Name: FtsZ Polimerización Ensayos: Protocolos simples y Consideraciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprenda a estudiar la polimerización de FtsZ en bacterias mediante ensayos de sedimentación, dispersión de luz e hidrólisis de GTP. Estos protocolos simples permiten evaluar la actividad de esta proteína esencial para la división celular bacteriana.

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El trabajo en nuestro laboratorio está financiado por una beca VIDI de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (a DJS). 
Agradecemos a Marc Stuart y al Departamento de Microscopía Electrónica de nuestra universidad, por su ayuda y acceso al microscopio electrónico de transmisión.

<ol><li>Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division%3A+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).</li>
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<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).</li>
<li>Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+SepF+binds+to+the+C-terminus+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ.</a> PLoS One. 7 (8), e43293(2012).</li>
<li>Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SepF+increases+the+assembly+and+bundling+of+FtsZ+polymers+and+stabilizes+FtsZ+protofilaments+by+binding+along+its+length%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length.</a> J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).</li>
<li>Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+ring+polymers+align+FtsZ+polymers+for+normal+septum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation.</a> EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).</li>
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<li>Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+model+for+ionic+%28K%28%2B%29%2FNa%28%2B%29%29+and+pH+dependence+of+GTPase+activity+and+polymerization+of+FtsZ%2C+the+prokaryotic+ortholog+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin.</a> J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).</li>
<li>Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Escherichia+coli+cell+division+protein+FtsZ+by+a+low-affinity+interaction+with+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations.</a> FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).</li>
<li>Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+MinC+on+FtsZ+polymerization+is+pH+dependent+and+can+be+counteracted+by+ZapA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA.</a> FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+assembly+dynamics+and+subunit+turnover+of+FtsZ+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).</li>
<li>Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Caulobacter+crescentus+FtsZ+protein+using+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering.</a> J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+assembly+of+FtsZ+regulated+by+GTP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis.</a> EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).</li>
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<li>Rivas, G., Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium-induced+linear+self-association+of+the+FtsZ+bacterial+cell+division+protein+monomer.+The+primary+steps+for+FtsZ+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly.</a> J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+FtsZ+protofilament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into FtsZ protofilament formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Lowe, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li>
<li>Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+SOS+cell+division+inhibitor+SulA+and+in+complex+with+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).</li>
<li>Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).</li>
<li>White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+polymerization+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+conformational+variability+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the conformational variability of FtsZ.</a> J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Buske, P. J., Levin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+C+terminus+of+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ+plays+fundamental+role+in+assembly+independent+of+modulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins.</a> J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Describimos un conjunto de métodos que permiten un análisis rápido de la actividad de FtsZ y su interacción con otras proteínas. Los ensayos de dispersión de luz, sedimentación y GTPasa, así como la microscopía electrónica, se han utilizado ampliamente para estudiar la polimerización de FtsZ. Hemos realizado algunas mejoras en los protocolos existentes, mostramos la influencia de diferentes condiciones en el ensamblaje de FtsZ y proponemos controles que deben incluirse en los estudios de FtsZ.
Introducimos la centrifugación a baja velocidad para distinguir las grandes estructuras formadas por la asociación entre FtsZ y sus proteínas que interactúan de los polímeros FtsZ. Este método muestra dos ventajas sobre el ensayo de sedimentación estándar. En primer lugar, los polímeros FtsZ no forman fondo en la fracción de pellets, ya que no se centrifugan a 24.600 x g. En segundo lugar, la cantidad de FtsZ presente en la estructura formada con una proteína que interactúa se puede calcular a partir del gel. Dos pasos críticos en este método son el tiempo de incubación y la concentración de GTP. Es importante centrifugar la estructura de proteína grande cuando está completa, pero antes de que se desmonte cuando todo el GTP esté hidrolizado. El mejor control para este estudio es la polimerización de FtsZ con GDP. Existe una limitación potencial del ensayo. FtsZ forma un complejo estable con SepF, que se puede girar fácilmente a 24,600 x g. Si se realiza la sedimentación con otro activador o un fármaco que agrupa polímeros FtsZ, puede ser necesario adaptar el ensayo. Se puede hacer cambiando el tiempo de incubación o aumentando la velocidad de centrifugación.
La preparación adecuada de la muestra es lo más importante para los experimentos de dispersión de luz. Las proteínas deben eliminarse previamente mediante centrifugación y todos los tampones deben filtrarse antes de su uso. Si hay agregados presentes en la muestra, interrumpirán una señal estable obtenida de polímeros FtsZ. Para el análisis de las estructuras FtsZ mediante microscopía electrónica, el paso principal es la preparación de una cuadrícula. El tiempo de incubación de la muestra en la rejilla tendrá el efecto de producir polímeros más o menos compactados. Para los haces de FtsZB, el tiempo de incubación debe ser más corto que para FtsZEc y FtsZBs a alta concentración de KCl. Utilizamos una concentración de 12 μM para cada muestra para poder comparar los resultados. Sin embargo, para FtsZBs a 50 mM KCl se debe utilizar una concentración de FtsZ más baja, ya que 12 μM dieron lugar a una saturación completa de la cuadrícula. Esto hace que los polímeros estén muy compactados y sean difíciles de detectar. Los polímeros menos compactados son mejores para detectar en EM.
