Name: Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei /i (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprende a establecer un modelo experimental de coinfección de tuberculosis y malaria en ratones mediante inhalación de aerosoles y transmisión natural por mosquitos. Este método permite investigar la patogénesis y respuesta inmune in vivo.

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Los autores desean agradecer a Miriam Ester para la reproducción de mosquitos. Este trabajo fue apoyado por el financiamiento interno del Centro de Investigación Borstel y se unió a la financiación por la infección Leibniz Center.

<ol><li>Mueller, A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Transmission+of+Plasmodium+berghei+Exacerbates+Chronic+Tuberculosis+in+an+Experimental+Co-Infection+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model.</a> PLoS ONE. 7, e48110(2012).</li>
<li>Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+tuberculosis%3A+myths+and+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in tuberculosis: myths and truth.</a> Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).</li>
<li>Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+parasite+development+in+the+mosquito+and+infection+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host.</a> Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).</li>
<li>Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+immune+defenses+against+Plasmodium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Compar.+Immuno%22%5BJournal%5D)">Mosquito immune defenses against Plasmodium infection.</a> Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).</li>
<li>Page, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium-induced+potentiation+of+type+1+immune+responses+and+protection+against+malaria+are+host+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific.</a> Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).</li>
<li>Hawkes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+exacerbates+experimental+mycobacterial+infection+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo.</a> Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).</li>
<li>Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+report%3A+modulation+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+by+Plasmodium+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).</li>
<li>Hoffman, S. L., Doolan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+vaccines-targeting+infected+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes.</a> Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).</li>
<li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).</li>
<li>Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+Plasmodium+parasites+as+a+protective+experimental+malaria+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine.</a> Nature. 433, 164-167 (2005).</li>
<li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216, 160-162 (1967).</li>
<li>Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+Plasmodium+berghei+sporozoites+delivered+by+intravenous+inoculation+versus+mosquito+bite%3A+implications+for+sporozoite+vaccine+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials.</a> Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).</li>
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<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+analyses+defines+vital+and+redundant+functions+of+the+Plasmodium+rhomboid+protease+family%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family.</a> Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).</li>
<li>Bancroft, J. D. G., M, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+JDG+%22Theory+and+Practice+of+Histological+Techniques%22">Theory and Practice of Histological Techniques</a>. , Churchill Livingstone. New York. (2007).</li>
<li>Schneider, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+IL-18+in+protective+immunity+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis.</a> Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).</li>
<li>Craig, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+animal+models+for+research+on+severe+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The role of animal models for research on severe malaria.</a> PLoS Pathog. 8, e1002401(2012).</li>
<li>de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+why+experimental+murine+models+are+required+to+understand+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease.</a> Parasitology. 137, 755-772 (2010).</li>
<li>Van den Steen, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathology+and+dexamethasone+therapy+in+a+new+model+for+malaria-associated+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Describimos cómo los ratones pueden ser productivamente infectadas por Mtb y P. berghei a través de sus rutas naturales de infección. Aplicamos establecido protocolos de infección experimental para estudiar la tuberculosis o la malaria 13 12 y, recientemente, los adoptó para estudiar la coinfección entre Mtb y Plasmodium en el modelo de ratón 1. Los pasos más importantes para las infecciones de éxito son la transmisión de ambos patógenos en los números deseados. Stocks por micobacterias no deben ser mayores de 2 años, porque van a perder viabilidad en el tiempo, y la decidida originalmente el título de las acciones lo más probable es ya no ser exacta. Como resultado, las dosis de infección sería mucho menor de lo esperado. Por lo tanto, los títulos de UFC de cultivos madre deben determinarse cada