Name: Producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Aprende a producir y purificar vectores derivados del adenovirus canino tipo 2 (CAV2) para terapia génica y vacunación. Este protocolo detalla la construcción, amplificación y purificación de partículas virales de alto título.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado financieramente por subvenciones del INSERM, el CNRS, la Fondation pour la Recherche Médicale y la Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) a D.G-D; el Séptimo Programa Marco de la Comisión Europea para B.K.; M.S. fue apoyado por una beca postdoctoral del FRM (programa "Equipe FRM 2009"); C.B. contó con el apoyo de una beca postdoctoral de la UE, bajo el acuerdo de subvención número 245266 (Orbivac).

1. Construcción de un plásmido de genoma CAV2 no replicativo
Nota: todos los plásmidos descritos en este protocolo han sido descritos anteriormente7 y están disponibles bajo petición.
<ol>
	<li>Clonar el GOI en el plásmido pShuttle, utilizando las enzimas de restricción adecuadas, para generar pShuttle-GOI (Figura 1A).</li>
	<li>Resumen 2 μg de pShuttle-GOI de AscI/PacI. La digestión libera el fragmento Shuttle-GOI (~2,9 kbp + secuencia GOI ORF) de la columna vertebral del plásmido (2,8 kbp).</li>
	<li>Purifique el fragmento de Shuttle-GOI después de la electroforesis en gel de agarosa, utilizando el gel NucleoSpin y el kit de limpieza PCR.</li>
	<li>En paralelo, digiera 1 μg de plásmido genómico pCAV2 por SwaI. El plásmido pCAV2 contiene un sitio SwaI único ubicado dentro de la región E1 (Figura 1B). Inactivar por calor esta enzima de restricción a 65 °C durante 20 min.</li>
	<li>Transforme la bacteria competente E. coli BJ5183 con 500 ng de fragmento Shuttle-GOI purificado y 100 ng de plásmido pCAV2 linealizado para recombinación homóloga (Figure 1B). Extienda en placas LB-Amp. Incubar las placas a 37 °C durante al menos 20 horas.</li>
	<li>Realizar análisis de PCR directamente en colonias bacterianas utilizando la mezcla maestra EmeraldAmp con cebadores directos (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') e inversos (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'), en las siguientes condiciones de ciclo: 10 min a 95 °C (para un ciclo), 95 °C para 1 min; 58 °C para 1 min; 72 °C para 1 min/kbp (para 39 ciclos), y finalmente 5 min a 72 °C. Un producto de 1 kbp + secuencia GOI ORF se amplifica a partir de clones positivos para pCAV-GOI, mientras que ningún producto de PCR puede detectarse con clones negativos.</li>
	<li>Inocular al menos dos colonias positivas durante la noche cada una en un medio LB-amp de 5 ml a 37 °C en un agitador (220 rpm).</li>
	<li>Extraiga el ADN de los plásmidos utilizando el kit de plásmidos Nucleospin. Transforme la bacteria E. coli DH5α competente con una alícuota de cada preparación de ADN. Extienda la suspensión bacteriana en placas LB-Amp e incube durante la noche a 37 °C.</li>
	<li>Inocular dos colonias de cada clon positivo durante la noche en 3 ml de medio LB-amp a 37 °C en un agitador (220 rpm). Extraiga el ADN plasmídico utilizando el kit de plásmidos Nucleospina.</li>
	<li>Digiera el ADN resultante y el plásmido parental pCAV2 (como control) con NdeI. El patrón de restricción de pCAV2 primario es de 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp y 1,6 kbp. El casete de expresión del GOI se inserta dentro del fragmento de 7,9 kbp y contiene al menos un emplazamiento NdeI, es decir, uno en el casete y los emplazamientos potenciales presentes en el GOI.</li>
	<li>Seleccione las construcciones positivas y continúe con el paso 2 con al menos 2 clones independientes.</li>
</ol>
2. Transfección de plásmido del genoma CAV2 recombinante en células DK-E1
Nota: Los vectores no replicativos derivados de CAV2 son organismos genéticamente modificados clasificados como Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2), mientras que su uso en modelos animales se clasifica como BSL-1. Utilice las medidas adecuadas de contención y manejo de desechos, incluido el equipo de protección personal, y trabaje bajo campanas de flujo laminar BSL-2.
<ol>
	<li>Un día antes de la transfección, siembre las células DK-E1 en una placa de 6 pocillos. Cultive células a 37 °C y 5% de CO2, en el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de glucosa, que contiene 7% de suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor, 1 mM de piruvato de sodio y 100 U/ml de penicilina/100 μg/ml de estreptomicina. Las células deben tener un 70-80% de confluentes para la transfección.</li>
	<li>Digiera 2 μg de plásmido pCAV-GOI con AscI, para liberar la secuencia no viral del plásmido. Compruebe el patrón de restricción resultante mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. La digestión debe producir un fragmento de ~31 kbp que contenga el genoma recombinante y un fragmento de 2 kbp correspondiente a la columna vertebral del plásmido.</li>
	<li>Mezcle el ADN digerido con 200 μl de tampón Jet Prime mediante vórtice durante 10 segundos. Agregue 4 μl de Jet Prime y mezcle mediante vórtice durante 10 segundos. Gire brevemente para eliminar las gotas e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregue la mezcla de transfección gota a gota sobre las celdas. Agite suavemente los platos para distribuir uniformemente la mezcla e incubar a 37 °C.</li>
</ol>
3. Propagación de CAV2 recombinante
<ol>