El ensayo de GTPasa es el único experimento utilizado para estudiar la actividad en lugar de las estructuras de FtsZ. El Mg2+ es necesario para el recambio de GTP en polímeros FtsZ. Por lo tanto, en ausencia de Mg2+, FtsZ no hidroliza GTP. Por lo tanto, una muestra sin Mg2+ es el control correcto en este ensayo, pero los cationes de Mg están presentes en el tampón de almacenamiento FtsZ. Pueden eliminarse mediante la adición de 1 mM de EDTA a la muestra de control. El paso crítico en este ensayo es el tiempo de incubación. Es importante detener la actividad de FtsZ después de un tiempo determinado. Esto se logra transfiriendo la muestra de FtsZ a una solución verde de malaquita en una placa de 96 pocillos. Sin embargo, el desarrollo del color verde malaquita es un proceso continuo. Por lo tanto, las mediciones deben tomarse al mismo tiempo para cada muestra. Utilizando un protocolo de adición de GTP bien planificado con mediciones tomadas cada 30 segundos de diferencia en un orden establecido, es posible obtener el mismo tiempo de incubación y manipulación de muestras para cada punto de tiempo. Otro paso crítico es elegir la concentración de la proteína para el experimento. En el experimento utilizamos dos concentraciones diferentes para FtsZEc y FtsZBs. La hidrólisis de GTP es mucho más rápida para FtsZEc en comparación con FtsZBs. La actividad de GTPasa de FtsZEc en las condiciones elegidas y a 12 μM es lineal solo durante un máximo de 5 min y después de ese tiempo la tasa de hidrólisis se estabiliza. Por lo tanto, es difícil interpretar los datos del experimento cuando se realiza en estas condiciones. En este caso, FtsZEc debe usarse a una concentración más baja que FtsZBs para poder comparar las actividades de ambas proteínas. La actividad de GTPasa de FtsZs de diferentes fuentes puede variar. Por lo tanto, se debe elegir la concentración correcta. La concentración para la polimerización de FtsZ debe estar muy por encima de la concentración crítica (en general de 2,5 a 10 μM). La dinámica del montaje y desmontaje de FtsZ también es importante. Algunas proteínas muestran un retraso significativo en la polimerización después de la adición de GTP, como se muestra para FtsZB a 50 mM KCl. Es útil realizar el ensayo de dispersión de luz antes del ensayo GTPasa para aproximar el tiempo de montaje y desmontaje de los polímeros FtsZ. Después de eso, se puede elegir el momento de incubación y la concentración de proteínas. Dado que las condiciones elegidas para la polimerización de FtsZ son cruciales, es importante utilizar el pH y la concentración de KCl correctos en cada método. En este trabajo estudiamos 9 tampones diferentes con pH que oscilan entre 6,5 y 7,5 y concentraciones de KCl de 0 M a 300 mM. Notamos que la mejor condición para analizar los FtsZs de B. subtilis y E. coli y su actividad biológica es a un pH cercano al nivel fisiológico (7.5) junto con una alta concentración de KCl. A una alta concentración de KCl, FtsZ tiene una mayor actividad de GTPasa y produce polímeros que son mejor detectables por microscopía electrónica. También confirmamos que el pH fisiológico y una alta concentración de KCl son mejores para el estudio de la interacción entre FtsZ y las proteínas reguladoras que cualquier otro tampón utilizado principalmente para estudiar el ensamblaje de FtsZ. FtsZBs muestra una actividad similar a FtsZEc cuando se estudia a alta concentración de KCl. Además, a baja concentración de sal, la influencia del pH es más visible que en los tampones con alta concentración de sal. FtsZ a veces precipita cuando se usan tampones sin KCl, como resultado, se deben evitar los tampones sin sal. La sedimentación de los polímeros FtsZ es baja cuando se utilizan tampones con altas concentraciones de KCl. Esto puede ser una ventaja cuando se estudian las interacciones entre FtsZ y las proteínas que ensamblan filamentos de FtsZ como SepF y ZapA, ya que estas estructuras de orden superior son fáciles de detectar con centrifugación. En todos nuestros experimentos usamos MgCl2 a una concentración de 10 mM. Se demostró que una concentración relativamente alta de Mg2+ estabiliza los polímeros FtsZ y reduce la actividad GTPasa de FtsZ. En la Tabla 2 se resumen los resultados de varios estudios que describen la polimerización de FtsZ y la actividad de GTPasa a diferentes concentraciones de Mg2+ utilizando condiciones tampón idénticas 27. La concentración medida de Mg2+ citoplasmático libre es de 0,9 mM3. Debe tenerse en cuenta que GTP quelará una cantidad equivalente de Mg2+. Por lo tanto, la concentración óptima de Mg2+ para los experimentos de GTPasa es de alrededor de 2-2,5 mM, que está cerca del nivel fisiológico3. Sin embargo, en nuestros experimentos utilizamos MgCl2 a una concentración de 10 mM para obtener una señal de dispersión de luz fácilmente detectable y estabilizar los polímeros FtsZ durante el ensayo de sedimentación.
Aunque aplicamos nuestros protocolos a FtsZ de los organismos modelo E. coli y B. subtilis, se pueden adaptar a FtsZ de cualquier otro organismo. Debe tenerse en cuenta que el pH fisiológico y las concentraciones de cationes monovalentes y divalentes difieren entre organismos. Por lo tanto, las condiciones óptimas para la polimerización de FtsZ pueden variar. Las diferencias en el tiempo de duplicación y las condiciones de crecimiento de diferentes bacterias pueden dar lugar a diferentes cinéticas de ensamblaje de FtsZ y condiciones óptimas de los experimentos. Sin embargo, nuestro protocolo proporciona un buen punto de partida para los experimentos con FtsZs de otros organismos. Los protocolos deberían ser útiles para el estudio de FtsZ con proteínas reguladoras o el estudio de los efectos de pequeños compuestos y fármacos sobre FtsZ.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fuente</td>
			<td>Polimerización [% de FtsZ sedimentado]</td>
			<td>GTPasa [Pi/FtsZ/min]</td>
			<td>Concentración de Mg2+ [mM]</td>
			<td>Concentración de FtsZ [μM]</td>
			<td>Referencias</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZEc</td>
			<td>~ 28%</td>
			<td>~ 2.1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>Este trabajo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 50%</td>
			<td>~ 2.4</td>
			<td>10</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 43%</td>
			<td>~ 3.5</td>
			<td>5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 27%</td>
			<td>~ 4.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ND</td>
			<td>~ 5.4</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZBs</td>
			<td>~ 30%</td>
			<td>~ 0,8</td>
			<td></td>
			<td>12</td>
			<td>Este trabajo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 52% (con DEAE dextrano)</td>
			<td>~ 0.5</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ND</td>
			<td>~ 2.25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2. Efecto sobre el Mg2+ sobre la polimerización de FtsZ y GTPasa. Resultados de este trabajo comparados con datos publicados. Todos los experimentos se llevaron a cabo en 50 mM MES/NaOH, pH=6,5, 50 mM KCl.