pocos meses. Igualmente importante es el cultivo estandarizado y generación de reservas de Mtb en el primer lugar. Las condiciones de cultivo, tales comomedio, suplementos, tiempo, y el volumen deben ser normalizados con el fin de ser capaz de comparar los datos de diferentes experimentos utilizando poblaciones de Mtb. Micobacterias tienden a aglutinarse durante el cultivo, por lo que es importante mantener las condiciones de cultivo estandarizado, las bacterias de la cosecha en la misma fase de crecimiento y volver a suspender con frecuencia durante alícuotas. De lo contrario puede haber una amplia variación en los títulos de UFC y el resultado de la infección. La generación de lotes de mosquitos infectados de forma homogénea es otro paso crítico. Desde diferentes mosquitos se alimentan de cada ratón individual, es importante que todos los mosquitos utilizados para un experimento de infección provienen del mismo lote y que se utilizan únicamente los lotes donde se infectó a más de 90% de los mosquitos. El modelo actual se puede utilizar para diseccionar las respuestas inmunes y modulaciones inmune en un huésped coinfectados por comparación con las respuestas inmunes en hospedadores infectados individuales. Podemos aplicar vametodologías tales como la histología, inmunohistoquímica, citometría de análisis de poblaciones de células inmunes, o PCR y ELISA para la detección de citoquinas y quimioquinas a los tejidos o fluidos corporales de interés GRAVES bien establecidos. Cabe señalar, que tales modelos de ratón tienen ciertas limitaciones. Mientras que la mayoría de la gente infectada con Mtb desarrollar una infección latente, sin signos de los síntomas clínicos, los ratones desarrollan una enfermedad crónica con patología pulmonar progresiva. Sin embargo, ratones C57BL / 6 ratones son relativamente resistentes a la infección de Mtb y no desarrollan granulomas clásicos como se observa en los pacientes con tuberculosis humanos. Como resultado, las reacciones inmunopatológicas en el ratón no reflejan ni la enfermedad de la tuberculosis humana latente ni activa apropiadamente. A pesar de la discrepancia entre la enfermedad latente y crónica en el hombre y el ratón, los ratones se han utilizado ampliamente para identificar y estudiar los factores del huésped que controlan la infección por Mtb y son herramientas valiosas e indispensables para investigarla respuesta inmune en las enfermedades infecciosas. Es importante destacar que, la susceptibilidad a la infección de Mtb varía considerablemente entre las cepas de ratón endogámicas de uso común y las cepas más susceptibles tales como DBA o C3H se pueden incluir en los estudios de co-y-infección única. Por otra parte, además de las especies de patógenos descritos en este documento, se podrían utilizar cualquier otra especie de Mycobacterium de interés (por ejemplo, aislados clínicos). Del mismo modo, mientras que hay un único modelo de la malaria se replica todos los aspectos de la enfermedad humana diferentes modelos de ratones no se parecen mucho a los diferentes aspectos de la infección de la malaria humana adquirida de forma natural. Por ejemplo, P. berghei y P. ANKA Yoelii YM/17XL se estudian ampliamente los modelos de hombre (inducida por P. falciparum) paludismo grave, con P. berghei ANKA está considerado como un excelente modelo para el consumo humano Malari s cerebral 14,15. P. berghei NK65 es un excelente modelo para hiperparasitemia y malaria anemia aguda, y ha sido recientementedescrito como un modelo experimental para el síndrome de la malaria asociada a dificultad respiratoria aguda (SDRA MA-16). Utilizando el modelo de la coinfección descrito, recientemente hemos podido demostrar que P. concurrente infección berghei NK65 exacerba tuberculosis crónica 1. Aparte de utilizar diferentes parásitos de la malaria de roedores, el orden y el calendario de eventos de infección pueden ser adaptados en función de la pregunta de investigación subyacente. En el campo, infecciones por Plasmodium concomitantes pueden estar presentes en el momento de la infección de Mtb o adquirida posteriormente. En ambos casos la respuesta inmune a Mtb y Plasmodium pueden verse afectados de forma diferente. Por lo tanto, los ratones pueden infectarse con esporozoitos de Plasmodium, ya sea antes o después de la infección de Mtb. Además, los ratones pueden ser impugnadas en diferentes momentos después de la infección de Mtb para evaluar el impacto de la respuesta inmune inducida por Plasmodium in aguda frente crónicala tuberculosis. Es importante destacar que, al elegir un parásito de la malaria para el estudio de la coinfección por malaria tuberculosis, uno debe ser consciente de que algunas cepas de Plasmodium roedores causan enfermedad grave en ciertas cepas de ratón y sucumben a la infección dentro de sólo unos días o semanas, mientras Mtb hace crónica y las infecciones de larga duración en inmunocompetentes ratones. Por lo tanto, el momento de la coinfección es crucial con el fin de evitar la muerte prematura de los animales experimentales. La modulación de la inmunidad del huésped por la infección simultánea con múltiples especies de patógenos sigue siendo poco conocida. Nuestro modelo de coinfección experimental proporciona una herramienta poderosa para investigar Mycobacterium - interacción Plasmodium con el sistema inmune de un huésped coinfectados y contribuirá a nuestra comprensión de cómo las coinfecciones pueden afectar patogenia, evolución de la enfermedad, la vacunación, inmunodiagnóstico, y la terapia.

