Transformación de la levadura y clonación

Yeast Transformation and Cloning

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Yeast Transformation and Cloning

3.2: Drosophila Maintenance

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08:30 min

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May 10, 2013

Overview

S. cerevisiae son unicelulares eucariotas que son un organismo modelo utilizado comúnmente en la investigación biológica. En el curso de su trabajo, los investigadores de la levadura dependen de la técnica fundamental de la transformación (la captación de DNA extraño por la célula) para controlar la expresión génica, inducir supresiones genéticas y proteínas recombinantes expresan estructuras subcelulares de la etiqueta.

Este video ofrece una visión general de cómo y por qué la transformación de la levadura se lleva a cabo en el laboratorio. Se presentarán las características importantes de plásmidos de la levadura, junto con el procedimiento requerido para preparar las células de levadura para incorporar nuevos plásmidos. La presentación también incluye un protocolo paso a paso para el método de acetato de litio de la transformación de la levadura. Por último, se proporcionarán ejemplos de las muchas aplicaciones de esta técnica esencial.

Procedure

Levadura o Saccharomyces cerevisiae, es un organismo extenso modelo eucariotas simples utilizado en el estudio de genética y biología celular que puede dar ideas sobre los procesos celulares humanos. Este video trata sobre la transformación – la captación de DNA extraño por la célula de levadura. Presentará plásmidos de levadura, como preparar levadura las células para la transformación, un procedimiento de transformación paso a paso y proporcionará algunas aplicaciones de esta técnica fundamental.

Antes de hablar de la transformación de la levadura, hablemos primero de un tipo de ADN utilizado en transformación: el plásmido. Un plásmido es un pequeño, circular, doble cadena ADN que puede supercoil por lo que puede pasar fácilmente a través de poros en la membrana de la célula.

Plásmidos contienen un sitio de clonación múltiple o MCS donde endonucleases de la restricción, AKA &quo; enzimas de restricción &quo;, puede cortar el ADN. Fragmentos de ADN de interés con las mismas enzimas entonces pueden ser ligadas en los MCS. Plásmidos también contienen un origen de replicación u ORI que señala a la celda donde debe comenzar la replicación. Además, los plásmidos tienen un marcador seleccionable, que permite a las células de levadura que contienen el plásmido para crecer bajo condiciones ambientales específicas. Levadura que no incorporan con éxito el plásmido no podrá sobrevivir en medios que contienen el marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables pueden codificar para genes que permiten la resistencia a los fármacos o genes que codifican las enzimas que permiten a una cepa de levadura sintetizar los aminoácidos que de lo contrario no se producen.

Vectores lanzadera son plásmidos que pueden replicarse en más de una especie. Por ejemplo, un plásmido de e. Coli puede crecer en la levadura. Plásmidos de levadura pueden no integrar o integrar, significa que el plásmido combina con el ADN genómico o sigue siendo independiente.

Hay cinco tipos generales de plásmidos o vectores que se utilizan en la levadura. Los dos que se utilizan más a menudo en la transformación de la levadura son el plásmido episomal de levaduras YEp y el plásmido centrometic de levadura o YCp. Ambos de estos tipos de vectores contienen una secuencia de replicación autónoma o ARS. El ARS contiene el origen de replicación y permite replicación Extracromosómica en levadura.

Hay varios procedimientos diferentes que pueden utilizarse para transformar la levadura que incluye el método spheroplast, electroporación y transformación mediada de acetato de litio. Para este video nos centraremos en el procedimiento de acetato de litio.

En este litio cargados positivamente de método de transformación cationes neutralizan las cargas en la membrana celular y el ADN de hebra simple de ADN de plásmido – añade a la mezcla de transformación – se une a la pared celular de la levadura y deja el plásmido ADN disponible para absorción por las células de levadura. La exposición a un aumento repentino en la temperatura o choque térmico crea una diferencia de presión entre el interior y fuera de la célula creando poros que ADN de plásmido puede pasar a través. Al disminuir la temperatura, la pared celular de levadura se reforma y transformación es completa.

Vamos a empezar con un procedimiento paso a paso de cómo preparar la levadura para la transformación. Las células de levadura deben ser preparadas por la primera cosecha una colonia de una placa de agar y amplificación de la colonia de levadura Extracto de medio de peptona dextrosa, abreviado YPD – un medio completo para el crecimiento de la levadura.

