Producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados

El objetivo general de este procedimiento es construir, producir y purificar vectores derivados del adenovirus canino tipo dos. Esto se logra clonando primero el gen de interés en un plásmido lanzadera. El segundo paso es obtener un plásmido genómico recombinante por recombinación homóloga.

A continuación, el ternero defectuoso recombinante, dos virus producidos y amplificados en una línea celular complementaria trans. El paso final es purificar y concentrar el virus recombinante resultante para diversas aplicaciones in vivo e in vitro. En última instancia, la microscopía confocal de inmunofluorescencia se utiliza para mostrar ejemplos de transducción viral en el cerebro de roedores.

La principal ventaja de estas técnicas sobre los métodos existentes, como los vectores derivados de la neurosis humana ad, es que no existe inmunidad preexistente contra la ternera dos en las poblaciones humanas. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la vacunación o la terapia génica, como la evaluación del papel de las proteínas expresadas en áreas específicas del cerebro. Por lo tanto, la demostración de este procedimiento será May KY y Corin Bergeron.

Dos investigadores postdoctorales de nuestros laboratorios se preparan para este procedimiento un día antes de la transfección sembrando células DKE one en una placa de seis pocillos para cultivar células a 37 grados Celsius y 5% de CO2 en DMEM con alto contenido de glucosa que contiene 7% de calor, ternero fetal inactivado, sodio sérico, piruvato, penicilina y estreptomicina. Al día siguiente, las células deben ser del 70 al 80% confluentes para la transfección digerir dos microgramos de pcal GOI el plásmido recombinante cav dos plásmido genómico con ASC uno para liberar la secuencia no viral del plásmido, verifique el patrón de restricción resultante en un 0.8% La digestión por electroforesis en gel agro debe producir un fragmento de par de aproximadamente 31 kilobases que contiene el genoma recombinante y un fragmento de par de dos kilobases correspondiente a la columna vertebral del plásmido. Mezcle el ADN digerido con 200 microlitros de tampón jet prime y vórtice durante 10 segundos.

Agregue cuatro microlitros de jet prime y mezcle en vórtice durante 10 segundos. Gire brevemente para eliminar las gotas e incube durante 10 minutos. A temperatura ambiente, agregue la mezcla de transfección gota a gota sobre las celdas DKE one.

Agite suavemente el plato para distribuir uniformemente la mezcla e incubar a 37 grados centígrados. Una semana después de la transfección, recoja las células y el medio de cultivo en un tubo de polipropileno de 15 mililitros. Interrumpe las células mediante tres ciclos de pensamiento de congelación.

Limpie el lisado por centrifugación durante 10 minutos a 1, 800 veces G. Recoja el sobrenadante y guárdelo a menos 20 para la posterior propagación del virus para propagar el virus infectar una monocapa confluente de 80 a 90% de células DKE una cultivadas en un pocillo de una placa de seis pocillos con 0,5 mililitros del virus que contiene sobrenadante. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora bajo agitación leve Después de una hora. Retire el inóculo y reemplácelo con 1,5 mililitros de DMEM completo que contenga 5%Células de incubación de FCS inactivadas por calor a 37 grados centígrados durante tres o cuatro días.

Las células deben ser monitoreadas diariamente para detectar la aparición de un efecto citopático o CPE. Si no se ve un CPE claro. Recolectar células después de cuatro días de cultivo y repetir la amplificación viral cuando un CPE claro afecta a la mayoría de las células.

Por lo general, después de dos a cuatro rondas de amplificación viral, recoja las células con medio de cultivo y congele y descongele tres veces, como se demostró anteriormente. Infectan entre el 80 y el 90% de los confluentes. DKE una célula cultivada en tres placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros de diámetro utilizando 1,5 mililitros de virus que contienen sobrenadante por placa después de tres o cuatro días cuando se completa el CPE.

Las células de recolección de estos platos de 10 centímetros de diámetro las interrumpen en tres ciclos de estilo libre y limpian el lisado por centrifugación durante 10 minutos a 1.800 veces. G recoja el sobrenadante y almacene a menos 20 para la amplificación a gran escala Cav dos para comenzar el procedimiento de escalado infecte el 80 al 90% de las monocapas confluentes de DKE una células cultivadas en 40 placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros de diámetro para cada placa use 0,1 mililitros de virus que contiene sobrenadante diluido en un mililitro de DMEM completo sin FCS incubar las células a 37 grados Celsius durante tres a cuatro horas bajo una agitación leve. Después de tres a cuatro horas, agregue cinco mililitros de DMEM completo suplementado con 5%FCS e incube durante tres días.

Después de tres días, recoja las células infectadas de los 40 platos de 10 centímetros en tubos de polipropileno de 50 mililitros, celdas de pellets a 1, 200 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Resus los suspende en 15 mililitros de medio DMEM y disrumpe las células mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Elimine los restos celulares centrifugando a 1.800 veces G durante 10 minutos.

Almacene el sobrenadante a menos 20 antes de la purificación de partículas virales para la purificación de partículas virales. Prepare un gradiente discontinuo de cloruro de cesio en un tubo UltraClear de 14 mililitros. Primero, vierta dos mililitros de la solución de cloruro de cesio de mayor densidad en el fondo del tubo.