Las poblaciones humanas rara vez se exponen a un solo patógeno. Sobre todo en las regiones con alta incidencia de infecciones como el África subsahariana, las coinfecciones representan un problema de salud pública de primera, pero muy poco apreciada. La tuberculosis y la malaria son las infecciones bacterianas y parasitarias de mayor prevalencia en los seres humanos, respectivamente, y siguen siendo las causas principales de morbilidad y mortalidad en las poblaciones pobres de las zonas tropicales. A pesar de la amplia superposición geográfica entre la tuberculosis y la malaria y el gran número de personas en riesgo de coinfección, se sabe muy poco acerca de las interacciones entre los diversos y con frecuencia contrapuestos reguladores inmunes y efectores simultáneamente provocados contra los parásitos de la malaria y los bacilos de la tuberculosis en las personas coinfectadas. Modelos de roedores de infecciones mixtas permiten caracterizar las reacciones inmunes diferenciales frente a patógenos distintos en un host, lo que enfatiza la influencia mutuariencias modulación de la patología y la evolución clínica de la enfermedad individual, lo que también ayudará a identificar nuevas recomendaciones para el tratamiento y la prevención. Hemos establecido un modelo experimental de ratón, que nos permite investigar las ramificaciones causadas por la infección concurrente con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y especies de Plasmodium de roedores dentro de la misma máquina 1. Es importante destacar que, para emular las infecciones humanas adquiridas naturalmente lo más estrechamente posible, nuestro modelo implementa las rutas naturales de infección utilizados por ambos patógenos. La tuberculosis es una infección por el aire, que por lo tanto se manifiesta principalmente en los pulmones. El agente causal, Mtb es transmitida por las personas con enfermedad activa a través de la ruta de aerosol cuando se expulsan gotitas de aerosol infecciosas durante la tos o el estornudo. Por lo tanto, la infección por aerosol es el método de elección para imitar la infección natural. Generación de partículas en el aire que contienen Mtb se puede lograr mediante el usode un sistema de exposición por inhalación. Esta cámara de exposición de todo el cuerpo permite la exposición de los animales experimentales para Mtb-que contiene gotitas de aerosol infecciosas (Figura 1) que se inhala en los alvéolos de los pulmones, donde se inicia la infección 2. La malaria, por otro lado es una enfermedad transmitida por vectores causada por el protozoo parásito Plasmodium apicomplejo que se transmite de forma natural por la picadura de un mosquito anofeles hembra. Durante la harina de sangre, esporozoitos infecciosos se depositan bajo la piel de acogida y posteriormente alcanzan el hígado a través del torrente sanguíneo. Dentro de los hepatocitos se desarrollan y se multiplican rápidamente en esquizontes hígado etapa. Eventualmente, los esquizontes maduros se rompen y liberan miles de merozoitos de primera generación patógenos en el torrente sanguíneo donde inician un ciclo progresivo de la invasión de células rojas, la replicación, la ruptura de los glóbulos rojos, y la reinvasión 3. La contingencia del ciclo de vida del Plasmodiumues como algunos merozoitos se desarrollan en las etapas de parásitos sexuales, los gametocitos masculinos y femeninos, que pueden ser emprendidas por los mosquitos durante las comidas de sangre. En el mosquito, los esporozoitos de Plasmodium se desarrollan dentro de los ooquistes que residen en el intestino medio del mosquito y eventualmente migran a las glándulas salivales para su posterior transmisión a otro 3,4 anfitrión. Aunque en modelos animales experimentales de la entrega de Mtb través del aerosol y la vía por lo tanto más relevante es muy común, muchos estudios de infección por Plasmodium roedores experimentales, incluyendo estudios sobre la malaria tuberculosis coinfección 5-7 se han llevado a cabo mediante la infección de ratones con eritrocitos parasitados, dando lugar a la infección de la malaria en fase de sangre mientras que excluye la fase hepática en fase clínicamente silenciosa. Sin embargo, la etapa de hígado es un paso obligatorio durante la infección y relevante para la inmunidad anti-plasmodial 8-11. Consideramos que es por lo tanto importante incluir el pH hepáticaase de transmisión de la malaria y el mantenimiento en los estudios tanto de la malaria y la coinfección por malaria tuberculosis, respectivamente. Además, se ha demostrado que los esporozoitos de transmisión de forma natural son más infecciosos que los transmitidos a través de las infecciones de aguja 12, que nos llevó a establecer la infección de la malaria por picadura de mosquito en lugar de inyectar aislado de las glándulas salivales esporozoitos derivados. La única manera de obtener mosquitos infecciosos de transmisión natural de parásitos de la malaria es mantener todo el ciclo de vida del parásito, tanto en el hospedador vertebrado (en este caso el ratón) y el mosquito vector. Por lo tanto, el acceso a un insectario para el mantenimiento parásito es inevitable con el fin de realizar transmisión natural por picadura. Nuestro protocolo descrito en el presente documento ha sido desarrollado para investigar la forma en la coinfección por el Plasmodium esporozoitos impactos sobre la tuberculosis crónica 1. Para ello, los ratones son aerosoles infectados con M. tuberculosis y 40 días más tarde, cuando M. infección por tuberculosis ha alcanzado la fase crónica, los ratones son expuestos a los mosquitos malaria-infeccioso. El resultado de tanto la malaria y la tuberculosis en los animales coinfectados puede ser seguido por el seguimiento de la parasitemia en la sangre y la carga bacteriana en el tejido, respectivamente. En nuestro protocolo, vamos a describir en detalle cómo se infectan ratones con ambos patógenos a través de su ruta de infección natural y la forma de confirmar la transmisión de patógenos con éxito. En nuestras manos, la tasa de infección comúnmente alcanzada por ambas infecciones experimentales es del 100%. Estos protocolos se pueden aplicar para estudiar tanto las infecciones por separado o, como nosotros, para modelar y estudiar la coinfección entre dos de los más desafiantes enfermedades infecciosas humanas. Este modelo es aplicable a otras especies de Mycobacterium y Plasmodium roedor más allá de los descritos en este protocolo.

