a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en una cámara humidificada durante 60 minutos. Lave los transpozos agarrándolos con un hemostático y volteándolos de nuevo en una placa de lavado de 24 pocillos que contenga un mililitro de Hank's plus. En las cámaras inferiores.

Añade 0,2 mililitros de Hank's plus a las cámaras superiores. Sujete el Transwell con un hemostático y retírelo de la primera placa de lavado. Deseche el líquido de la cámara superior en un cubo de residuos.

Antes de colocar los Transwells en una segunda placa de lavado de 24 pocillos que contiene un mililitro de Hanks plus, agregue 0,2 mililitros de Hanks plus a la cámara superior. Repite este paso una vez más para un total de tres lavados. Después del tercer lavado, deseche el líquido de las cámaras superiores de los pocillos trans en un cubo de residuos utilizando un hemostático, coloque tres de los pocillos trans no infectados en tres pocillos de la placa de migración de 24 pocillos que contiene un mililitro de Hanks Plus, que representa la pipeta de control negativo 10 microlitros de una solución de 10 micromolares de FMLP en cada uno de los tres pocillos de la placa de migración de 24 pocillos que contiene un mililitro de Hanks además de colocar tres de los pozos trans no infectados en tres pozos de la placa de migración de 24 pocillos que contienen 100 FMLP nanomolar, lo que representa un control positivo de la capacidad de migración de los neutrófilos aislados.

A continuación, coloque los tres pocillos trans infectados con PAO uno y los tres pocillos trans infectados con mc 1000 en tres pocillos correspondientes de la placa de migración de 24 pocillos que contienen un mililitro de Hanks más añadir 0,1 mililitros de Hanks plus a la cámara superior de cada pocillo trans encima de los 0,1 mililitros de Hanks plus en cada trans. Bueno, agregue con cuidado 20 microlitros de la suspensión de neutrófilos preparada como se describe en el protocolo de texto. Incubar durante dos horas para permitir la migración transepitelial de los neutrófilos.

Después de dos horas de migración, levante los transpozos agarrándolos con un hemostático y golpee suavemente contra las paredes internas de la placa de migración de 24 pocillos. Antes de descartar los pocillos trans, evalúe la migración de neutrófilos macroscópicamente en los pocillos observando los pocillos de la placa de migración de 24 pocillos bajo un microscopio invertido utilizando el objetivo 10 x. Luego agregue 50 microlitros de Triton X 100 al 10% a cada pocillo utilizado en la placa de migración de 24 pocillos, cada estándar y la pieza en bruto.

Gire los estándares de la placa de migración de 24 pocillos y corte en blanco a baja velocidad durante 20 minutos. A cuatro grados centígrados. Agrega 50 microlitros de tampón de citrato.

Dos cada pozo utilizado en la placa de migración de 24 pocillos a cada estándar y a la pieza en bruto a fondo. Mezcle bien el contenido de cada muestra pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces. A continuación, transfiera 100 microlitros de cada pocillo de muestra por duplicado a una placa de transferencia de 96 pocillos, 100 microlitros de cada patrón y el blanco a la placa de 96 pocillos.

Después de mezclar, agregue 50 microlitros de peróxido de hidrógeno al 30% a la solución A BTS y al vórtice. A continuación, añada 100 microlitros de solución de sustrato A BTS a cada muestra. En la placa de 96 pocillos, permita que la placa se desarrolle durante cinco a 10 minutos en la oscuridad.

Observe el desarrollo del color verde en los pocillos de la placa que contiene neutrófilos de lisa antes de leer a una longitud de onda de 405 nanómetros. Usando un lector de microplacas para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos, los neutrófilos que han migrado completamente a través de la capa epitelial a la cámara apical se pueden ver en el pocillo inferior de la placa de migración de 24 pocillos, como se visualiza aquí usando un microscopio de luz invertida. Se observó que muy pocos neutrófilos migraban a través de una capa epitelial no infectada sin un gradiente quimiotáctico impuesto y representaban los niveles de fondo en el ensayo.

Por el contrario, se observó una abundancia de neutrófilos transmios cuando se proporcionó un gradiente FMLP. La infección del epitelio con E. coli no patógena mc 1000 dio lugar a pocos neutrófilos transmigrados visibles, mientras que muchos neutrófilos transmigrados fueron observables cuando las capas epiteliales se infectaron con el patógeno pulmonar pseudomonas aerogen. Los neutrófilos que han migrado en el experimento se cuantifican midiendo su actividad de mieloperoxidasa.

El número de neutrófilos se correlaciona positivamente con la cantidad de actividad de peroxidasa medida después de la lisis de los neutrófilos con valores que muestran una relación lineal en el rango de números de neutrófilos seleccionados para la curva estándar. Un número significativo de neutrófilos migran a través de las capas epiteliales en respuesta a un gradiente FMLP proporcionado, o en respuesta a una capa epitelial infectada con PAO one. El número de neutrófilos que migran en ausencia de estímulos o después de una infección epitelial apical con E. coli no patógena mc 1000 está por debajo del límite de detección para el ensayo.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas para el recubrimiento de colágeno y la siembra de las células epiteliales en los filtros transwell, seguidas de al menos una semana para permitir que las células epiteliales crezcan. Una vez que las monocapas epiteliales están listas. El ensayo de migración se puede realizar en cinco horas, incluyendo el aislamiento de neutrófilos y la preparación de bacterias si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe preparar los filtros transwell en condiciones estériles para evitar la contaminación. Este procedimiento se puede adaptar para responder preguntas adicionales relacionadas con este proceso inflamatorio. Se puede realizar un análisis de las células migradas, el epitelio, la supina o incluso el patógeno.