La proteína bacteriana esencial FtsZ es la proteína mejor caracterizada de la maquinaria de división celular bacteriana. FtsZ es el homólogo procariota de la tubulina y se polimeriza in vitro de forma dependiente de GTP. FtsZ es un objetivo muy atractivo para nuevos antibióticos debido a su naturaleza conservada y su singularidad frente a las bacterias1,2. Al comienzo de la división celular, FtsZ forma un anillo citocinético en la célula media, que sirve como andamio para el ensamblaje de otras proteínas de división celular. La formación del anillo Z es crucial para la correcta localización del plano de división. La dinámica de ensamblaje de FtsZ está regulada por varias proteínas accesorias, como (dependiendo de la especie bacteriana) MinC, SepF, ZapA, UgtP y EzrA2. La polimerización de FtsZ se ha estudiado intensamente in vitro y se han descrito muchas estructuras diferentes, incluidos protofilamentos rectos, protofilamentos curvos, láminas de filamentos, haces de filamentos y tubos de filamentos, en función del tampón de ensamblaje, el nucleótido y las proteínas adicionales incluidas en el ensayo3. La arquitectura de los protofilamentos FtsZ in vivo aún no se comprende completamente, aunque los experimentos de criotomografía electrónica en Caulobacter crescentus sugieren que el anillo Z se ensambla a partir de protofilamentos individuales relativamente cortos y no continuos sin un agrupamiento extenso4.
In vitro, las propiedades de polimerización de FtsZ y la interacción de FtsZ con proteínas reguladoras son sensibles a la composición del tampón de reacción. Por ejemplo, recientemente describimos el sitio de interacción para SepF en el extremo C de FtsZ y mostramos que un truncado de terminal C de FtsZBs∆16 ya no se une a SepF5. En un estudio previo sobre la interacción SepF-FtsZBs, un truncado similar de FtsZBs∆16 todavía cosedimentado con SepF, lo que sugiere que SepF se une a un sitio secundario en FtsZ6. La diferencia entre estos estudios fue la composición de los tampones de reacción: a pH 7.5 no hubo cosedimentación de SepF con el truncado de FtsZ, mientras que a pH 6.5 hubo cosedimentación. Gündoğdu et al. observó que el SepF no es funcional y precipita a pH 6.57, lo que muestra que la cosedimentación observada a pH 6.5 probablemente sea causada por la precipitación de SepF en lugar de la interacción con el truncado FtsZBs∆16 C-terminal. La influencia de la concentración de pH y KCl en la polimerización de FtsZ ha sido examinada previamente. Los polímeros de E. coli FtsZ (FtsZEc) a pH 6,5 son más largos y abundantes que los formados a pHneutro 8,9. Tadros y cols. han estudiado la polimerización de FtsZEc en presencia de cationes monovalentes, observando que la unión de K+ está vinculada a la polimerización de FtsZEc y es crucial para la actividad de FtsZ10. El pH es más crítico cuando se estudia la interacción de FtsZ con otras proteínas, como se muestra en el ejemplo anterior de SepF, y la dependencia del pH del efecto inhibidor de MinC sobre FtsZ11. Dado que tanto el pH como la concentración de sal pueden influir en la interacción de FtsZ con otras proteínas, es importante elegir las condiciones y los controles adecuados para los estudios de polimerización de FtsZ.
Aquí describimos protocolos para estudiar la polimerización de FtsZ y la actividad de GTPasa mediante dispersión de luz, microscopía electrónica, sedimentación y ensayos de GTPasa. La dispersión de luz en ángulo recto es un método estándar para estudiar la polimerización de FtsZ en tiempo real12. Introdujimos algunas mejoras en el ensayo de sedimentación y GTPasa. Presentamos en detalle cómo preparar muestras para dispersión de luz y microscopía electrónica. Se probaron varios tampones utilizados en la literatura para estudiar la polimerización de FtsZ y describimos las mejores condiciones para cada experimento. También mostramos qué controles se deben introducir para obtener los mejores datos.
Estos métodos permiten un estudio rápido de la polimerización, actividad e interacción de FtsZ con otras proteínas utilizando métodos y equipos simples que están disponibles en la mayoría de los laboratorios. Existen métodos más sofisticados para estudiar la polimerización de FtsZ, pero a menudo requieren acceso a equipos más especializados y/o la modificación de FtsZ con etiquetas fluorescentes8,13,14. Los métodos simples descritos en este artículo se ilustran utilizando FtsZ de B. subtilis y E. coli, los organismos modelo Gram+ y Gram- más comunes. Los protocolos se pueden adaptar a cualquier otra proteína FtsZ. Sobre la base de los ensayos preliminares con estos nuevos FtsZ, pueden ser necesarios ligeros cambios en el tiempo, el tampón o la temperatura de incubación para obtener un resultado óptimo. Los experimentos descritos aquí deberían ayudar a encontrar estas condiciones óptimas.

