El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

El objetivo general del siguiente experimento es analizar la flexibilidad confirmacional en las proteínas y los cambios de las mismas en respuesta al entorno, la unión al ligando o las interacciones proteína-proteína. Esto se logra mediante la preincubación de la proteína de interés en diferentes condiciones que se sospecha que influyen en la confirmación de la proteína, como la unión al ligando. A continuación, la mezcla de reacción se diluye en óxido de deuterio, se incuba durante diferentes intervalos de tiempo y, posteriormente, se analiza mediante cromatografía líquida por espectrometría de masas para determinar el grado de incorporación de deutero en la columna vertebral del péptido.

Los grupos amida, debido a que las áreas protegidas tienen una disminución de la incorporación de deuteros, la comparación de los espectros peptídicos del experimento en ausencia y presencia de un compañero de unión revela un cambio del OID de los espectros debido a la diferencia de peso entre el protón y el deuterón. Las regiones que exhiben una protección prominente después de la adición de un asociado de unión son posibles sitios de unión. Dependiendo de la cobertura de la secuencia y la disponibilidad de péptidos superpuestos, los sitios de unión se pueden reducir a unos pocos aminoácidos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del plegamiento de proteínas y la dinámica de proteínas, como cómo se pliegan las proteínas, cómo se despliegan, cómo reaccionan a los impactos físicos y químicos como el aumento de la temperatura o los metales pesados. Cómo la unión semejada y las interacciones proteína-proteína pueden influir en la confirmación de una proteína. También es muy importante para el desarrollo de medicamentos proteicos para la verificación del plegamiento adecuado y para el control de calidad general.

En general, las personas nuevas en este método pueden encontrar varias dificultades. Si la proteína, por ejemplo, no es bien digerida por la pepsina, la cobertura de la secuencia será baja. Si la proteína es muy propensa a la agregación, puede agregarse durante la incubación o después de agregar el tampón de enfriamiento y dará como resultado intensidades de señal bajas en el espectrómetro de masas.

En esta demostración, investigaremos la unión de la chaperona molecular de levadura, HP 90 a su chaperona cos Sty one utilizando espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno STY one se une a HP 90 y facilita la unión al cliente mediante la inhibición de la actividad de ABAs de HB ninety. Comience este procedimiento con la preparación de tampones, muestras y perlas como se detalla en el protocolo de texto. Para preparar las columnas para el intercambio de hidrógeno amida, desenrosque un lado de la columna de protección y retire el filtro herméticamente.

Atornille el embudo de empaquetadura en el extremo abierto de la columna. Use un adaptador de 16 pulgadas para conectar una jeringa vacía de cinco mililitros a la salida inferior de la columna. Asegúrese de fijarlo herméticamente al gas a la columna de protección.

Aplique unas gotas de material de cordón de lechada en la parte superior del embudo. Tire del émbolo de la jeringa para aspirar la lechada a través del embudo hacia la columna de protección. Aplique más material de cordón de lechada en el embudo y continúe el procedimiento hasta que la columna de protección esté completamente llena de material de cordón.

Luego retire el embudo antes de colocar firmemente el filtro y el anillo del filtro en el extremo abierto. Enrosque la tapa de la columna en la columna protectora y retire la jeringa del otro lado. Cierre ambos extremos de las columnas de protección con tacos.

Para evitar que se seque el material de la columna para configurar el sistema de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno. En primer lugar, conecte la columna de trampa al sistema de cromatografía líquida de alta resolución o HPLC. Equilibre la columna ajustando el caudal de la bomba A a 0,4 mililitros por minuto con ácido fórmico al 0,1% como disolvente.

Después de calibrar el espectrómetro de masas, conecte la salida del HPLC a la fuente del espectrómetro de masas. Para determinar primero los péptidos pépticos, conecte la columna de Pepin y luego la columna analítica al sistema. Configure los parámetros para cromatografía y espectrometría de masas en el software de control eligiendo el tipo de gradiente y el método de espectrometría de masas.

Elija un degradado largo para garantizar una buena resolución cromatográfica. Habilite los espectros de masas en tándem en el espectrómetro de masas. Prepare de 100 a 200 pomo de proteína de choque térmico 90 o HSP 90 en 100 microlitros de tampón H dos L.

Agregue 100 microlitros de tampón de enfriamiento y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Inyecte la muestra de 200 microlitros en el puerto de inyección de la válvula de inyección con una jeringa Hamilton. Coloque la válvula de inyección en la posición de inyección e inicie el programa de cromatografía.

A continuación, identifique los péptidos pépticos de la proteína de choque térmico 90 mediante la búsqueda de los péptidos resultantes en una base de datos. Disminuya la temperatura del sistema a cero grados centígrados agregando agua helada. Repita este paso sin espectrometría de masas en tándem y con el gradiente que se utilizará para el experimento de intercambio de hidrógeno real.

Para la proteína de choque térmico 90 y STI uno, use un gradiente de 10 minutos desde 90% de solvente, un 10% de solvente B hasta 45% de solvente, A 55% de solvente B, determine los tiempos de retención de los péptidos pépticos identificados en el gradiente utilizado y cree una lista que comprenda la secuencia peptídica, la carga peptídica, el estado y el tiempo de retención. Esto se utilizará para identificar cada péptido después de los experimentos de intercambio de hidrógeno. Para identificar las interfaces de interacción proteína-proteína, primero configure el método de espectrometría de masas y gradiente.