<table><tbody><tr><td>Buraton</td><td>Sch&uuml; lke</td><td></td><td>ingredientes activos: aldehídos (formaldehído, glutaraldehído, oxalaldehído, hexanal de etilo)</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M0178</td><td>Para cultivos de caldo Mtb</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td>Medio de agar para cultivo de Mtb</td></tr><tr><td>Medio de enriquecimiento Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212240</td><td>Añadir a 7H9 y 7H11 para cultivo de Mtb</td></tr><tr><td>Plato de tinción</td><td>Science Services</td><td>E62542-12</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de 24 correderas con mango</td> Servicios <td>de ciencia</td><td>E62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Giemsas Azur-Eosin-Solución azul de metileno</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td>109204</tr><tr><td>Wright&agudo; s stain</td><td>Sigma</td><td>W0625</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Exposición por Inhalación</td><td>Glas-Col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nebulizador-Venturi</td><td>Glas-Col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tazas de helado</td><td>H&auml; agen-Dazs</td><td>Utilizados como jaulas para mosquitos Jaulas para mosquitos</td><td></td></tr><tr><td>con estructura metálica</td><td>Productos BioQuip</td><td>1450A</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-malaria coinfección sobre transmisión natural de mycobacterium tuberculosis y plasmodium berghei</i

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Las coinfecciones ocurren de forma natural debido a la coincidencia geográfica de los distintos tipos de organismos patógenos. Infecciones concurrentes muy probablemente modulan la respectiva respuesta inmunitaria a cada solo patógeno y pueden afectar con ello la patogénesis y evolución de la enfermedad. Los pacientes coinfectados también pueden responder diferencialmente a las intervenciones anti-infecciosos. La coinfección entre la tuberculosis como causada por micobacterias y el parásito de la malaria Plasmodium, los cuales son coendemic en muchas partes del África subsahariana, no se ha estudiado en detalle. Con el fin de abordar el reto, pero científicamente y clínicamente pregunta muy relevante cómo modular la coinfección tuberculosis-malaria inmunidad del huésped y el curso de cada enfermedad, establecimos un modelo experimental de ratón que nos permite diseccionar las respuestas inmunitarias producidas a ambos patógenos en el huésped coinfectados . Es de destacar que el fin de la mayoría de las infecciones humanas imitan a la perfección adquiridos naturalmente, realizamos experimentalinfecciones de ratones con ambos patógenos por parte de sus rutas naturales de infección, es decir, aerosol y picadura de un mosquito, respectivamente.