	<li>Una semana después de la transfección, recoja las células y el medio de cultivo en un tubo de polipropileno de 15 ml. Interrumpa las células en tres ciclos de congelación-descongelación (-80 °C/37 °C) y limpie el lisado mediante centrifugación durante 10 min a 1.800 x g.</li>
	<li>Recoja el sobrenadante y guárdelo a -20 °C para su posterior propagación del virus.</li>
	<li>Infectar una monocapa confluente del 80-90% de células DK-E1 cultivadas en un pocillo de placa de 6 pocillos con 0,5 ml del sobrenadante que contiene el virus. Incubar a 37 °C durante 1 hora, bajo una agitación suave. Retire el inóculo y sustitúyalo por 1,5 ml de DMEM completo que contenga un 5% de FCS inactivado por calor.</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C durante 3-4 días. Las células deben ser monitoreadas diariamente para detectar la aparición de un efecto citopático (CPE, Figuras 2A-B). Si no se ve un CPE claro, recoja las células después de 4 días de cultivo y repita los pasos 3.1-3.4.</li>
	<li>Cuando un CPE claro afecta a la mayoría de las células, generalmente después de 2-4 rondas de amplificación viral, recoja las células con medio de cultivo y congele-descongele 3 veces como se describe anteriormente. Infectar el 80-90% de las células DK-E1 confluentes cultivadas en tres placas de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro, utilizando cada vez 0,5 ml de sobrenadante que contiene virus.</li>
	<li>Después de 3-4 días (cuando se complete el CPE), recoja las células de estas placas de 10 cm, vuelva a interrumpirlas mediante tres ciclos de congelación y descongelación, limpie el lisado por centrifugación durante 10 minutos a 1.800 x g, recoja el sobrenadante y almacene a -20 °C para la amplificación de CAV2 a gran escala.</li>
</ol>
4. Purificación CAV2 a gran escala
<ol>
	<li>Infecta el 80-90% de las monocapas confluentes de células DK-E1 cultivadas en cuarenta placas de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro. Para cada plato, utilice 0,1 ml de sobrenadante que contenga virus diluido en 1 ml de DMEM completo sin FCS. Incubar las células a 37 °C durante 3 a 4 horas bajo una agitación suave. Añadir 5 ml de DMEM completo suplementado con FCS al 5%.</li>
	<li>Incubar durante 3 días. Recoja las células infectadas de los cuarenta platos de 10 cm en tubos de polipropileno de 50 ml. Pellet cells a 1.200 x g durante 10 min a 4 °C y resuspenderlos en 15 ml de medio DMEM.</li>
	<li>Interrumpe las células en tres ciclos de congelación-descongelación (-80 °C/37 °C). Eliminar los restos celulares centrifugando a 1.800 x g durante 10 min y almacenar el sobrenadante a -20 °C antes de la purificación de las partículas virales.</li>
	<li>Prepare un gradiente discontinuo de CsCl en un tubo Ultra-Clear de 14 ml. En primer lugar, vierta 2 ml de solución de CsCl (1,40 g/ml en solución salina tamponada con fosfato) en el fondo del tubo. A continuación, añadir lentamente 2 ml de solución de CsCl (1,25 g/ml en solución salina tamponada con fosfato) encima de la primera solución.</li>
	<li>Cargue con cuidado el sobrenadante viral sobre el gradiente de CsCl. Llene el tubo con aceite mineral hasta 2-3 mm de la parte superior. Centrífuga durante 1,5 horas a 130.000 x g y 18 °C en un rotor SW40 oscilante.</li>
	<li>Después de la centrifugación, dos bandas blancas son claramente visibles en la interfaz entre las 2 capas de solución de CsCl (Figura 2C). Con una aguja de 21 G y una jeringa, recoja mediante punción lateral la banda inferior que contiene partículas CAV2 maduras. Trate en la medida de lo posible de evitar recoger la banda superior, que corresponde a las partículas virales vacías.</li>
	<li>Prepare un gradiente continuo de CsCl en un tubo transparente de 14 ml mezclando las partículas virales recogidas con una solución de CsCl (1,34 g/ml en solución salina tamponada con fosfato). Llene el tubo con aceite mineral hasta 2-3 mm de la parte superior. Centrífuga durante 18 horas a 130.000 x g y 18 °C en un rotor SW40 oscilante.</li>
	<li>Después de la centrifugación, recoja la banda blanca que contiene CAV2 mediante una punción lateral con una jeringa como se describe anteriormente. Nuevamente, trate de evitar recoger la banda superior restante. Esto debería ser más fácil en este gradiente continuo, que separa mejor las dos bandas. El volumen total de la suspensión recogida no debe superar los 2 ml.</li>
	<li>Equilibrar una columna Sephadex G-25 PD-10 con 30 ml de PBS.</li>
	<li>Cargue la suspensión viral y deseche el flujo continuo.</li>
	<li>Eluido con fracciones de 500 μl de PBS. Recoja las fracciones 5-7, que generalmente contienen las partículas CAV2 desaladoras. Las fracciones que contienen el virus se pueden identificar fácilmente porque son opalescentes. Añadir 150 μl de glicerol a los 1,5 ml de suspensión de CAV2 y almacenar en alícuotas a -80 °C.</li>
</ol>
5. Valoración de CAV2 por dilución de punto final
<ol>
	<li>Descongele una alícuota de virus purificado en hielo y realice diluciones en serie de 10 veces (que van desde 10-2-10-12) en DMEM sin suero.</li>
	<li>Agregue 50 μl de cada dilución viral en 5 pocillos de una placa de 96 pocillos. Agregue 1.5 x 104 celdas DK-E1 en cada pocillo. Incubar la placa a 37 °C y 5% deCO2 durante 5 días.</li>
	<li>En el día 5 después de la infección, controle la apariencia de CPE mediante observación microscópica (Figuras 2A-B). Los títulos infecciosos se determinan como dosis infecciosas medias de cultivo de tejidos (TCID50), utilizando el método estadístico de Reed y Muench13.</li>
</ol>

