FtsZ Polimerización Ensayos: Protocolos simples y Consideraciones

El objetivo general del siguiente experimento es determinar las condiciones adecuadas para estudiar la FTSZ, la polimerización y la actividad utilizando ensayos y equipos simples. Esto se logra mediante la realización de ensayos de sedimentación de polímeros FDSC en diversas condiciones para encontrar condiciones adecuadas en las que FDSZ polimeriza. Como segundo paso, realizamos ensayos de dispersión de luz para estudiar la polimerización FDSZ en tiempo real.

A continuación, realizamos ensayos de hidrólisis GTP para determinar la actividad g gtpa asociada a la polimerización de FT SC. Se obtienen resultados que muestran qué condiciones son las más adecuadas para el estudio de FTSC de una fuente bacteriana específica basada en sedimentación, dispersión de luz e hidrólisis GTP. Las técnicas que se muestran aquí son fáciles de realizar en cualquier laboratorio y proporcionarán una idea rápida de las capacidades de polimerización de FT a z específicos. Descubrimos que la elección del tampón adecuado es especialmente importante cuando se trabaja con FTAZ en presencia de otras proteínas que demuestran que la técnica será EVA crawl, un estudiante graduado de mi laboratorio.

Para comenzar, agregue cinco microlitros de cloruro de magnesio de 100 milimolares y 12 micromolares de las proteínas bacterianas, FDSC y/o SEP F en uno de los tampones de polimerización elegidos que tengan varios valores de pH y composiciones como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, coloque los tubos en una incubadora con función de agitación e incube las muestras durante dos minutos a 30 grados centígrados y 300 RPM. Una vez que los tubos se hayan mezclado completamente, comience la polimerización agregando un microlitro de mezcla de GTP o GDP de una solución madre de 100 milimolares para que la concentración final sea de dos milimolares.

A continuación, vuelva a colocar las muestras en la incubadora agitadora durante 20 minutos más. A continuación, gire los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos a 20.000 rpm utilizando un rotor TLA 55 o un 24.600 G equivalente si se utiliza otra cosa. Una vez finalizada la centrífuga, transfiera los sobrenadantes a tubos limpios y guarde los pellets para más tarde.

Tome 20 microlitros de los sobrenadantes transferidos y mézclelos en un tubo separado con 20 microlitros de tampón de muestra dos veces concentrado. Asegure las tapas y hierva las muestras durante 10 minutos a 98 grados centígrados. A continuación, agregue 50 microlitros de tampón de muestra dos veces concentrado a cada fracción de pellet que se reservó previamente y suspenda los polímeros hirviendo las muestras durante 10 minutos a 98 grados centígrados.

Una vez que las muestras hayan terminado de hervir, agregue 50 microlitros adicionales de agua desmineralizada a los tubos que contienen los pellets. A continuación, cargue 10 microlitros de los sobrenadantes y gránulos de cada muestra uno al lado del otro en un gel de página 10%SDS y haga funcionar el gel a 150 voltios. Una vez que el gel esté completo, retira el gel y tíñelo con kumasi azul brillante G two 50.

A continuación, obtenga una imagen del gel y cuantifique la proteína mediante citometría, tal y como se describe en el protocolo de texto adjunto. Primero encienda un espectrómetro fluorescente y deje que la lámpara se caliente durante varios minutos para evitar fluctuaciones térmicas. Además, encienda un baño de agua circulante y ajuste la temperatura del agua a 30 grados centígrados para mantener la cámara de vete a una temperatura constante.

A medida que el sistema se calienta, defina los parámetros de funcionamiento del espectrómetro. Ajuste el detector de alto voltaje a 300 voltios y las longitudes de onda de emisión y excitación a 350 nanómetros con un ancho de rendija de cuatro nanómetros. A continuación, programe el protocolo de adquisición de datos eligiendo una adquisición basada en el tiempo con una duración de 3.600 segundos.

Limpie cuidadosamente una veta de fluorescencia de 200 microlitros con una longitud de paso de un centímetro fornicándola en una solución de limpieza en un baño de agua durante cinco minutos. A continuación, prepare 294 microlitros de una mezcla maestra para cada uno de los nueve tampones de polimerización descritos en el protocolo de texto adjunto, cada uno con 10 milimolares de cloruro de magnesio y 12 micromolares de FDSE como concentraciones finales calculadas para 300 microlitros. Luego, en un vórtice breve, las mezclas transfieren 196 microlitros del primer tampón de polimerización al veterinario.