<table><tbody><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>10106399001</td><td>Parte 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7</td></tr><tr><td>Tubos de policarbonato de pared gruesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>Parte 2</td></tr><tr><td>Optima MAX-XP Ultracentrífuga Beckman</td><td>Coulter</td><td>393315</td><td>Parte 2, 3</td></tr><tr><td>Tubo de polialómero con tapa a presión</td><td>Beckman Coulter</td><td>357448</td><td>Parte 3</td></tr><tr><td>Paquete biológico AIDA, 1D, 2D, FL</td><td>Raytest Isotopenmessger&auml; te GmbH</td><td>15000001</td><td>Parte 4</td></tr><tr><td>Analizador de imágenes de luminiscencia LAS-4000</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Parte 4</td></tr><tr><td>Termo Espectrospectrónico AMINCO-Bowman Espectrómetro de luminiscencia</td><td>Spectronic Instruments</td><td></td><td>Parte 5</td></tr><tr><td>Célula de fluorescencia</td><td>Hellma Analytics</td><td>105-250-15-40</td><td>Parte 5</td></tr><tr><td>Malla cuadrada 400, cobre, 100/vial</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>G400-Cu</td><td>Parte 6</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico CM120 que funciona a 120 kV</td><td>Philips</td><td></td><td>Parte 6</td></tr><tr><td>Placa de 96 ml x 0,2 ml</td><td>BIOplastics</td><td>B70501</td><td>Parte 7</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de fosfato verde de malaquita</td><td>Sistema de bioensayo</td><td>POMG-25H</td><td>Parte 7</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de microplaca PowerWave HT</td><td>BioTek</td><td></td><td>Parte 7</td></tr></tbody></table>

ftsz polimerización ensayos: protocolos simples y consideraciones

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

Durante la división celular bacteriana, la proteína esencial FtsZ ensambla en el medio de la célula para formar el llamado anillo Z. FtsZ polimeriza en largos filamentos en presencia de GTP in vitro, y la polimerización se regula por varias proteínas accesorias. Polimerización de FtsZ ha sido ampliamente estudiado in vitro usando métodos básicos incluyendo dispersión de la luz, sedimentación, ensayos de hidrólisis de GTP y microscopía electrónica. Las condiciones del tampón influir tanto en las propiedades de polimerización de FtsZ, y la capacidad de FtsZ para interactuar con proteínas reguladoras. A continuación, describimos los protocolos para los estudios de polimerización de FtsZ y validar las condiciones y controles utilizando Escherichia coli y Bacillus subtilis FtsZ como proteínas modelo. Un ensayo de sedimentación baja velocidad se introduce que permite el estudio de la interacción de FtsZ con proteínas que agrupan o tubulate polímeros de FtsZ. Un protocolo de ensayo GTPasa mejorado se describe que permite realizar pruebasde la hidrólisis de GTP en el tiempo utilizando diferentes condiciones en una configuración de placa de 96 pocillos, con tiempos de incubación estandarizadas que suprimen la variación en el desarrollo de color en la reacción de detección de fosfato. La preparación de las muestras para los estudios de dispersión de luz y microscopía electrónica se describe. Varios buffers se usan para establecer pH adecuado y la concentración de sal para los estudios de polimerización de FtsZ. Una alta concentración de KCl es la mejor para la mayoría de los experimentos. Nuestros métodos proporcionan un punto de partida para la caracterización in vitro de FtsZ, no sólo a partir de E. coli y B. subtilis pero a partir de cualquier otra bacteria. Como tal, los métodos pueden ser utilizados para estudios de la interacción de FtsZ con proteínas reguladoras o las pruebas de fármacos antibacterianos que puedan afectar a la polimerización de FtsZ.

La purificación de FtsZ a partir de diferentes fuentes bacterianas ha sido descrita en la literatura y se resume en la Tabla 1.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fuente</td>
			<td>Método</td>
			<td>Modificación</td>
			<td>Rendimiento obtenido [mg/L de cultivo]&gt;</td>
			<td>Referencias</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis</td>
			<td>1) Precipitación con sulfato de amonio/cromatografía de intercambio iónico</td>
			<td>no</td>
			<td>40</td>
			<td>Este trabajo, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Cromatografía de afinidad</td>
			<td>His-etiqueta</td>
			<td>ND</td>
			<td>17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>1) Precipitación con sulfato de amonio/cromatografía de intercambio iónico</td>
			<td>no</td>
			<td>35</td>
			<td>Este trabajo, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Precipitación de calcio, cromatografía de intercambio iónico</td>
			<td>no</td>
			<td>40</td>
			<td>18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanococcus jannaschii</td>
			<td>1) Cromatografía de afinidad en condiciones desnaturalizantes/refoldado/precipitación con sulfato de amonio/cromatografía de filtración en gel</td>
			<td>His-tag</td>
			<td>1.3</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Cromatografía de afinidad / filtración en gel</td>
			<td>His-etiqueta</td>
			<td>ND</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima</td>
			<td>Cromatografía de intercambio iónico/filtración en gel</td>
			<td>no</td>
			<td>6.7</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>Cromatografía de afinidad/filtración en gel</td>
			<td>Etiqueta Strep, etiqueta His</td>
			<td>ND</td>
			<td>21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td>1) Cromatografía de afinidad/intercambio iónico</td>
			<td>no</td>
			<td>ND</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Cromatografía de afinidad / filtración en gel</td>
			<td>no</td>
			<td>30</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquifex aeolicus</td>
			<td>Cromatografía de afinidad/filtración en gel</td>
			<td>His-tag, truncamiento C-terminal (331-367)</td>
			<td>ND</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caulobacter crescentus</td>
			<td>Cromatografía de intercambio iónico/precipitación con sulfato de amonio/cromatografía de filtración en gel</td>
			<td>no</td>
			<td>ND</td>
			<td>25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. Protocolos de purificación de FtsZ descritos. ND: no determinado.