Después de la Colonia es entre una placa y coloca en medio YPD, el cultivo se incuba durante la noche a 30 ° C con agitación en un aparato agitador o rodillo, como puedes ver aquí. Las células de levadura son peleteadas por centrifugación y se quita el supernant. Las células sedimentadas son resuspender con el tampón deseado o agua estéril. Estas células de levadura preparado competente se utilizará en el procedimiento de transformación.

Una vez que las células de levadura han sido preparadas, transformación puede llevarse a cabo con la primera preparación de la mezcla de transformación.

Esta mezcla de reactivo debe incluir: estéril destilada agua; una solución de 50% de glicol de polietileno o PEG, acetato de litio 1 M, 10 mg/ml solución de monocatenario DNA, DNA plasmídico y células de levadura competente. Las proporciones exactas de cada solución deben calcularse antes de comenzar el experimento mediante la consulta de protocolo estándar del laboratorio para la transformación de la levadura.

La mezcla luego se incubaron a 30 ° C durante 30 minutos con agitación. La solución se deben mezclar, no agitarse, para asegurar que no rompen las células de levadura.

Las células son calor-dio una sacudida eléctrica por la colocación en un baño de agua de 42 ° C durante 15 minutos, seguidos de un enfriamiento en hielo durante 2 minutos. Luego se cosechan las células por centrifugación.

Las células se resuspendió en agua destilada doble y están revestidas en placas de agar que seleccionarán para la deseada transformantes. Placas de transformación son luego se incubaron a 30 ° C durante dos a cuatro días hasta que se formen las colonias.

Procedimientos de transformación deben incluir siempre placas de control positivos y negativos hasta que se optimizan. El control positivo debe ser una suspensión de células de levadura con ADN plásmido en una placa YPD que no contiene ningún marcador seleccionable. Esto demuestra que las células estén sanas siguiendo el procedimiento de transformación. La placa de control negativo debe ser una suspensión de células de levadura en una placa de selección adecuada, como uno que contenga antibióticos. La placa no debe tener colonias y muestra que no hay contaminación.

Hay una gran variedad de diferentes aplicaciones para la transformación de la levadura. Una aplicación de levadura transformada es utilizar un sistema híbrido de levadura-dos para identificar proteínas que interaccionan con la proteína de interés, o la proteína cebo. Cuando un plásmido de una biblioteca de candidato Unión socios, o las proteínas de la presa, se transforman y hay una interacción, se libera un factor de transcripción que activa un gen reportero, como Beta-galactosidasa. El gen reportero convertirá las colonias que tienen una interacción azul cuando en las placas que contienen X-gal, un substrato para el beta-galadosidase.

Canceladuras múltiples pueden diseñarse en levadura a través de una técnica usando ciclo sexual. Las células haploides que contienen un reportero y borrado del lugar se combinan en una célula a través surtido al azar o de la recombinación meiótica. Se utilizan marcadores seleccionables para seleccionar levaduras que han incorporado con éxito las eliminaciones. En este caso, citometría de flujo se utiliza para seleccionar las células que expresan GFP.

La levadura puede ser transformada con proteínas que llevan la etiqueta fluorescente para ver el efecto de mutaciones en las interacciones proteína-proteína. Este artículo de vídeo utilizado microscopia fluorescente para estudiar los efectos de diversas mutaciones en las interacciones proteína-proteína esenciales para la endocitosis.

Sólo ha visto video de JoVEs en la transformación de la levadura. Ahora debe comprender los aspectos básicos de un plásmido, cómo preparar las células de levadura para la transformación y cómo llevar a cabo el procedimiento de transformación. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Yeast or Saccharomyces cerevisiae, is a widespread simple eukaryotic model organism used in the study of genetics and cell biology that can give insights into human cellular processes. This video discusses transformation – the uptake of foreign DNA by the yeast cell. It will introduce yeast plasmids, how to prepare yeast cells for transformation, a step-by-step transformation procedure, and will provide some applications of this fundamental technique.

Before we talk about the transformation of yeast, let’s first discuss a type of DNA used in transformation: the plasmid. A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA that can supercoil so it can easily pass through pores in a cell membrane.

Plasmids contain a multiple cloning site or MCS where restriction endonucleases, AKA “restriction enzymes”, can cut DNA. DNA fragments of interest cut with the same enzymes can then be ligated into the MCS. Plasmids also contain an origin of replication or ORI that signals to the cell where replication should begin. In addition, plasmids have a selectable marker, which allows the yeast cells that contain the plasmid to grow under specific environmental conditions. Yeast that don’t successfully incorporate the plasmid will not survive in media containing the selectable marker. The selectable markers can encode for genes that enable drug-resistance or genes that encode enzymes that enable a yeast strain to synthesize amino acids that they otherwise cannot produce.