<ol><li>Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+chimeras+for+gene+therapy%2C+vaccination%2C+and+oncolysis%3A+adenoviruses+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond.</a> Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).</li>
<li>Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).</li>
<li>Zak, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merck+Ad5%2FHIV+induces+broad+innate+immune+activation+that+predicts+CD8%28%2B%29+T-cell+responses+but+is+attenuated+by+preexisting+Ad5+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).</li>
<li>Paillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+non-human+adenoviruses+versus+human+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses.</a> Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).</li>
<li>Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+dissemination+in+the+mouse+nervous+system%2C+using+a+green+fluorescent+protein-expressing+Borna+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector.</a> J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).</li>
<li>Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+canine+adenovirus+type+2+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An update on canine adenovirus type 2 and its vectors.</a> Viruses. 2, 2134-2153 (2010).</li>
<li>Bouet-Cararo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenoviruses+elicit+both+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+against+rabies+following+immunisation+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep.</a> Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).</li>
<li>Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+transduction+of+neurons+throughout+the+rat+CNS+using+novel+helper-dependent+CAV-2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors.</a> FASEB J. 18, 391-393 (2004).</li>
<li>Deinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52, 293-305 (2006).</li>
<li>Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+neurons+by+canine+adenovirus+vectors+and+their+efficient+retrograde+transport+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo.</a> FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).</li>
<li>Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotropism+and+retrograde+axonal+transport+of+a+canine+adenoviral+vector%3A+a+tool+for+targeting+key+structures+undergoing+neurodegenerative+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes.</a> Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).</li>
<li>Chartier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli.</a> J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatography+purification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatography purification of canine adenoviral vectors.</a> Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).</li>
<li>Segura, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors.</a> Journal of virological. 163, 129-136 (2010).</li>
<li>Fernandes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+development+for+canine+adenovirus+type+2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors.</a> Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).</li>
<li>Huang, B., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+silencing+of+huntingtin+expression+by+shRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA.</a> Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).</li>
<li>Tordo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenovirus+based+rabies+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Canine adenovirus based rabies vaccines.</a> Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método simple descrito en este documento, adaptado de la tecnología Ad5 bien documentada, permite la producción eficiente de vectores CAV2 no replicativos con una capacidad de clonación típica de ~ 4.2 kbp. En cuanto a las consideraciones de tiempo, un genoma CAV2 recombinante generalmente se genera en dos semanas, mientras que tomará 5 semanas adicionales amplificar, purificar y valorar las suspensiones virales.
Aunque la producción del primer lote de vectores derivados de CAV2 puede parec...