Sedimentación de polímeros de FtsZ
Inicialmente, utilizamos dos velocidades diferentes para sedimentar los polímeros de FtsZ. Descubrimos que solo a una velocidad de 350.000 × g se sedimentan polímeros individuales de FtsZEc (Figura 1), mientras que a 190.000 × g solo están presentes haces de FtsZBs en la fracción del sedimento (datos no mostrados). Por lo tanto, se utilizó 350.000 × g en nuestros experimentos posteriores. El porcentaje de FtsZEc y FtsZBs polimerizado es similar a 50 mM de KCl, aunque los experimentos de dispersión de luz revelaron una señal de dispersión mucho mayor para FtsZBs. Esto se debe a los haces formados por FtsZBs, que dispersan más luz que los polímeros individuales de FtsZEc. No fue posible obtener una cantidad elevada de polímeros de FtsZ en la fracción del sedimento en el experimento con 300 mM de KCl, tanto para FtsZEc como para FtsZBs (Figura 1). Atribuimos esto a una combinación de desensamblaje rápido de las estructuras de FtsZ y una disminución en el agrupamiento de los filamentos.
Sedimentación de tubos de FtsZ-SepF
Para analizar la interacción de FtsZ con ciertos activadores, se pueden realizar ensayos de sedimentación a velocidades más bajas de centrifugación. A esta velocidad, solo se pueden sedimentar estructuras grandes de FtsZ, por ejemplo, los grandes túbulos formados por anillos de SepF y filamentos de FtsZBs5, o los agregados formados por FtsZ y ZapA. Utilizamos una centrifugación más baja (24.600 x g) para demostrar la viabilidad de este enfoque para los túbulos formados por FtsZ y SepF. FtsZ se recuperó en el sedimento por encima de los niveles de fondo solo cuando tanto SepF como GTP estaban presentes en la muestra (Figura 2), y la presencia de SepF no influye en la actividad GTPasa de FtsZ7, lo que indica que FtsZ está completamente activo en presencia de SepF. La sedimentación específica de SepF y FtsZ es aproximadamente del 45 % del SepF total y del 15 % del FtsZ total (en comparación con el material que sedimenta cuando se añade GDP). Esto indica que los túbulos de SepF-FtsZ contienen más SepF que FtsZ. Esto podría deberse a que muchos anillos de SepF organizan los túbulos de FtsZ-SepF5,7. La estequiometría exacta de SepF-FtsZ en estos túbulos no se conoce, pero nuestros resultados sugieren que hay más SepF presente que FtsZ.
Propiedades de polimerización y agrupamiento de FtsZEc y FtsZBs
Para caracterizar la eficiencia de polimerización de FtsZBs y FtsZEc en diferentes tampones, analizamos ambas proteínas mediante dispersión de luz a 90°. A 50 mM de KCl, FtsZBs produce una señal de dispersión de luz 20-40 veces mayor que FtsZEc, dependiendo del pH del tampón (Figuras 3A y 3B), lo que confirma los resultados de Buske et al.26. Aumentar la concentración de KCl en el tampón no influyó significativamente en la señal de dispersión de luz de FtsZEc (Figura 3D), pero la señal de FtsZBs disminuyó aproximadamente 80 veces a pH 7,5, unas 30 veces a pH 6,8 y unas 45 veces a pH 6,5 en 300 mM de KCl (Figura 3C) en comparación con tampones que contenían 50 mM de KCl (Figura 3A). La desensamblaje de los polímeros de FtsZ es más rápido a mayor concentración de KCl para ambas proteínas (Figuras 3C y 3D). Los estudios de Pacheco-Gómez et al. muestran que la polimerización y agrupación de FtsZ de E. coli depende del pH. Estos autores encontraron que en un tampón con 50 mM de KCl, la señal de dispersión de luz de la polimerización de FtsZ fue mayor y la desensamblaje de FtsZ tardó más tiempo a pH 6,0 en comparación con pH 7,0 8. Estos resultados no concuerdan con nuestros datos sobre la polimerización de FtsZEc a 50 mM de KCl (Figura 3B), pero debe tenerse en cuenta que nosotros utilizamos tres tampones diferentes (HEPES, MES y PIPES), mientras que Pacheco-Gómez et al. solo usaron MES. Por lo tanto, no solo el pH, sino también la composición del tampón (fuerza iónica) afecta la cinética de los polímeros de FtsZ a 50 mM de KCl. Sin embargo, a 300 mM de KCl, ni la composición del tampón ni el pH influyeron de forma detectable en el ensamblaje de FtsZEc.
Un experimento de dispersión de luz de FtsZBs en tampones sin KCl no fue posible debido a la precipitación de la proteína bajo estas condiciones. Cuando la concentración de FtsZBs se redujo a 3 µM, no ocurrió precipitación. Sin embargo, 3 µM no es la concentración fisiológica de FtsZ en la célula. En cubetas de plástico, FtsZBs no precipitó a 12 µM a pH 7,5, pero a pH 6,8 y 6,5 FtsZ aún precipitó en ausencia de KCl.