En el software de control, utilice un gradiente lineal de 10 minutos desde el 90 % de disolvente, un 10 % de disolvente B hasta el 45 % de disolvente. Un 55% de solvente B carga un método de espectrometría de masas que está optimizado para la detección entre 300 y 1.500 relaciones de masa a carga, aunque la mayoría de los péptidos estarán por debajo de la relación de 1000 masa a carga. Coloque la válvula de inyección en la posición de carga y la válvula de seis puertos.

En la posición de desalinización de carga, ajuste el caudal de la bomba de carga a 0,4 mililitros por minuto. Después de ejecutar la referencia sin cambios y la muestra de control del 100% como se describe en el protocolo de texto, prepare de 20 a 100 picos moles de proteína de choque térmico 90 en un volumen de uno a cinco microlitros. Agregue tampón de óxido de deuterio ajustado a la temperatura para llevar el volumen de la muestra hasta 100 microlitros de incubación durante el período de tiempo exacto que se definió anteriormente como se describe en el protocolo de texto.

Al determinar el rango dinámico de intercambio, agregue 100 microlitros de hielo frío, enfríe el tampón y pipetee hacia arriba y hacia abajo dos veces e inyecte rápidamente los 200 microlitros en la válvula de inyección de la HPLC. Coloque la válvula de inyección en la posición de inyección e inicie inmediatamente el programa de cromatografía. Después de dos minutos, cambie la válvula de seis puertos de la posición de carga de desalinización a la posición de elución.

Haga esto para cada proteína individualmente para determinar la incorporación de deuterón en cada péptido en ausencia de la proteína que interactúa para determinar la superficie de interacción mezcle la proteína de choque térmico 90 con un exceso de al menos el doble de STI uno para cambiar el equilibrio al estado unido, incubado a la temperatura deseada hasta que la formación del complejo esté en equilibrio. Después de la incubación, agregue un tampón de óxido de deuterio ajustado a la temperatura para llevar el volumen de la muestra a 100 microlitros e incube durante exactamente un período de tiempo definido. A continuación, añada 100 microlitros de tampón de enfriamiento helado y pipetee dos veces hacia arriba y hacia abajo, inyecte rápidamente la proteína y ejecute como antes.

Analice los datos adquiridos con un software adecuado y utilice los tiempos de retención determinados para encontrar cada péptido en el análisis. Calcule el OID de la distribución de isótopos para la proteína inalterada y para los experimentos de intercambio de hidrógeno, compare la incorporación de deuteros de la proteína objetivo sola y con el exceso de socio de unión. Esto se puede hacer automáticamente con un software comercial o manualmente con el programa de hoja de cálculo M, la interacción directa de la proteína y la proteína entre HS P 90 y STI one se probó comparando los espectros de péptidos de STI one en ausencia y presencia de HS P 90 siguiendo el etiquetado con óxido de deuterio.

El gráfico de diferencias resultante revela que la mayoría de los péptidos en TPR dos A y TPR dos B muestran una fuerte protección en presencia de HS P 90, lo que indica que estas regiones interactúan con HS P 90. La protección en TPR dos A se puede racionalizar fácilmente a partir de la estructura cristalina de STY un TPR, dos A TPR dos B en complejo con un péptido HS P 90, que se colorea de acuerdo con el número de protones amiloides protegidos de la incorporación de DEUTERO. No siempre se observa una protección tan clara en las interacciones proteína-proteína.

La protección en HSP 90 en presencia de ITS uno no es tan pronunciada ni tan localizada como en ITS one. Todos los péptidos muestran una protección ligeramente mayor con la incorporación de deutero. Aquí se muestra una representación de dibujos animados de la levadura HS P 90 coloreada de acuerdo con el número de protones amli protegidos de la incorporación de deuterón, STY one estabiliza HS P 90 a nivel mundial ya que ninguna región de la proteína muestra más flexibilidad en su presencia.

No está claro si esta incorporación reducida de deuterón se origina por la interacción directa con el orzuelo o a través de efectos alostéricos. En la confirmación del marcaje continuo de HSP 90, se utilizó el intercambio de hidrógeno y la espectrometría de masas para estudiar la dinámica de diferentes regiones de proteínas. Aquí se muestran los espectros del péptido 43 a 62 del dominio de unión a nucleótidos de HSP 90.

En presencia y ausencia de STI one, los espectros peptídicos muestran una incorporación de deuterio dependiente del tiempo que aumenta con una incubación más larga. El grado de protección cambia a lo largo del tiempo de incubación, mostrando mayor diferencia en los tiempos de incubación más cortos y tasas de intercambio casi similares en el punto de tiempo más largo. Esto sugiere un menor grado de estabilización o una región de interacciones dinámicas con disociación y asociación frecuentes.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las condiciones meticulosamente constantes y tener todo listo antes de comenzar la reacción de intercambio. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos para responder a preguntas adicionales, como la ubicación de los sitios de interacción en los complejos de proteínas.