En las últimas décadas, los vectores derivados de adenovirus (Ads) han demostrado su eficacia para la terapia génica y la vacunación, así como en la viroterapia oncolítica 1. Los ADS son virus icosaédricos sin envoltura de la familia Adenoviridae, que se han aislado de mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Desde su descubrimiento en 1953, los Ads se han estudiado intensamente como modelos para estudiar las interacciones virus/célula y, más recientemente, como sistemas de entrega de genes basados en vectores 2. De hecho, los vectores basados en anuncios ofrecen muchas ventajas, como su amplia gama de huéspedes y su biología bien caracterizada, junto con la facilidad con la que pueden manipularse y amplificarse genéticamente para la producción a gran escala.
Con el fin de superar las dificultades clínicas relacionadas con la inmunidad preexistente en las poblaciones humanas hacia los vectores derivados de los Ads 3 humanos, nosotros y otros comenzamos a derivar vectores de los Ads 4 no humanos. Además, los vectores adenovirales no humanos parecen estar más adaptados para la vacunación masiva en medicina veterinaria que el adenovirus tipo 5 (Ad5) de uso clásico, ya que deberían cumplir mejor los requisitos de seguridad y protección durante la evaluación de riesgos por parte de las autoridades reguladoras nacionales. A finales de la década de 1990, describimos el primer CAV2 recombinante como una alternativa no humana a los vectores derivados de Ad5 5. Desde entonces, numerosos estudios han confirmado el potencial de los vectores CAV2 para la transferencia de genes terapéuticos o antigénicos (para revisiones 6,7). Al igual que otros Ads, los vectores derivados de CAV2 son estables y se pueden producir a títulos altos, lo que facilita su uso in vivo. También son seguros, ya que no son integrativos, aunque permiten la expresión transgénica de larga duración in vivo (>1 año) 8. Sorprendentemente, y mejor que los serotipos Ads humanos, se ha demostrado que los vectores CAV2 son altamente neurotrópicos, con un transporte retrógrado muy eficiente en los axones 9,10. Esta propiedad intrínseca trajo la idea de utilizar vectores CAV2 recombinantes para transducir neuronas de áreas específicas del cerebro que son difícilmente accesibles para los vectores lentivirales, hasta ahora comúnmente utilizados para la transferencia de genes al sistema nervioso central 11.
Aquí, describimos un protocolo simple y clásico para construir, producir y purificar vectores CAV2 no replicativos derivados de la cepa de Manhattan. Los genomas recombinantes de CAV2 se construyen clonando el gen de interés deseado (GOI) en un casete aguas abajo del promotor temprano del citomegalovirus (CMV), que proporciona una expresión ubicua. Los vectores CAV2 tienen una capacidad de clonación de ~4,2 kbp, lo que permite expresar ADNc de gran tamaño. En un segundo paso, este casete de expresión se inserta por recombinación homóloga en lugar de la región E1 del genoma CAV2, lo que conduce a un virus no replicativo (dlE1), como lo describieron inicialmente Chartier et al. 12 Finalmente, las partículas virales se producen tras la transfección del plásmido genómico en una línea celular de riñón canino que expresa CAV2-E1 (DK-E1) y se amplifican en serie antes de la concentración y purificación de las reservas virales. El método descrito aquí utiliza una ultracentrifugación de dos pasos en gradientes de cloruro de cesio (CsCl), lo que permite el enriquecimiento de partículas infecciosas con un título final alto (generalmente más de 10a 10 partículas infecciosas por ml). A continuación, la suspensión viral se desala por cromatografía a través de columnas desechables Sephadex G-25 para que, en última instancia, sea lo suficientemente pura como para ser utilizada directamente in vivo.