Morfologías de las estructuras de FtsZ de E. coli y B. subtilis
Las estructuras formadas por FtsZ se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). FtsZBs se ensambló en polímeros estrechamente compactados que cubrieron toda la cuadrícula en todos los tampones con baja salinidad (Figuras 4A-C). FtsZEc formó filamentos largos, cables y haces en todos los tampones con baja salinidad (Figuras 4D-F). Sin embargo, la cantidad observable de polímeros formados por FtsZEc fue menor que la cantidad formada por FtsZBs. En tampones con alta salinidad, FtsZBs formó protofilamentos monocatenarios más largos que no se asociaron en haces (Figuras 4G-I). Mientras que los protofilamentos de FtsZBs cambiaron de estructura a mayor concentración de sal, FtsZEc formó estructuras indistinguibles de las observadas en tampón de baja salinidad (Figuras 4J-L). No se observó influencia del pH en la polimerización de FtsZEc, pero FtsZBs forma más haces a pH 6,5, visibles como polímeros estrechamente compactados y láminas (Figura 4B). Estos resultados concuerdan con nuestros experimentos de dispersión de luz y con trabajos previos publicados de TEM8,11,26.
La actividad GTPasa de FtsZ a concentraciones altas y bajas de KCl
La actividad de hidrólisis de GTP de FtsZ se midió bajo diferentes condiciones utilizando un ensayo colorimétrico para fosfato libre. Como se informó previamente15, la actividad GTPasa de FtsZ aumentó con la concentración creciente de KCl: dependiendo del tampón utilizado, FtsZBs mostró un incremento de 3 a 7 veces, y FtsZEc mostró un incremento de 1,5 a 2,5 veces en la actividad GTPasa a 300 mM de KCl en comparación con 50 mM de KCl. La actividad GTPasa reducida a 50 mM de KCl se debe al agrupamiento de los filamentos de FtsZBs. A 50 mM de KCl, FtsZEc presentó una actividad GTPasa 3 a 6 veces mayor que FtsZBs, debido a la desensamblaje más rápido de los polímeros de FtsZEc. La diferencia en la actividad de hidrólisis de GTP entre FtsZBs y FtsZEc se redujo a 300 mM de KCl, posiblemente debido a la disminución del agrupamiento de los filamentos de FtsZBs (Figura 5).
<img alt="Polimerización de FtsZ, análisis del porcentaje de precipitado, gráfico de barras, electroforesis en gel, comparación del efecto de GTP/GDP." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Cuantificación de la polimerización de FtsZ mediante sedimentación. (A) Se polimerizó 12 µM de FtsZ en presencia de 2 mM de GTP o GDP a pH 7.5 (barras negras), 6.8 (barras grises) o 6.5 (barras blancas). La cantidad de proteína sedimentada se determinó mediante análisis densitométrico de geles teñidos con Coomassie. Se utilizó GDP como control para una sedimentación específica y se restó el porcentaje de FtsZ sedimentado con GDP del porcentaje de FtsZ sedimentado con GTP para obtener los valores representados en el gráfico. A la izquierda: FtsZ sedimentado a 50 mM de KCl; a la derecha: FtsZ sedimentado a 300 mM de KCl. (B) Resultados representativos de geles teñidos con Coomassie. Polimerización de FtsZBs (gel superior) y FtsZEc (gel inferior) a 50 mM de KCl. (S) fracciones del sobrenadante, (P) fracciones del precipitado procedentes del experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño</a>.
<img alt="Gráfico de interacción entre FtsZ y SepF y gel que muestra la influencia de GTP/GDP en el porcentaje de proteína sedimentada." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Sedimentación de túbulos de SepF/FtsZ a baja velocidad. (A) Se polimerizó 12 µM de FtsZBs con 2 mM de GDP (barras blancas) o GTP (barras negras). La cantidad de proteína sedimentada se determinó mediante análisis densitométrico de geles teñidos con Coomassie. Los signos + y - bajo el eje x indican la presencia o ausencia de FtsZ y SepF en la reacción. (B) Resultados representativos de un gel teñido con Coomassie. Polimerización de FtsZBs en presencia y ausencia de SepF. Como control, se utilizó SepF sin FtsZ. La polimerización se realizó con GTP y GDP. (S) fracción sobrenadante, (P) fracción del sedimento procedente del experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño</a>.
<img alt="Gráficos de dispersión de luz de FtsZ con concentraciones de KCl; mostrando los efectos de pH 6,5, 6,8 y 7,5." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Dispersión de luz de FtsZEc al 12 μM y FtsZBs al 12 μM. Se ensamblaron FtsZs en presencia de 2 mM de GTP y se monitoreó la polimerización mediante dispersión de luz a 90°. Polimerización de FtsZBs (A) y FtsZEc (B) con 50 mM de KCl a pH 7,5, pH 6,8 y pH 6,5. Polimerización de FtsZBs (C) y FtsZEc (D) con 300 mM de KCl a pH 7,5, pH 6,8 y pH 6,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño</a>.
<img alt="Microscopía electrónica de polímeros de FtsZ en diferentes concentraciones de pH y KCl; análisis estructural." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Estructuras de polímeros de FtsZBs y FtsZEc visualizadas mediante microscopía electrónica. (A-L) Imágenes de FtsZBs a 12 µM (A-C e G-I) y FtsZEc (D-F) y (J-L) polimerizados con 2 mM GTP. (A-C) FtsZBs en tampón con 50 mM KCl y pH 7.5, 6.8 y 6.5 respectivamente. (D-F) FtsZEc en tampón con 50 mM KCl y pH 7.5, 6.8 y 6.5 respectivamente. (G-I) FtsZBs en tampón con 300 mM KCl y pH 7.5, 6.8 y 6.5 respectivamente. (J-L) FtsZEc en tampón con 300 mM KCl y pH 7.5, 6.8 y 6.5 respectivamente. Barra de escala: 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño</a>.
<img alt="Gráfico de actividad de GTPasa; gráfico de barras de FtsZ a 50 mM frente a 300 mM de KCl, variaciones de pH 7,5, 6,8, 6,5." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Hidrólisis de GTP durante la polimerización de FtsZ en 6 tampones diferentes. En todos los experimentos se utilizó 2 mM de GTP. Como muestra control se usó una muestra sin MgCl2. La actividad de FtsZ sin MgCl2 se restó de la actividad de FtsZ en presencia de MgCl2. A la izquierda: actividad de GTPasa de FtsZ a 50 mM de KCl; a la derecha: actividad de GTPasa de FtsZ a 300 mM de KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño</a>.

