Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo experimental de ratón que pueda utilizarse para investigar las ramificaciones de la infección concurrente con la tuberculosis y la malaria in vivo. Esto se logra primero exponiendo los animales de experimentación a ellos. Tuberculosis que contiene gotitas de aerosol infecciosas que utilizan un sistema de exposición por inhalación.

En el segundo paso, la absorción del número deseado de M tuberculosis se verifica mediante el análisis de UFC del tejido pulmonar. Un día después de la infección por aerosol, 40 días después, los ratones se exponen a mosquitos infecciosos para la transmisión natural de esporozoítos de plasmodium, que se depositan debajo de toda la piel durante la ingesta de sangre. En el paso final, el desarrollo del parásito de la etapa sanguínea de la malaria se monitorea mediante el análisis de manchas de giemsa, frotis de sangre.

En última instancia, la carga de tuberculosis en el pulmón y el número de parásitos en la sangre de los animales coinfectados pueden enumerarse para determinar el curso de la tuberculosis y el paludismo, respectivamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la tuberculosis y la coinfección por malaria, como ¿Cómo influye la coinfección con el parásito de la malaria en la patogénesis y el control de la infección por Mycobacterium tuberculosis? Este protocolo se desarrolló para investigar cómo la coinfección con odium buri afecta la fase crónica de microbium tuberculosis, un ratón C 57 PL inmunocompetente en seis ratones.

También se puede aplicar a otras cepas de ratones, incluidos los ratones knockout, o usarse con otras especies de micobacterias o odio. Comience calentando mycobacterium tuberculosis. Existencias de un título de UFC conocido.

Cuando las células se hayan descongelado, utilice una jeringa de un mililitro provista de una aguja de calibre 27 para mezclar cuidadosamente la suspensión cinco veces para dispersar los grumos bacterianos, evitando la producción de aerosoles, dependiendo de la dosis de infección deseada transferir el volumen requerido del stock de micobacterias a un tubo de 50 mililitros que contenga PBS estéril hasta un volumen final de seis mililitros. A continuación, coloque los animales de experimentación individualmente en cestas de malla compartimentadas. Coloque las cestas en la cámara circular de aerosoles y cierre la tapa de la cámara.

Conecte la unidad nebulizadora Venturi a las tres uniones de zócalo de acero inoxidable. Aspire la suspensión de micobacterias en una jeringa de 10 mililitros, equipada con una aguja roma de calibre 18 y lleve la jeringa a la cámara de aerosol en una caja de transporte cerrada. Ahora retire el tapón de rosca del nebulizador e inyecte con cuidado la suspensión de micobacterias en la unidad.

Teniendo cuidado de evitar la generación de aerosoles. Deseche la jeringa en un recipiente para objetos punzocortantes que contenga 2% de Burton y luego selle el nebulizador. Ponga en marcha el aparato de inhalación cuando se complete el ciclo.

Confirme que la suspensión de micobacterias se haya nebulizado completamente antes de abrir la cámara de aerosol. Coloque cascos de respirador purificador de aire motorizado, luego devuelva a los animales a sus jaulas, esterilice las canastas del nebulizador y el interior de la cámara de aerosol un día después de la infección por aerosol, coloque a los animales de control sacrificados designados en papel absorbente en un tablero de disección en un gabinete de bioseguridad de clase dos, y desinfecte los ratones con etanol al 70% por cada ratón. Primero, haga una pequeña incisión en el centro del abdomen y luego retraiga la piel sobre la cabeza del animal.

A continuación, utilice unas tijeras quirúrgicas para abrir el abdomen y la caja torácica. Retire la pared torácica para que los pulmones sean accesibles y luego retírelos. Transfiera los pulmones a un tubo de 15 mililitros con dos mililitros de tampón de homogeneización, y luego use el émbolo de una jeringa de cinco mililitros para colar el tejido a través de tamices de 100 micrómetros en una pequeña placa de Petri.

Utilizando una pipeta de un mililitro equipada con una punta de barrera, enjuague el tamiz varias veces y luego distribuya unos 250 microlitros del homogeneizado pulmonar entre ocho placas de agar. Use esparcidores desechables para colocar cuidadosamente las muestras cuando las placas estén secas. Selle cada placa con perfil.

Envuélvalos en papel de aluminio e incubelos en posición vertical a 37 grados centígrados durante al menos cuatro semanas. Para infectar ratones naïve o infectados con micobacterias con malaria por picaduras de mosquitos, coloque animales anestesiados en la red de las jaulas para mosquitos, permitiendo que los mosquitos infecciosos se alimenten a través de la membrana para garantizar una transmisión exitosa de los esporozoítos. Deje a los ratones en las jaulas durante 10 a 15 minutos.

Transfiera a los ratones de regreso a sus jaulas sobre una toalla de papel y cúbralos con una toalla de papel para mantenerlos calientes hasta que se despierten de la anestesia. Mata los mosquitos rociándolos con etanol al 70% u otros desinfectantes a través de la red de la jaula y esteriliza las jaulas esterilizándolas en autoclave. Para controlar el para, use una aguja para perforar el extremo de la vena de cada animal infectado y recolectar una gota de sangre.

En cada extremo de un portaobjetos de vidrio, use otro portaobjetos para extraer una gota de sangre sobre la mitad de la longitud del portaobjetos inferior. A continuación, dale la vuelta al portaobjetos y utiliza el otro borde para la segunda mancha. Coloque los portaobjetos en una rejilla para teñir.

Fije brevemente los frotis de sangre en metanol absoluto y luego séquelos al aire. Las diapositivas a continuación, sumergen las manchas en Giza. Después de 10 minutos, sumerja los portaobjetos dentro y fuera de las vetas de tinte llenas de agua desionizada varias veces para enjuagar el exceso de mancha.

Por último, seca al aire los portaobjetos en posición vertical. La infección inducida por esporozoítos en animales de experimentación por picaduras de mosquitos da como resultado una tasa de infección del 100%, como lo confirma la presencia de parásitos en la etapa sanguínea cuatro o cinco días después. Como se ilustra en el cuadro, la infección por picaduras de mosquitos en ratones infectados por Plasmodium buri y con tuberculosis M da lugar a una infección coherente y reproducible de todos los animales de un grupo experimental.

Al comparar los ratones de control con prepermeabilidad y los ratones control ingenuos con los animales coinfectados con Mycobacterium tuberculosis, se puede observar que la prepermeabilidad se retrasa ligeramente. En ratones que han sido preinfectados con Mycobacterium tuberculosis en ratones con Mycobacterium tuberculosis mediante el uso de un sistema de exposición por inhalación, se obtiene la deposición exitosa de bacterias en los pulmones del animal con una variabilidad relativamente baja entre ratones individuales. Las cargas micobacterianas en los pulmones de los ratones infectados C 57 black six aumentan en presencia de p burga.

Por el contrario, los ratones coinfectados tienen una paraemia reducida en comparación con los ratones infectados por plasmodium solo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como la citometría de flujo, la PCR, Eliza o técnicas histológicas en el tejido o fluidos corporales de interés para diseccionar las respuestas inmunitarias provocadas simultáneamente contra los parásitos y los tubérculos y sus interacciones en el huésped coinfectado. No olvide que trabajar con el patógeno humano microbacterium tuberculosis puede ser extremadamente peligroso y se deben tomar medidas para evitar la exposición a aerosoles infecciosos en todo momento.

Todos los trabajos experimentales relacionados con la microbacteria tuberculosis deben llevarse a cabo en instalaciones adecuadas de nivel de bioseguridad tres.