<table><tbody><tr><td>Enzimas de restricción</td><td>New England Biolabs</td><td>Varios</td><td></td></tr><tr><td>kit de transfección Jet Prime</td><td>Polyplus</td><td>114-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>E. coli bacterias BJ5183 Columna</td> de <td>desalinización Agilent</td><td>200154</td><td></td></tr><tr><td>PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>EmeraldAmp polimerasa</td><td>Takara</td><td>RR320A Kit de</td> plásmido de nucleospina <td></td></tr><tr><td></td><td>Macherey-Nagel</td><td>740558.250</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel y PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 14 ml, Ultra Clear</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td></td></tr></tbody></table>

producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Los vectores derivados de adenovirus (Ad) se han utilizado ampliamente para la transferencia de genes a corto o largo plazo, tanto para aplicaciones de terapia génica como de vacunas. Debido a la frecuente inmunidad preexistente contra el adenovirus humano tipo 5 utilizado clásicamente, el adenovirus canino tipo 2 (CAV2) se ha propuesto como un vector alternativo para la transferencia de genes humanos. La biología bien caracterizada de CAV2, junto con su facilidad de manipulación genética, ofrece importantes ventajas, especialmente para la transferencia de genes al sistema nervioso central o para inducir una amplia gama de respuestas inmunitarias protectoras, desde la inmunidad humoral hasta la celular. Hoy en día, CAV2 representa uno de los adenovirus no humanos más atractivos para su uso como vector vacunal. Este protocolo describe un método simple para construir, producir y titular vectores CAV2 recombinantes. Después de clonar el casete de expresión del gen de interés en un plásmido lanzadera, el plásmido genómico recombinante se obtiene por recombinación homóloga en la cepa bacteriana E. coli BJ5183. A continuación, el plásmido genómico resultante se transfecta en células de riñón canino que expresan los genes CAV2-E1 complementarios (DK-E1). Una amplificación viral permite la producción de un gran stock viral, que se purifica por ultracentrifugación a través de gradientes de cloruro de cesio y se desala por diálisis. La suspensión viral resultante tiene habitualmente un título de más de 1010 partículas infecciosas por ml y puede administrarse directamente in vivo.

La producción de vectores recombinantes de CAV2 depende de técnicas básicas pero importantes de biología molecular. Antes de producir los vectores virales, es necesario construir un genoma recombinante de CAV2 que contenga un casete de expresión para el transgén. Esta construcción implica dos pasos: primero, el gen de interés (GOI) se clona en un plásmido vehículo como un casete de expresión (es decir, con promotor y señal de poliadenilación). Este elemento funcional está flanqueado por dos secuencias genómicas ...

En los últimos 15 años, los vectores derivados del adenovirus canino tipo 2 (CAV2) han demostrado su eficacia para transducir células in vitro e in vivo y son ampliamente utilizados para la vacunación y la terapia génica. En este trabajo describimos un procedimiento para construir, producir y purificar vectores CAV2, dando lugar a suspensiones virales de alto título.

Producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

El objetivo general de este procedimiento es construir, producir y purificar vectores derivados del adenovirus canino tipo dos. Esto se logra clonando primero el gen de interés en un plásmido lanzadera. El segundo paso es obtener un plásmido genómico recombinante por recombinación homóloga.A continuación, el ternero defectuoso recombinante, dos virus producidos y amplificados en una línea celular complementaria trans. El paso final es purificar y concentrar el virus recombinante resultante para diversas aplicaciones in vivo e in vitro. En última instancia, la microscopía confocal de inmunofluorescencia se utiliza para mostrar ejemplos de transducción viral en el cerebro de roedores.La principal ventaja de estas técnicas sobre los métodos existentes, como los vectores derivados de la neurosis humana ad, es que no existe inmunidad preexistente contra la ternera dos en las poblaciones humanas. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la vacunación o la terapia génica, como la evaluación del papel de las proteínas expresadas en áreas específicas del cerebro. Por lo tanto, la demostración de este procedimiento será May KY y Corin Bergeron.Dos investigadores postdoctorales de nuestros laboratorios se preparan para este procedimiento un día antes de la transfección sembrando células DKE one en una placa de seis pocillos para cultivar células a 37 grados Celsius y 5% de CO2 en DMEM con alto contenido de glucosa que contiene 7% de calor, ternero fetal inactivado, sodio sérico, piruvato, penicilina y estreptomicina. Al día siguiente, las células deben ser del 70 al 80% confluentes para la transfección digerir dos microgramos de pcal GOI el plásmido recombinante cav dos plásmido genómico con ASC uno para liberar la secuencia no viral del plásmido, verifique el patrón de restricción resultante en un 0.8% La digestión por electroforesis en gel agro debe producir un fragmento de par de aproximadamente 31 kilobases que contiene el genoma recombinante y un fragmento de par de dos kilobases correspondiente a la columna vertebral del plásmido. Mezcle el ADN digerido con 200 microlitros de tampón jet prime y vórtice durante 10 segundos.Agregue cuatro microlitros de jet prime y mezcle en vórtice durante 10 segundos. Gire brevemente para eliminar las gotas e incube durante 10 minutos. A temperatura ambiente, agregue la mezcla de transfección gota a gota sobre las celdas DKE one.Agite suavemente el plato para distribuir uniformemente la mezcla e incubar a 37 grados centígrados. Una semana después de la transfección, recoja las células y el medio de cultivo en un tubo de polipropileno de 15 mililitros. Interrumpe las células mediante tres ciclos de pensamiento de congelación.Limpie el lisado por centrifugación durante 10 minutos a 1, 800 veces G. Recoja el sobrenadante y guárdelo a menos 20 para la posterior propagación del virus para propagar el virus infectar una monocapa confluente de 80 a 90% de células DKE una cultivadas en un pocillo de una placa de seis pocillos con 0,5 mililitros del virus que contiene sobrenadante. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora bajo agitación leve Después de una hora. Retire el inóculo y reemplácelo con 1,5 mililitros de DMEM completo que contenga 5%Células de incubación de FCS inactivadas por calor a 37 grados centígrados durante tres o cuatro días.Las células deben ser monitoreadas diariamente para detectar la aparición de un efecto citopático o CPE. Si no se ve un CPE claro. Recolectar células después de cuatro días de cultivo y repetir la amplificación viral cuando un CPE claro afecta a la mayoría de las células.Por lo general, después de dos a cuatro rondas de amplificación viral, recoja las células con medio de cultivo y congele y descongele tres veces, como se demostró anteriormente. Infectan entre el 80 y el 90% de los confluentes. DKE una célula cultivada en tres placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros de diámetro utilizando 1,5 mililitros de virus que contienen sobrenadante por placa después de tres o cuatro días cuando se completa el CPE.Las células de recolección de estos platos de 10 centímetros de diámetro las interrumpen en tres ciclos de estilo libre y limpian el lisado por centrifugación durante 10 minutos a 1.800 veces. G recoja el sobrenadante y almacene a menos 20 para la amplificación a gran escala Cav dos para comenzar el procedimiento de escalado infecte el 80 al 90% de las monocapas confluentes de DKE una células cultivadas en 40 placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros de diámetro para cada placa use 0,1 mililitros de virus que contiene sobrenadante diluido en un mililitro de DMEM completo sin FCS incubar las células a 37 grados Celsius durante tres a cuatro horas bajo una agitación leve. Después de tres a cuatro horas, agregue cinco mililitros de DMEM completo suplementado con 5%FCS e incube durante tres días.Después de tres días, recoja las células infectadas de los 40 platos de 10 centímetros en tubos de polipropileno de 50 mililitros, celdas de pellets a 1, 200 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Resus los suspende en 15 mililitros de medio DMEM y disrumpe las células mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Elimine los restos celulares centrifugando a 1.800 veces G durante 10 minutos.Almacene el sobrenadante a menos 20 antes de la purificación de partículas virales para la purificación de partículas virales. Prepare un gradiente discontinuo de cloruro de cesio en un tubo UltraClear de 14 mililitros. Primero, vierta dos mililitros de la solución de cloruro de cesio de mayor densidad en el fondo del tubo.Luego agregue lentamente dos mililitros de la solución