La polimerización de FtsZ es esencial para la división celular bacteriana. En este informe, detallamos protocolos simples para monitorear la actividad de polimerización de FtsZ y discutimos la influencia de la composición del tampón. Los protocolos se pueden utilizar para estudiar la interacción de FtsZ con proteínas reguladoras o fármacos antibacterianos que afectan a la polimerización de FtsZ.

FtsZ Polimerización Ensayos: Protocolos simples y Consideraciones

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar las condiciones adecuadas para estudiar la FTSZ, la polimerización y la actividad utilizando ensayos y equipos simples. Esto se logra mediante la realización de ensayos de sedimentación de polímeros FDSC en diversas condiciones para encontrar condiciones adecuadas en las que FDSZ polimeriza. Como segundo paso, realizamos ensayos de dispersión de luz para estudiar la polimerización FDSZ en tiempo real.A continuación, realizamos ensayos de hidrólisis GTP para determinar la actividad g gtpa asociada a la polimerización de FT SC. Se obtienen resultados que muestran qué condiciones son las más adecuadas para el estudio de FTSC de una fuente bacteriana específica basada en sedimentación, dispersión de luz e hidrólisis GTP. Las técnicas que se muestran aquí son fáciles de realizar en cualquier laboratorio y proporcionarán una idea rápida de las capacidades de polimerización de FT a z específicos. Descubrimos que la elección del tampón adecuado es especialmente importante cuando se trabaja con FTAZ en presencia de otras proteínas que demuestran que la técnica será EVA crawl, un estudiante graduado de mi laboratorio.Para comenzar, agregue cinco microlitros de cloruro de magnesio de 100 milimolares y 12 micromolares de las proteínas bacterianas, FDSC y/o SEP F en uno de los tampones de polimerización elegidos que tengan varios valores de pH y composiciones como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, coloque los tubos en una incubadora con función de agitación e incube las muestras durante dos minutos a 30 grados centígrados y 300 RPM. Una vez que los tubos se hayan mezclado completamente, comience la polimerización agregando un microlitro de mezcla de GTP o GDP de una solución madre de 100 milimolares para que la concentración final sea de dos milimolares.A continuación, vuelva a colocar las muestras en la incubadora agitadora durante 20 minutos más. A continuación, gire los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos a 20.000 rpm utilizando un rotor TLA 55 o un 24.600 G equivalente si se utiliza otra cosa. Una vez finalizada la centrífuga, transfiera los sobrenadantes a tubos limpios y guarde los pellets para más tarde.Tome 20 microlitros de los sobrenadantes transferidos y mézclelos en un tubo separado con 20 microlitros de tampón de muestra dos veces concentrado. Asegure las tapas y hierva las muestras durante 10 minutos a 98 grados centígrados. A continuación, agregue 50 microlitros de tampón de muestra dos veces concentrado a cada fracción de pellet que se reservó previamente y suspenda los polímeros hirviendo las muestras durante 10 minutos a 98 grados centígrados.Una vez que las muestras hayan terminado de hervir, agregue 50 microlitros adicionales de agua desmineralizada a los tubos que contienen los pellets. A continuación, cargue 10 microlitros de los sobrenadantes y gránulos de cada muestra uno al lado del otro en un gel de página 10%SDS y haga funcionar el gel a 150 voltios. Una vez que el gel esté completo, retira el gel y tíñelo con kumasi azul brillante G two 50.A continuación, obtenga una imagen del gel y cuantifique la proteína mediante citometría, tal y como se describe en el protocolo de texto adjunto. Primero encienda un espectrómetro fluorescente y deje que la lámpara se caliente durante varios minutos para evitar fluctuaciones térmicas. Además, encienda un baño de agua circulante y ajuste la temperatura del agua a 30 grados centígrados para mantener la cámara de vete a una temperatura constante.A medida que el sistema se calienta, defina los parámetros de funcionamiento del espectrómetro. Ajuste el detector de alto voltaje a 300 voltios y las longitudes de onda de emisión y excitación a 350 nanómetros con un ancho de rendija de cuatro nanómetros. A continuación, programe el protocolo de adquisición de datos eligiendo una adquisición basada en el tiempo con una duración de 3.600 segundos.Limpie cuidadosamente una veta de fluorescencia de 200 microlitros con una longitud de paso de un centímetro fornicándola en una solución de limpieza en un baño de agua durante cinco minutos. A continuación, prepare 294 microlitros de una mezcla maestra para cada uno de los nueve tampones de polimerización descritos en el protocolo de texto adjunto, cada uno con 10 milimolares de cloruro de magnesio y 12 micromolares de FDSE como concentraciones finales calculadas para 300 microlitros. Luego, en un vórtice breve, las mezclas transfieren 196 microlitros del primer tampón de polimerización al veterinario.Colóquelo en el espectrómetro e incube durante dos minutos para que la temperatura de la muestra alcance los 30 grados centígrados. Después de dos minutos, inicie la adquisición de datos y espere 90 segundos para verificar que la señal es estable. A continuación, añade cuatro microlitros de 100 milimolares GTP o GDP.Mezcle la muestra y continúe la adquisición de datos durante una hora completa. Repita estos pasos para cada búfer de la lista. Prepare 1,5 mililitros de dos milimolares GTP en un tampón de polimerización elegido.Prepare también una dilución estándar de fosfato en el rango de cero a 40 micromolares en el mismo tampón. A