La infección de ratones con Mtb y P. berghei a través de la ruta natural, es decir, aerosol y picadura de un mosquito, respectivamente, los resultados en la infección coherente y reproducible de todos los animales (Tabla 1) 1. Podemos monitorear la infección exitosa y el curso de los dos la malaria y la tuberculosis mediante la determinación de la aparición inicial (prepatencia) y el número de parásitos en la sangre (P. berghei parasitemia) y la carga de Mtb en diferentes órganos, respectivamente. Un ejemplo de éxito de la transmisión del parásito de la malaria por la picadura de un mosquito infectado se muestra en la Tabla 1 y Figura 3. La alimentación de 10 mosquitos esporozoito infectados en cada ratón dio como resultado una tasa de infección del 100% según lo confirmado por la presencia de parásitos en el estadio en sangre 4-5 días después (Tabla 1 y Figura 3A). Es importante destacar que nos encontramos con el número de parásitos similares en la sangre de ratones individuales de la misma gr experimentaloup, lo que indica que la transmisión de esporozoito por los resultados de la mordedura de mosquito en una infección consistente y reproducible. Al comparar la prepatencia en los ratones control no tratados previamente con la de los animales Mtb coinfectados, podemos ver que prepatencia se retrasa ligeramente en ratones que habían sido preinfected con Mtb (Tabla 1, Figura 3B) 1. Como hemos informado anteriormente 1, podemos determinar el impacto de la coinfección Mtb en el curso de la malaria parasitemia seguimiento diario de Giemsa de frotis teñidos de sangre, como se muestra en la Figura 3B. La infección de ratones con Mtb por el uso de un sistema de exposición a la inhalación resultados en la deposición con éxito de las bacterias en los pulmones con relativamente baja variabilidad entre ratones individuales (Figura 4A). Podemos seguir cargas de micobacterias en los pulmones y otros órganos de interés a través del tiempo por la determinación de UFC. Un ejemplo para la carga micobacteriana en los pulmones deMtb infectado ratones C57BL / 6 en la ausencia o presencia de P. berghei se muestra en la Figura 4B. Tabla 1. Prepatencia después de la transmisión de esporozoito por picadura de mosquito. Todos los ratones desarrollaron infecciones del estadio en sangre después de la transmisión natural de P. berghei esporozoitos por picadura de mosquito. Adaptado de 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 con permiso. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Grupo de ratones Experimental (C57BL / 6) </td><td> Desafíe por 10 picaduras de mosquitos infecciosos </td><td> Número de sangre-fase animales positivos / N º de animales por grupo </td><td> Mean prepatencia [d] </td></tr><tr><td> ingenuo </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> Mtb infectado </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 5,5 d&gt; </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg"> Figura 1. Esquema general del procedimiento experimental. C57BL / 6 ratones se expone a Mtb-que contienen gotitas de aerosol en una cámara de aerosol Glas-Col. Un día después de la infección de aerosol, la absorción de Mtb se verificó por análisis de UFC de pulmón. 40 días después del desafío Mtb (cuando la tuberculosis se ha convertido en crónica en ratones infectados), los animales están expuestos a P. berghei infectado mosquitos. Para confirmar la transmisión de esporozoito éxito y seguir el curso de la infección por Plasmodium, la parasitemia es monitoreada diariamente en Giemsa de frotis teñidos de sangre a partir de 3 días después picadura de mosquito. / Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg "/&gt; Figura 2. Bosquejo de una jaula de mosquitos. Mosquitos infecciosos están contenidas dentro de un cartón, como un cuarto de litro de helado de cartón. Una pequeña abertura se corta en el lado de la caja de cartón y se cubre con una doble capa de látex con una hendidura cortada en cada pieza para crear una entrada segura para los mosquitos. Un trozo de papel de filtro se pega en la parte inferior en el interior de la caja de cartón para absorber los goteos. Copas de helado se cierran con una red (malla de nylon) que está fijado a la caja de cartón por la cinta y la banda elástica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg"> Figura 3. Parasitemia Sangre. A) Ejemplo de Wright `s frotis de sangre teñida mostrando eritrocitos parasitados (barra de escala, 20 &amp; #181;. M) B) La parasitemia en sangre de ratón se controló mediante el análisis diarios frotis de sangre teñidos con Giemsa. Ratones coinfectados tienen una parasitemia reducido en comparación con los ratones de Plasmodium individuales infectados (n = 10), y los resultados se muestran como medias ± SD; *** p &lt;0,001. Reproducido de 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 con permiso. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg"> Figura 4. La detección de Mtb en el pulmón. C57BL / 6 ratones fueron retados con aerosol 100 UFC de Mtb y 40 días más tarde, coinfectados por el P. B) Las bacterias berghei por picadura de mosquito. A) Un día después de la infección aerosol la captación del número deseado de Mtb se verificó mediante siembra de homogeneizados de pulmón entero para la determinación de UFC.l cargas en el momento de la coinfección se determinaron en lisados ​​de pulmón de 3 ratones a través de análisis de CFU (Mtb d40/d0). 12 días después de la coinfección, lisados ​​de pulmón se sembraron para el análisis de CFU para determinar el impacto de la coinfección por Plasmodium en el control de Mtb. Tenga en cuenta, que los números de Mtb en los pulmones se incrementaron durante la coinfección con P. berghei NK65. Etiquetado del eje X: tiempo después de Mtb -infection/time después de la coinfección. Adaptado de 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 con permiso.