Shuttle vectors are plasmids that can replicate in more than one host species. For instance, a plasmid from E. Coli can grow in yeast. Yeast Plasmids can be non-integrating or integrating, mean that the plasmid either combines with the genomic DNA or remains independent.

There are five different general types of plasmids or vectors that are used in yeast. The two that are used most often in the transformation of yeast are the yeast episomal plasmid or YEp and the yeast centrometic plasmid or YCp . Both of these types of vectors contain an autonomous replication sequence or ARS. The ARS contains the origin of replication and allows for extrachromosomal replication in yeast.

There are several different procedures that can be used to transform yeast which include the spheroplast method, electroporation, and lithium acetate-mediated transformation. For this video we will focus on the lithium acetate procedure.

In this transformation method positively-charged lithium cations neutralize charges on the cell membrane and plasmid DNA Single-stranded DNA – added to the transformation mixture – binds to the cell wall of the yeast and leaves the plasmid DNA available for uptake by the yeast cells . The exposure to a sudden increase in temperature, or heat shock creates a pressure difference between the inside and outside of the cell creating pores that plasmid DNA can pass through. When the temperature is decreased, the yeast cell wall will reform and transformation is complete.

Let’s begin with a step-by-step procedure of how to prepare yeast for transformation. Yeast cells must be prepared by first picking a colony from an agar plate and amplifying the colony in yeast extract peptone dextrose medium, abbreviated YPD – a complete medium for yeast growth.

After the colony is picked from a plate and placed into YPD medium, the culture is incubated overnight at 30 °C with agitation on a shaker or roller apparatus, like you see here. The yeast cells are pelleted by centrifugation and the supernant is removed. The pelleted cells are resuspend with the desired buffer or sterile water. These competent prepared yeast cells will be used in the transformation procedure.

Once yeast cells have been prepared, transformation can be carried out by first preparing the transformation mixture.

This reagent mixture should include: sterile distilled water; a solution of 50% polyethylene glycol or PEG, 1M lithium acetate, 10 mg/ml solution of single-stranded DNA, plasmid DNA and competent yeast cells. The exact proportions of each solution should be calculated before beginning the experiment by consulting your laboratory’s standard protocol for yeast transformation.

The mixture is then incubated at 30 °C for 30 minutes with shaking. The solution should be mixed, not vortexed, to ensure the yeast cells do not break apart.

The cells are heat-shocked by placement in a 42 °C water bath for 15 minutes followed by cooling on ice for 2 minutes. The cells are then harvested by centrifugation.

Cells are resuspended in double-distilled water and are plated on agar plates that will select for the desired transformants. Transformation plates are then incubated at 30 °C for two to four days until colonies form.

Transformation procedures should always include positive and negative control plates until they are optimized. The positive control should be a yeast cell suspension with plasmid DNA on a YPD plate that does not contain any selectable marker. This shows that the cells are healthy following the transformation procedure. The negative control plate should be a yeast cell suspension on an appropriate selection plate, such as one that contains antibiotics. The plate should have no colonies and shows that there is no contamination.

There are a myriad of different applications for yeast transformation. One application of transformed yeast is to use a yeast-two hybrid system to identify proteins that interact with your protein of interest, or the bait protein. When a plasmid from a library of candidate binding partners, or prey proteins, are transformed and there is an interaction, a transcription factor is released that will activate a reporter gene, such as Beta-galactosidase. The reporter gene will turn colonies that have an interaction blue when on plates that contain X-gal — a substrate for beta-galadosidase.

Multiple deletions can be engineered into yeast through a technique using sexual cycling. Haploid cells that contain a reporter and deleted locus are combined into one cell through random assortment or meiotic recombination. Selectable markers are used to select for yeast that have successfully incorporated the deletions. In this case, flow cytometry is used to select for cells that express GFP.

Yeast can be transformed with proteins that are fluorescently labeled to view the effect of mutations on protein-protein interactions. This video-article used fluorescent microscopy to study the effects of different mutations on protein-protein interactions essential for endocytosis.

You’ve just watched JoVEs video on yeast transformation. You should now understand the basic aspects of a plasmid, how to prepare yeast cells for transformation and how to perform the transformation procedure. As always, thanks for watching!

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