de cloruro de cesio de menor densidad encima de la primera solución. Cargue cuidadosamente el sobrenadante viral sobre el gradiente de cloruro de cesio. Llene el tubo con aceite mineral hasta dos o tres milímetros de la centrífuga superior en un rotor SW 40 oscilante durante una hora y 30 minutos a 130.000 veces g y 18 grados Celsius después de la centrifugación.Dos bandas blancas son claramente visibles en la interfaz entre las dos capas de solución de cloruro de cesio. Con una aguja de calibre 21 y una jeringa, recoja por punción lateral la banda inferior que contiene dos partículas maduras. Intente, en la medida de lo posible, evitar recoger la banda superior que corresponde a las partículas virales vacías.Prepare un gradiente continuo de cloruro de cesio en un tubo transparente de 14 mililitros mezclando las partículas virales colectivas con una solución de cloruro de cesio. Llene el tubo con aceite mineral hasta dos o tres milímetros de la centrífuga superior en un rotor SW 40 oscilante durante 18 horas a 130.000 veces G y 18 grados. Después de la centrifugación, recoja la pantorrilla blanca que contiene dos bandas por punción lateral con una jeringa como se demostró anteriormente.Nuevamente, trate de evitar recoger la banda superior restante. Esto debería ser más fácil en este gradiente continuo que separa mejor las dos bandas. El volumen total de la suspensión recolectada no debe exceder los dos mililitros.A continuación, equilibre una columna cidex G 25 PD 10 con 30 mililitros de PBS. Cargue la suspensión viral en la columna y deseche el flujo a través de eluido con fracciones de 500 microlitros de PBS, recoja las fracciones cinco a siete, que generalmente contienen las dos partículas desalinizadas. El virus que contiene fracciones se puede identificar fácilmente porque hay un olor bendecido.Por último, agregue 150 microlitros de glicerol a los 1,5 mililitros de suspensión CAV dos y almacene en Eloqua a menos 80 grados centígrados para valorar cav two por dilución de punto final, descongele una alícuota de virus purificado en hielo y realice una dilución en serie diez veces mayor que vaya de 10 a menos dos a 10 a menos 12 en DMEM libre de suero. Agregue 50 microlitros de cada dilución viral en cinco pocillos de una placa de 96 pocillos, agregue 1,5 veces 10 al cuarto DKE, una celda a cada pocillo, incube la placa a 37 grados Celsius y 5% de CO2 durante cinco días al quinto día. Monitor post-infección Aspecto de CPE por observación microscópica.Los títulos infecciosos se determinan como dosis infecciosas medianas de cultivo de tejidos utilizando el método estadístico de lectura y hombres antes de la producción de vectores virales. Un genoma CAV dos recombinante que lleva un casete de expresión para el transgén se construye utilizando técnicas estándar de biología molecular. En primer lugar, el gen de interés se clona en un plásmido lanzadera como un casete de expresión con un promotor temprano de citomegalovirus y una señal de poliadenilación flanqueada por dos secuencias genómicas derivadas de CAV que representan las secuencias diana de recombinación aguas arriba y aguas abajo.En un segundo paso, el casete de expresión se inserta desde el plásmido lanzadera en el genoma CAV dos por recombinación homóloga. La inserción del casete de expresión GOI conducirá a la deleción del EA y parte del gen E one B en el genoma recombinante. Una vez que se ha obtenido el plásmido genómico recombinante, las partículas virales se producen utilizando células CAV dos E, una que complementa a las células DKE one.Un claro efecto citopático debido a la gran cantidad de partículas virales producidas en las células infectadas puede visualizarse fácilmente mediante microscopía de campo claro o por expresión de transgenes. Este ejemplo es de A GFP que expresa el vector CAV dos. Después de varias rondas de amplificación viral utilizando células DKE one frescas, las partículas virales se purifican por ultracentrifugación en gradientes de cloruro de cesio.Las partículas virales concentradas aparecen como dos bandas opalescentes dentro del gradiente de cesio. La banda inferior corresponde a la cav recombinante madura dos que se debe recolectar. Mientras que la banda superior contiene partículas vacías no infecciosas que deben evitarse.El vector recombinante dos resultante se puede utilizar para transducir casi todos los tipos de células en una amplia variedad de especies, ya sea in vitro o in vivo. Aquí se muestra un ejemplo de aplicación en el que la GFP que expresa CAV dos fue inyectada por taxii estéreo en diferentes áreas del sistema nervioso central del ratón. Dado que este protocolo produce un alto título y existencias virales puras y puras, la inyección de tan solo un microlitro de GFP diluido en PBS que expresa el vector CAV dos en el giro dentado o DG conduce a una transducción neuronal del 40 al 50%.Además, debido a la capacidad de C dos de ser transportado retrógradamente en los axones, la inyección de dos microlitros de GFP diluido PBS que expresa el vector CAV dos en el cuerpo estriado permite la transducción de casi el 80% de las neuronas AAL nigro stri en los subs, nigra pars compacta después de sus desarrollos. Estas técnicas allanan el camino para que los investigadores en los campos de la vacunología o las neurociencias exploren nuevos antígenos y la función génica en el cerebro en muchos modelos animales diversos. Por lo tanto, no olvide que trabajar con dos vectores derivados de CAF puede ser extremadamente peligroso y precavido, por lo que siempre se deben tomar medidas adecuadas de contención y manejo de residuos, incluidos equipos de protección personal y trabajo en campanas de flujo laminar en dos laboratorios BSL mientras se realiza este procedimiento.