continuación, prepare el reactivo de trabajo verde de malaquita como se describe en el kit de bioensayos. A continuación, forme cuatro mezclas maestras con un volumen total de 360 microlitros cada una: la mezcla maestra contiene FDSZ, derivada de B, subtilis, y la mezcla maestra, dos, contiene FDSE, derivada de E. coli.Las mezclas maestras tres y cuatro se utilizan como controles y contienen EDTA en lugar de cloruro de magnesio. A continuación, pipetea 20 alícuotas de microlitros de las mezclas maestras y patrones de fosfato. En la placa A-Q-P-C-R 96 pocillos, de modo que hay 16 pocillos para cada mezcla maestra y los estándares de fosfato dispuestos como se muestra aquí.Pipetear 180 microlitros de dos milimolares de culata GTP hasta el último carril de la placa. A continuación, coloque la placa en una máquina de PCR. Ejecute un programa con un solo ciclo configurado a 30 grados centígrados durante 40 minutos.En una segunda pipeta de placa de 96 pocillos, 20 alícuotas de microlitros del reactivo de trabajo verde de malaquita en pocillos, A uno a H 10. Luego, a los 60 microlitros del tampón de polimerización del experimento, las reclamaciones A uno a H ocho, a continuación, a 20 microlitros de la solución GTP de dos milimolares a los pocillos en cada carril de la placa. Uno en los intervalos predeterminados, como se muestra aquí, para examinar la reacción en varios puntos de tiempo.Coloque las mezclas hacia arriba y hacia abajo para mezclarlas después de 30 minutos, comenzando con el carril uno en la placa uno, transfiera 20 microlitros del carril uno de la placa uno al carril uno de la placa dos y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Este es el punto de partida del desarrollo del color verde malaquita para la reacción de 30 minutos, después de 30 minutos y medio, transfiera 20 microlitros del carril dos de la placa uno al carril dos de la placa dos y mezcle. Este es el punto de partida del desarrollo del color verde malaquita para la reacción de 20 minutos.Repita estos pasos con los carriles restantes del tres al siete a intervalos 32 después de 33 minutos y medio a 20 microlitros de GTP hasta el carril ocho en la placa uno y mezcle. Luego transfiera 20 microlitros al carril ocho en el segundo plato y mezcle. Esto representa la reacción de minuto cero y es el punto de tiempo de inicio para el desarrollo del color verde malaquita.Después de 34 minutos, agregue 80 microlitros del carril nueve de la placa uno que contiene el estándar de fosfato al carril nueve de la placa dos y mezcle después de 34 minutos y medio, transfiera 80 microlitros del segundo patrón de fosfato en el carril 10 de la primera placa al carril 10 en la placa dos y mezcle. A continuación, retire todas las burbujas de aire de las muestras e incube la placa a temperatura ambiente durante otros 25 minutos y medio. Después de la incubación.Coloque la placa en un lector de placas de 96 pocillos a partir de los 60 minutos desde el inicio del experimento. Mida la placa a 630 nanómetros cada 30 segundos durante cinco minutos para que se tomen 10 puntos de tiempo. La primera medición de la placa corresponderá con el carril uno, la segunda con el carril dos, y así cada carril ha tenido exactamente el mismo tiempo para que se desarrolle el color verde malaquita.A continuación, calcule el fosfato libre en cada muestra utilizando la curva de calibración del estándar de fosfato y trace los datos como liberación de fosfato a lo largo del tiempo. A continuación, calcule la actividad de hidrólisis F-D-S-Z-G-T-P a partir del rango lineal de la curva. Aquí se muestra el porcentaje de SEP F y FDSZ en los gránulos de las muestras.FDSZ se recuperó en el perdigón por encima de los niveles de fondo solo cuando tanto SEP F como GTP también estaban presentes en la muestra. Se desconoce la estequiometría exacta de SEPPE y FDSZ en estos túbulos, pero estos resultados sugieren que hay más seppe presente que FDSZ. Aquí se muestra la dispersión de la luz de FDSZ de B subtilis y E. coli, ensamblada en presencia de dos GTP milimolares en el tampón de cloruro de potasio de 50 milimolares.F-D-S-E-B-S proporciona una señal de dispersión de luz de 20 a 40 veces mayor que FDSC EC dependiendo del pH del tampón. Curiosamente, el aumento de la concentración de cloruro de potasio en el tampón no influyó significativamente en la señal de dispersión de luz de F-D-S-Z-E-C, pero la señal de F-T-S-Z-B-S disminuyó aproximadamente 80 veces a pH 7.5, 30 veces a pH 6.8 y 45 veces a pH 6.5 en cloruro de potasio de 300 milimolares en comparación con los tampones con cloruro de potasio de 50 milimolares. La actividad de hidrólisis de GTP de FDSZ se midió en diferentes condiciones de tampón utilizando un ensayo colorimétrico para fosfato libre.Se encontró que la actividad GTPS de FT SZ aumenta con el aumento de la concentración de cloruro de potasio en cada una de las diferentes condiciones de pH. A 50 milimolares de cloruro de potasio, la actividad de gtpa se redujo debido a la agrupación de filamentos F-D-S-Z-B-S a 50 milimolares. El cloruro de potasio FDSZ EEC tuvo una actividad GTPS de tres a seis veces mayor que F-D-S-Z-B-S debido al desmontaje más rápido de los polímeros FDSC EEC.Finalmente, la diferencia en la actividad de hidrólisis de GTP entre F-D-S-Z-B-S y F-D-S-Z-E-C se redujo a 300 milimolares de cloruro de potasio, posiblemente debido a la reducción del agrupamiento de filamentos F-D-S-Z-B-S. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros metales como la electromicroscopía para responder preguntas adicionales relacionadas con la estructura de los polímeros fts en la muestra.

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