Transformación de la levadura y clonación

Levadura o Saccharomyces cerevisiae, es un organismo extenso modelo eucariotas simples utilizado en el estudio de genética y biología celular que puede dar ideas sobre los procesos celulares humanos. Este video trata sobre la transformación - la captación de DNA extraño por la célula de levadura. Presentará plásmidos de levadura, como preparar levadura las células para la transformación, un procedimiento de transformación paso a paso y proporcionará algunas aplicaciones de esta técnica fundamental.

Antes de hablar de la transformación de la levadura, hablemos primero de un tipo de ADN utilizado en transformación: el plásmido. Un plásmido es un pequeño, circular, doble cadena ADN que puede supercoil por lo que puede pasar fácilmente a través de poros en la membrana de la célula.

Plásmidos contienen un sitio de clonación múltiple o MCS donde endonucleases de la restricción, AKA &quo; enzimas de restricción &quo;, puede cortar el ADN. Fragmentos de ADN de interés con las mismas enzimas entonces pueden ser ligadas en los MCS. Plásmidos también contienen un origen de replicación u ORI que señala a la celda donde debe comenzar la replicación. Además, los plásmidos tienen un marcador seleccionable, que permite a las células de levadura que contienen el plásmido para crecer bajo condiciones ambientales específicas. Levadura que no incorporan con éxito el plásmido no podrá sobrevivir en medios que contienen el marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables pueden codificar para genes que permiten la resistencia a los fármacos o genes que codifican las enzimas que permiten a una cepa de levadura sintetizar los aminoácidos que de lo contrario no se producen.

Vectores lanzadera son plásmidos que pueden replicarse en más de una especie. Por ejemplo, un plásmido de e. Coli puede crecer en la levadura. Plásmidos de levadura pueden no integrar o integrar, significa que el plásmido combina con el ADN genómico o sigue siendo independiente.

Hay cinco tipos generales de plásmidos o vectores que se utilizan en la levadura. Los dos que se utilizan más a menudo en la transformación de la levadura son el plásmido episomal de levaduras YEp y el plásmido centrometic de levadura o YCp. Ambos de estos tipos de vectores contienen una secuencia de replicación autónoma o ARS. El ARS contiene el origen de replicación y permite replicación Extracromosómica en levadura.

Hay varios procedimientos diferentes que pueden utilizarse para transformar la levadura que incluye el método spheroplast, electroporación y transformación mediada de acetato de litio. Para este video nos centraremos en el procedimiento de acetato de litio.

En este litio cargados positivamente de método de transformación cationes neutralizan las cargas en la membrana celular y el ADN de hebra simple de ADN de plásmido - añade a la mezcla de transformación - se une a la pared celular de la levadura y deja el plásmido ADN disponible para absorción por las células de levadura. La exposición a un aumento repentino en la temperatura o choque térmico crea una diferencia de presión entre el interior y fuera de la célula creando poros que ADN de plásmido puede pasar a través. Al disminuir la temperatura, la pared celular de levadura se reforma y transformación es completa.

Vamos a empezar con un procedimiento paso a paso de cómo preparar la levadura para la transformación. Las células de levadura deben ser preparadas por la primera cosecha una colonia de una placa de agar y amplificación de la colonia de levadura Extracto de medio de peptona dextrosa, abreviado YPD - un medio completo para el crecimiento de la levadura.

Después de la Colonia es entre una placa y coloca en medio YPD, el cultivo se incuba durante la noche a 30 ° C con agitación en un aparato agitador o rodillo, como puedes ver aquí. Las células de levadura son peleteadas por centrifugación y se quita el supernant. Las células sedimentadas son resuspender con el tampón deseado o agua estéril. Estas células de levadura preparado competente se utilizará en el procedimiento de transformación.

Una vez que las células de levadura han sido preparadas, transformación puede llevarse a cabo con la primera preparación de la mezcla de transformación.

Esta mezcla de reactivo debe incluir: estéril destilada agua; una solución de 50% de glicol de polietileno o PEG, acetato de litio 1 M, 10 mg/ml solución de monocatenario DNA, DNA plasmídico y células de levadura competente. Las proporciones exactas de cada solución deben calcularse antes de comenzar el experimento mediante la consulta de protocolo estándar del laboratorio para la transformación de la levadura.

La mezcla luego se incubaron a 30 ° C durante 30 minutos con agitación. La solución se deben mezclar, no agitarse, para asegurar que no rompen las células de levadura.

Las células son calor-dio una sacudida eléctrica por la colocación en un baño de agua de 42 ° C durante 15 minutos, seguidos de un enfriamiento en hielo durante 2 minutos. Luego se cosechan las células por centrifugación.

Las células se resuspendió en agua destilada doble y están revestidas en placas de agar que seleccionarán para la deseada transformantes. Placas de transformación son luego se incubaron a 30 ° C durante dos a cuatro días hasta que se formen las colonias.

Procedimientos de transformación deben incluir siempre placas de control positivos y negativos hasta que se optimizan. El control positivo debe ser una suspensión de células de levadura con ADN plásmido en una placa YPD que no contiene ningún marcador seleccionable. Esto demuestra que las células estén sanas siguiendo el procedimiento de transformación. La placa de control negativo debe ser una suspensión de células de levadura en una placa de selección adecuada, como uno que contenga antibióticos. La placa no debe tener colonias y muestra que no hay contaminación.

Hay una gran variedad de diferentes aplicaciones para la transformación de la levadura. Una aplicación de levadura transformada es utilizar un sistema híbrido de levadura-dos para identificar proteínas que interaccionan con la proteína de interés, o la proteína cebo. Cuando un plásmido de una biblioteca de candidato Unión socios, o las proteínas de la presa, se transforman y hay una interacción, se libera un factor de transcripción que activa un gen reportero, como Beta-galactosidasa. El gen reportero convertirá las colonias que tienen una interacción azul cuando en las placas que contienen X-gal, un substrato para el beta-galadosidase.

Canceladuras múltiples pueden diseñarse en levadura a través de una técnica usando ciclo sexual. Las células haploides que contienen un reportero y borrado del lugar se combinan en una célula a través surtido al azar o de la recombinación meiótica. Se utilizan marcadores seleccionables para seleccionar levaduras que han incorporado con éxito las eliminaciones. En este caso, citometría de flujo se utiliza para seleccionar las células que expresan GFP.

La levadura puede ser transformada con proteínas que llevan la etiqueta fluorescente para ver el efecto de mutaciones en las interacciones proteína-proteína. Este artículo de vídeo utilizado microscopia fluorescente para estudiar los efectos de diversas mutaciones en las interacciones proteína-proteína esenciales para la endocitosis.

Sólo ha visto video de JoVEs en la transformación de la levadura. Ahora debe comprender los aspectos básicos de un plásmido, cómo preparar las células de levadura para la transformación y cómo llevar a cabo el procedimiento de transformación. ¡Como siempre, gracias por ver!