production-purification-non-replicative-canine-adenovirus-type-2

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Recombinante virus adeno-asociado (rAAVs) vectores son cada vez más valioso...

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

Aquí se describe un protocolo basado solamente en la infección de células, lo que mejora la eficiencia de la producción recombinante de parvovirus por más de 100 veces en comparación con otros protocolos en uso. Este protocolo se basa en el uso de un nuevo adenovirus 5-basado auxiliar que contiene el VP parvovirus unidad de transcripción (Ad-VP).

Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Se presenta un protocolo para la generación de vectores adenovirales de alta capacidad que carecen de todas las secuencias codificantes virales. La clonación de los transgenes contenidos en el genoma del vector se basa en endonucleasas homing. La amplificación del virus en células productoras cultivadas como células adherentes y en suspensión se basa en un virus auxiliar que proporciona genes virales en trans.

La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de adenovirus utilizando el sistema pAdEasy. La tecnología incluye la recombinación de los plásmidos pAdTrack y pAdEasy-1, el empaquetado y la amplificación del adenovirus, la purificación de las partículas adenovirales del lisato celular y el medio de cultivo, la titulación viral y las pruebas funcionales del adenovirus.

Un método eficiente para la producción de adenovirus

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.

Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

En este protocolo, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de insectos Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-proteína fluorescente verde (GFP) o gen terapéutico y células Sf9 infectadas con BV-AAV2-rep-cap en cultivo en suspensión. Las partículas de AAV se liberan de las células utilizando detergente, se clarifican, se purifican mediante cromatografía de columna de afinidad y se concentran mediante filtración de flujo tangencial.

Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción, purificación y cuantificación del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título. Este protocolo produce consistentemente &gt; 6 × 109 unidades formadoras de placa/ml, proporcionando cantidades de virus apropiadas para estudios in vivo en animales. Se describen ensayos de control de calidad adicionales para garantizar la seguridad in vivo .

Producción de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico

Aquí, se presenta un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que resulta en una reducción del tiempo y la mano de obra necesarios para la producción de vectores utilizando componentes que están disponibles para fines de investigación de proveedores comerciales.

Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

Aprende a producir y purificar vectores derivados del adenovirus canino tipo 2 (CAV2) para terapia génica y vacunación. Este protocolo detalla la construcción, amplificación y purificación de partículas virales de alto título.

Producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados

Explorar más videos