La tuberculosis y la malaria son dos de las infecciones más prevalentes en los humanos y las principales causas de morbilidad y mortalidad en las poblaciones pobres de las zonas tropicales. Hemos establecido un sistema de modelo experimental para estudiar los resultados de la coinfección tuberculosis-la malaria en ratones tras la exposición a ambos patógenos a través de su vía natural de infección.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo experimental de ratón que pueda utilizarse para investigar las ramificaciones de la infección concurrente con la tuberculosis y la malaria in vivo. Esto se logra primero exponiendo los animales de experimentación a ellos. Tuberculosis que contiene gotitas de aerosol infecciosas que utilizan un sistema de exposición por inhalación.En el segundo paso, la absorción del número deseado de M tuberculosis se verifica mediante el análisis de UFC del tejido pulmonar. Un día después de la infección por aerosol, 40 días después, los ratones se exponen a mosquitos infecciosos para la transmisión natural de esporozoítos de plasmodium, que se depositan debajo de toda la piel durante la ingesta de sangre. En el paso final, el desarrollo del parásito de la etapa sanguínea de la malaria se monitorea mediante el análisis de manchas de giemsa, frotis de sangre.En última instancia, la carga de tuberculosis en el pulmón y el número de parásitos en la sangre de los animales coinfectados pueden enumerarse para determinar el curso de la tuberculosis y el paludismo, respectivamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la tuberculosis y la coinfección por malaria, como ¿Cómo influye la coinfección con el parásito de la malaria en la patogénesis y el control de la infección por Mycobacterium tuberculosis? Este protocolo se desarrolló para investigar cómo la coinfección con odium buri afecta la fase crónica de microbium tuberculosis, un ratón C 57 PL inmunocompetente en seis ratones.También se puede aplicar a otras cepas de ratones, incluidos los ratones knockout, o usarse con otras especies de micobacterias o odio. Comience calentando mycobacterium tuberculosis. Existencias de un título de UFC conocido.Cuando las células se hayan descongelado, utilice una jeringa de un mililitro provista de una aguja de calibre 27 para mezclar cuidadosamente la suspensión cinco veces para dispersar los grumos bacterianos, evitando la producción de aerosoles, dependiendo de la dosis de infección deseada transferir el volumen requerido del stock de micobacterias a un tubo de 50 mililitros que contenga PBS estéril hasta un volumen final de seis mililitros. A continuación, coloque los animales de experimentación individualmente en cestas de malla compartimentadas. Coloque las cestas en la cámara circular de aerosoles y cierre la tapa de la cámara.Conecte la unidad nebulizadora Venturi a las tres uniones de zócalo de acero inoxidable. Aspire la suspensión de micobacterias en una jeringa de 10 mililitros, equipada con una aguja roma de calibre 18 y lleve la jeringa a la cámara de aerosol en una caja de transporte cerrada. Ahora retire el tapón de rosca del nebulizador e inyecte con cuidado la suspensión de micobacterias en la unidad.Teniendo cuidado de evitar la generación de aerosoles. Deseche la jeringa en un recipiente para objetos punzocortantes que contenga 2% de Burton y luego selle el nebulizador. Ponga en marcha el aparato de inhalación cuando se complete el ciclo.Confirme que la suspensión de micobacterias se haya nebulizado completamente antes de abrir la cámara de aerosol. Coloque cascos de respirador purificador de aire motorizado, luego devuelva a los animales a sus jaulas, esterilice las canastas del nebulizador y el interior de la cámara de aerosol un día después de la infección por aerosol, coloque a los animales de control sacrificados designados en papel absorbente en un tablero de disección en un gabinete de bioseguridad de clase dos, y desinfecte los ratones con etanol al 70% por cada ratón. Primero, haga una pequeña incisión en el centro del abdomen y luego retraiga la piel sobre la cabeza del animal.A continuación, utilice unas tijeras quirúrgicas para abrir el abdomen y la caja torácica. Retire la pared torácica para que los pulmones sean accesibles y luego retírelos. Transfiera los pulmones a un tubo de 15 mililitros con dos mililitros de tampón de homogeneización, y luego use el émbolo de una jeringa de cinco mililitros para colar el tejido a través de tamices de 100 micrómetros en