Luego agregue lentamente dos mililitros de la solución de cloruro de cesio de menor densidad encima de la primera solución. Cargue cuidadosamente el sobrenadante viral sobre el gradiente de cloruro de cesio. Llene el tubo con aceite mineral hasta dos o tres milímetros de la centrífuga superior en un rotor SW 40 oscilante durante una hora y 30 minutos a 130.000 veces g y 18 grados Celsius después de la centrifugación.

Dos bandas blancas son claramente visibles en la interfaz entre las dos capas de solución de cloruro de cesio. Con una aguja de calibre 21 y una jeringa, recoja por punción lateral la banda inferior que contiene dos partículas maduras. Intente, en la medida de lo posible, evitar recoger la banda superior que corresponde a las partículas virales vacías.

Prepare un gradiente continuo de cloruro de cesio en un tubo transparente de 14 mililitros mezclando las partículas virales colectivas con una solución de cloruro de cesio. Llene el tubo con aceite mineral hasta dos o tres milímetros de la centrífuga superior en un rotor SW 40 oscilante durante 18 horas a 130.000 veces G y 18 grados. Después de la centrifugación, recoja la pantorrilla blanca que contiene dos bandas por punción lateral con una jeringa como se demostró anteriormente.

Nuevamente, trate de evitar recoger la banda superior restante. Esto debería ser más fácil en este gradiente continuo que separa mejor las dos bandas. El volumen total de la suspensión recolectada no debe exceder los dos mililitros.

A continuación, equilibre una columna cidex G 25 PD 10 con 30 mililitros de PBS. Cargue la suspensión viral en la columna y deseche el flujo a través de eluido con fracciones de 500 microlitros de PBS, recoja las fracciones cinco a siete, que generalmente contienen las dos partículas desalinizadas. El virus que contiene fracciones se puede identificar fácilmente porque hay un olor bendecido.

Por último, agregue 150 microlitros de glicerol a los 1,5 mililitros de suspensión CAV dos y almacene en Eloqua a menos 80 grados centígrados para valorar cav two por dilución de punto final, descongele una alícuota de virus purificado en hielo y realice una dilución en serie diez veces mayor que vaya de 10 a menos dos a 10 a menos 12 en DMEM libre de suero. Agregue 50 microlitros de cada dilución viral en cinco pocillos de una placa de 96 pocillos, agregue 1,5 veces 10 al cuarto DKE, una celda a cada pocillo, incube la placa a 37 grados Celsius y 5% de CO2 durante cinco días al quinto día. Monitor post-infección Aspecto de CPE por observación microscópica.

Los títulos infecciosos se determinan como dosis infecciosas medianas de cultivo de tejidos utilizando el método estadístico de lectura y hombres antes de la producción de vectores virales. Un genoma CAV dos recombinante que lleva un casete de expresión para el transgén se construye utilizando técnicas estándar de biología molecular. En primer lugar, el gen de interés se clona en un plásmido lanzadera como un casete de expresión con un promotor temprano de citomegalovirus y una señal de poliadenilación flanqueada por dos secuencias genómicas derivadas de CAV que representan las secuencias diana de recombinación aguas arriba y aguas abajo.

En un segundo paso, el casete de expresión se inserta desde el plásmido lanzadera en el genoma CAV dos por recombinación homóloga. La inserción del casete de expresión GOI conducirá a la deleción del EA y parte del gen E one B en el genoma recombinante. Una vez que se ha obtenido el plásmido genómico recombinante, las partículas virales se producen utilizando células CAV dos E, una que complementa a las células DKE one.

Un claro efecto citopático debido a la gran cantidad de partículas virales producidas en las células infectadas puede visualizarse fácilmente mediante microscopía de campo claro o por expresión de transgenes. Este ejemplo es de A GFP que expresa el vector CAV dos. Después de varias rondas de amplificación viral utilizando células DKE one frescas, las partículas virales se purifican por ultracentrifugación en gradientes de cloruro de cesio.

Las partículas virales concentradas aparecen como dos bandas opalescentes dentro del gradiente de cesio. La banda inferior corresponde a la cav recombinante madura dos que se debe recolectar. Mientras que la banda superior contiene partículas vacías no infecciosas que deben evitarse.

El vector recombinante dos resultante se puede utilizar para transducir casi todos los tipos de células en una amplia variedad de especies, ya sea in vitro o in vivo. Aquí se muestra un ejemplo de aplicación en el que la GFP que expresa CAV dos fue inyectada por taxii estéreo en diferentes áreas del sistema nervioso central del ratón. Dado que este protocolo produce un alto título y existencias virales puras y puras, la inyección de tan solo un microlitro de GFP diluido en PBS que expresa el vector CAV dos en el giro dentado o DG conduce a una transducción neuronal del 40 al 50%.

Además, debido a la capacidad de C dos de ser transportado retrógradamente en los axones, la inyección de dos microlitros de GFP diluido PBS que expresa el vector CAV dos en el cuerpo estriado permite la transducción de casi el 80% de las neuronas AAL nigro stri en los subs, nigra pars compacta después de sus desarrollos. Estas técnicas allanan el camino para que los investigadores en los campos de la vacunología o las neurociencias exploren nuevos antígenos y la función génica en el cerebro en muchos modelos animales diversos. Por lo tanto, no olvide que trabajar con dos vectores derivados de CAF puede ser extremadamente peligroso y precavido, por lo que siempre se deben tomar medidas adecuadas de contención y manejo de residuos, incluidos equipos de protección personal y trabajo en campanas de flujo laminar en dos laboratorios BSL mientras se realiza este procedimiento.