El método de cultivo de la rebanada por Siguiendo desarrollo de gérmenes de dientes en Explante Cultura

El objetivo general del siguiente experimento es seguir el desarrollo de los dientes durante varios días. El cultivo in vitro explan, esto se logra diseccionando la mandíbula en desarrollo de ratones fetales en cortes vivos para exponer los gérmenes dentales en desarrollo como un segundo paso. Las rodajas se seleccionan, se colocan en filtros sobre un medio de cultivo y se incuban para permitir el desarrollo.

A continuación, las rodajas se marcan con un trazador de linaje con el fin de rastrear el movimiento celular durante el período de cultivo, se obtienen resultados que muestran la naturaleza dinámica de los tejidos dentales a medida que se desarrollan durante el cultivo explan. La principal ventaja de esta técnica sobre el cultivo convencional de explantes es que los órganos que se desarrollan internamente, como las gemas dentales, se pueden observar a lo largo de su desarrollo dentro del contexto del tejido circundante. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de corte y selección pueden ser difíciles si la configuración de la máquina o la orientación del tejido son inexactas.

En primer lugar, se prepare el medio de disección y cultivo de los órganos embrionarios añadiendo un 1% de glutamato y un 1% de penicilina estreptomicina a 500 mililitros de medio águila modificado ECCOs avanzado F 12. Luego, como se describe en el artículo de video de Takahashi Sumi, diseccione los embriones de ratones entre las etapas E 11.5 y E 15.5 de desarrollo y colóquelos en una placa de Petri que contenga medio fresco. A continuación, decapitar los embriones con una aguja de tungsteno estéril recién afilada y transferir las cabezas a un plato fresco de medio preenfriado con hielo.

A continuación, aísle las mandíbulas de las cabezas colocando una aguja en la cavidad bucal y cortando temporalmente hacia la parte posterior de la cabeza. Almacene las mandíbulas aisladas en un medio preenfriado sobre hielo antes de ser seccionadas. Antes de cortar el tejido de la mandíbula, limpie el disco de montaje y la cuchilla de la picadora de tejidos con etanol al 70% y asegúrese de que la cuchilla quede al ras con el disco de montaje.

Cuando caiga, será necesario reemplazar la cuchilla después de cortar aproximadamente 200 mandíbulas, establecer la distancia de corte entre 200 y 400 micrómetros según la edad del espécimen, y dependiendo de si se requiere el germen dental completo para un embrión E 14.5 donde se requiere el aislamiento del germen dental, se utiliza una distancia de corte de 250 micrómetros. A continuación, transfiera una mandíbula al disco de montaje de plástico y colóquela de modo que la lengua en desarrollo esté en una orientación transversal frontal. Al diseccionar molares para aislar los incisivos, tome cortes sagitales a través de la mandíbula.

Una vez correctamente orientado, retire el exceso de medio alrededor del tejido. Con papel de filtro, esto impulsará ligeramente una mandíbula que la fije en su lugar en el disco de montaje. Inmediatamente después de secar con el papel de filtro, coloque el disco en la mesa circular de acero inoxidable de la picadora.

A continuación, ajuste la fuerza de la cuchilla al máximo, encienda la máquina y pulse el botón de inicio. La mesa se desplaza automáticamente de izquierda a derecha, mientras que al mismo tiempo el brazo de corte que lleva la cuchilla se eleva y se deja caer a una velocidad de hasta 200 golpes por minuto. Una vez que el pañuelo se haya cortado por completo, apague la máquina.

Asegúrese de que el brazo de la hoja esté en la posición elevada y, a continuación, retire el disco. Asegúrese de no colocar los dedos debajo del brazo de la hoja ni dejar la máquina desatendida. Al picar el pañuelo, tome el disco de montaje e inmediatamente agregue medio a las rodajas en el disco para evitar un secado excesivo.

A continuación, desaloje con cuidado el tejido de rodajas de la parte inferior del disco con una aguja de tungsteno o una pipeta y córtelos en una pequeña placa de Petri de tamaño mediano. A continuación, separe las rodajas individuales con una aguja y, a continuación, seleccione las rodajas de tejido que contienen el área de interés bajo un microscopio estereoscópico. Coloque las rodajas seleccionadas en platos de cultivo con rejillas metálicas frescas, medianas, preparadas para el sistema de cultivo cortando tiras, de cuatro centímetros por 1,5 centímetros de láminas de tejido liso de acero inoxidable.

A continuación, perfora un agujero en el centro con una perforadora fija estándar y dobla los lados para que la rejilla quede plana en el pozo central y quede paralela al fondo del plato. Una vez que las rejillas tengan la forma correcta, esterilícelas en un autoclave antes de usarlas. A continuación, prepare las placas de cultivo de órganos del pozo central para el cultivo agregando dos mililitros de agua de autoclave al pozo exterior para evitar la deshidratación.

A continuación, coloque una rejilla metálica estéril en el centro del plato. Corte un trozo de membrana de tereftalato de polietileno transparente con un tamaño de poro de 0,4 micrómetros para que sea lo suficientemente grande como para cubrir el agujero de la rejilla. A continuación, coloque la membrana cortada en el plato con una rodaja de mandíbula seleccionada si se desea trazar el linaje.

Primero prepare una aguja capilar de vidrio estirando el vidrio con un extractor de aguja. A continuación, rompa la punta de la aguja y colóquela con la punta hacia abajo en una solución de colorante lipofílico como dai eye o dai o, y extraiga parte de la solución de tinte por acción capilar. Después de unos minutos, coloque la aguja llena en un soporte y conéctela a un aspirador bucal.

Coloque la punta de la aguja en el medio de cultivo de modo que toque el área que se va a etiquetar, como el folículo dental que se muestra aquí. A continuación, desplaza una pequeña cantidad de tinte sobre el tejido. A continuación, transfiera la rebanada a una platina de microscopio fluorescente y compruebe que la rebanada esté etiquetada correctamente.

Una vez etiquetado con éxito, levante con cuidado la rebanada en la parte superior de la membrana y luego transfiera la membrana fuera del medio con la rebanada aplanada en el centro. Luego coloque el filtro sobre el orificio circular en el centro de la rejilla a aproximadamente un mililitro de medio de cultivo hasta el pocillo hasta que el nivel del medio esté al nivel de la membrana. En este punto, agregue cualquier proteína o inhibidor de moléculas pequeñas en el medio.

Además, imagine el corte para obtener un registro de la morfología en el día cero usando un microscopio de disección para obtener la mejor fotografía, vea los cortes con una fuente de luz desde abajo. Mantenga los platos en una atmósfera humidificada con un 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados y cambie el medio cada dos o tres días a intervalos regulares. Continúe tomando imágenes de las culturas para realizar un seguimiento del progreso.

Aquí se muestra una serie de imágenes que documentan el desarrollo del primer folículo dental molar, que está marcado con tinte fluorescente para ojos. El corte es un corte frontal de 250 micras de espesor diseccionado de la mandíbula de un ratón a E 14.5. El diente, que está delineado con puntos negros, comienza en la etapa de tapa en el día cero.

Al cuarto día, el germen dental ha alcanzado la etapa de campana y las células del folículo dental se extienden en un arco alrededor del esmalte externo en desarrollo. Epitelio Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas desde el embrión hasta el cultivo final. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar con éxito el desarrollo de los órganos en cultivo.