una pequeña placa de Petri.Utilizando una pipeta de un mililitro equipada con una punta de barrera, enjuague el tamiz varias veces y luego distribuya unos 250 microlitros del homogeneizado pulmonar entre ocho placas de agar. Use esparcidores desechables para colocar cuidadosamente las muestras cuando las placas estén secas. Selle cada placa con perfil.Envuélvalos en papel de aluminio e incubelos en posición vertical a 37 grados centígrados durante al menos cuatro semanas. Para infectar ratones naïve o infectados con micobacterias con malaria por picaduras de mosquitos, coloque animales anestesiados en la red de las jaulas para mosquitos, permitiendo que los mosquitos infecciosos se alimenten a través de la membrana para garantizar una transmisión exitosa de los esporozoítos. Deje a los ratones en las jaulas durante 10 a 15 minutos.Transfiera a los ratones de regreso a sus jaulas sobre una toalla de papel y cúbralos con una toalla de papel para mantenerlos calientes hasta que se despierten de la anestesia. Mata los mosquitos rociándolos con etanol al 70% u otros desinfectantes a través de la red de la jaula y esteriliza las jaulas esterilizándolas en autoclave. Para controlar el para, use una aguja para perforar el extremo de la vena de cada animal infectado y recolectar una gota de sangre.En cada extremo de un portaobjetos de vidrio, use otro portaobjetos para extraer una gota de sangre sobre la mitad de la longitud del portaobjetos inferior. A continuación, dale la vuelta al portaobjetos y utiliza el otro borde para la segunda mancha. Coloque los portaobjetos en una rejilla para teñir.Fije brevemente los frotis de sangre en metanol absoluto y luego séquelos al aire. Las diapositivas a continuación, sumergen las manchas en Giza. Después de 10 minutos, sumerja los portaobjetos dentro y fuera de las vetas de tinte llenas de agua desionizada varias veces para enjuagar el exceso de mancha.Por último, seca al aire los portaobjetos en posición vertical. La infección inducida por esporozoítos en animales de experimentación por picaduras de mosquitos da como resultado una tasa de infección del 100%, como lo confirma la presencia de parásitos en la etapa sanguínea cuatro o cinco días después. Como se ilustra en el cuadro, la infección por picaduras de mosquitos en ratones infectados por Plasmodium buri y con tuberculosis M da lugar a una infección coherente y reproducible de todos los animales de un grupo experimental.Al comparar los ratones de control con prepermeabilidad y los ratones control ingenuos con los animales coinfectados con Mycobacterium tuberculosis, se puede observar que la prepermeabilidad se retrasa ligeramente. En ratones que han sido preinfectados con Mycobacterium tuberculosis en ratones con Mycobacterium tuberculosis mediante el uso de un sistema de exposición por inhalación, se obtiene la deposición exitosa de bacterias en los pulmones del animal con una variabilidad relativamente baja entre ratones individuales. Las cargas micobacterianas en los pulmones de los ratones infectados C 57 black six aumentan en presencia de p burga.Por el contrario, los ratones coinfectados tienen una paraemia reducida en comparación con los ratones infectados por plasmodium solo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como la citometría de flujo, la PCR, Eliza o técnicas histológicas en el tejido o fluidos corporales de interés para diseccionar las respuestas inmunitarias provocadas simultáneamente contra los parásitos y los tubérculos y sus interacciones en el huésped coinfectado. No olvide que trabajar con el patógeno humano microbacterium tuberculosis puede ser extremadamente peligroso y se deben tomar medidas para evitar la exposición a aerosoles infecciosos en todo momento.Todos los trabajos experimentales relacionados con la microbacteria tuberculosis deben llevarse a cabo en instalaciones adecuadas de nivel de bioseguridad tres.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Fuente: Mueller, A., et al. Un modelo experimental para estudiar la coinfección tuberculosis-malaria tras la transmisión natural de Mycobacterium tuberculosis y Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)Este vídeo muestra la administración en aerosoles de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a ratones utilizando un sistema de cámaras basado en nebulizador para inducir infecciones pulmonares, proporcionando un modelo controlado y reproducible para estudiar la transmisión aérea de la tuberculosis y las...

Administración en aerosoles de Mycobacterium tuberculosis para infección pulmonar en un modelo murino

Este video muestra un método para estudiar las respuestas a la infección por Mycobacterium tuberculosis en macrófagos derivados de monocitos polarizados M1 y M2 humanos. El uso de la citometría de flujo permite el estudio de una variedad de marcadores de superficie asociados con poblaciones de macrófagos infectados y no infectados.

Un modelo de infección por macrófagos totalmente diferenciado de células derivadas de monocitos con Mycobacterium tuberculosis

Este video muestra la generación de un modelo de cultivo celular in vitro de coinfección malaria-VIH. Las células mononucleares de sangre periférica infectadas por el VIH cocultivadas con eritrocitos parasitados por Plasmodium falciparum pueden apoyar el crecimiento mutuo y proporcionar información sobre las respuestas inmunitarias y la progresión de la enfermedad en las coinfecciones por el VIH y la malaria.

Generación de un modelo de cultivo celular in vitro de coinfección malaria-VIH

Este video muestra la generación de un modelo experimental de ratón de malaria cerebral. Los esporozoítos aislados de mosquitos hembra infectados con Plasmodium berghei se inyectan en las venas de la cola de un ratón restringido, lo que provoca la ruptura de la barrera hematoencefálica y la inflamación del cerebro, causando malaria cerebral. Este modelo de ratón infectado ofrece una valiosa herramienta para estudiar in vivo la patología microvascular asociada a la malaria cerebral.

Generación de un modelo murino de malaria cerebral experimental utilizando esporozoítos derivados de mosquitos huéspedes

La coinfección humana es difícil de replicar in vitro. Sin embargo, los parásitos de la malaria humana pueden cultivarse fácilmente in vitro, al igual que las células mononucleares de sangre periférica humana recién aisladas infectadas naturalmente con el VIH. Esto proporciona un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunitarias tempranas a los parásitos de la malaria en el contexto de la coinfección por el VIH.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

La infección por tuberculosis humana es un proceso complejo, difícil de modelar in vitro. Aquí describimos un nuevo modelo de tejido pulmonar humano en 3D que recapitula la dinámica que ocurre durante la infección, incluida la migración de células inmunitarias y la formación temprana de granuloma en un entorno fisiológico.

Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infección

Describimos un modelo de ratón de malaria cerebral experimental y mostramos cómo se puede rastrear la patología inflamatoria y microvascular in vivo utilizando imágenes de resonancia magnética.

Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

Aquí, presentamos un protocolo de tuberculosis humana modelo en un pez cebra adulto utilizando su patógeno natural marinum de la micobacteria. Extraen ADN y ARN de los órganos internos del pez cebra infectado pueden utilizarse para revelar que el total de micobacterias cargas en los peces y la respuesta inmune del hospedador con qPCR.

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

Galleria mellonella se estableció recientemente como un modelo de infección reproducible, barato y éticamente aceptable para el complejo Mycobacterium tuberculosis. Aquí describimos y demostramos los pasos dados para establecer una infección exitosa de G. mellonella con Bioluminiscente Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende a establecer un modelo experimental de coinfección de tuberculosis y malaria en ratones mediante inhalación de aerosoles y transmisión natural por mosquitos. Este método permite investigar la patogénesis y respuesta inmune in vivo.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei /i (Video) | JoVE Journal

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei

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