Colóquelo en el espectrómetro e incube durante dos minutos para que la temperatura de la muestra alcance los 30 grados centígrados. Después de dos minutos, inicie la adquisición de datos y espere 90 segundos para verificar que la señal es estable. A continuación, añade cuatro microlitros de 100 milimolares GTP o GDP.

Mezcle la muestra y continúe la adquisición de datos durante una hora completa. Repita estos pasos para cada búfer de la lista. Prepare 1,5 mililitros de dos milimolares GTP en un tampón de polimerización elegido.

Prepare también una dilución estándar de fosfato en el rango de cero a 40 micromolares en el mismo tampón. A continuación, prepare el reactivo de trabajo verde de malaquita como se describe en el kit de bioensayos. A continuación, forme cuatro mezclas maestras con un volumen total de 360 microlitros cada una: la mezcla maestra contiene FDSZ, derivada de B, subtilis, y la mezcla maestra, dos, contiene FDSE, derivada de E. coli.

Las mezclas maestras tres y cuatro se utilizan como controles y contienen EDTA en lugar de cloruro de magnesio. A continuación, pipetea 20 alícuotas de microlitros de las mezclas maestras y patrones de fosfato. En la placa A-Q-P-C-R 96 pocillos, de modo que hay 16 pocillos para cada mezcla maestra y los estándares de fosfato dispuestos como se muestra aquí.

Pipetear 180 microlitros de dos milimolares de culata GTP hasta el último carril de la placa. A continuación, coloque la placa en una máquina de PCR. Ejecute un programa con un solo ciclo configurado a 30 grados centígrados durante 40 minutos.

En una segunda pipeta de placa de 96 pocillos, 20 alícuotas de microlitros del reactivo de trabajo verde de malaquita en pocillos, A uno a H 10. Luego, a los 60 microlitros del tampón de polimerización del experimento, las reclamaciones A uno a H ocho, a continuación, a 20 microlitros de la solución GTP de dos milimolares a los pocillos en cada carril de la placa. Uno en los intervalos predeterminados, como se muestra aquí, para examinar la reacción en varios puntos de tiempo.

Coloque las mezclas hacia arriba y hacia abajo para mezclarlas después de 30 minutos, comenzando con el carril uno en la placa uno, transfiera 20 microlitros del carril uno de la placa uno al carril uno de la placa dos y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Este es el punto de partida del desarrollo del color verde malaquita para la reacción de 30 minutos, después de 30 minutos y medio, transfiera 20 microlitros del carril dos de la placa uno al carril dos de la placa dos y mezcle. Este es el punto de partida del desarrollo del color verde malaquita para la reacción de 20 minutos.

Repita estos pasos con los carriles restantes del tres al siete a intervalos 32 después de 33 minutos y medio a 20 microlitros de GTP hasta el carril ocho en la placa uno y mezcle. Luego transfiera 20 microlitros al carril ocho en el segundo plato y mezcle. Esto representa la reacción de minuto cero y es el punto de tiempo de inicio para el desarrollo del color verde malaquita.

Después de 34 minutos, agregue 80 microlitros del carril nueve de la placa uno que contiene el estándar de fosfato al carril nueve de la placa dos y mezcle después de 34 minutos y medio, transfiera 80 microlitros del segundo patrón de fosfato en el carril 10 de la primera placa al carril 10 en la placa dos y mezcle. A continuación, retire todas las burbujas de aire de las muestras e incube la placa a temperatura ambiente durante otros 25 minutos y medio. Después de la incubación.

Coloque la placa en un lector de placas de 96 pocillos a partir de los 60 minutos desde el inicio del experimento. Mida la placa a 630 nanómetros cada 30 segundos durante cinco minutos para que se tomen 10 puntos de tiempo. La primera medición de la placa corresponderá con el carril uno, la segunda con el carril dos, y así cada carril ha tenido exactamente el mismo tiempo para que se desarrolle el color verde malaquita.

A continuación, calcule el fosfato libre en cada muestra utilizando la curva de calibración del estándar de fosfato y trace los datos como liberación de fosfato a lo largo del tiempo. A continuación, calcule la actividad de hidrólisis F-D-S-Z-G-T-P a partir del rango lineal de la curva. Aquí se muestra el porcentaje de SEP F y FDSZ en los gránulos de las muestras.

FDSZ se recuperó en el perdigón por encima de los niveles de fondo solo cuando tanto SEP F como GTP también estaban presentes en la muestra. Se desconoce la estequiometría exacta de SEPPE y FDSZ en estos túbulos, pero estos resultados sugieren que hay más seppe presente que FDSZ. Aquí se muestra la dispersión de la luz de FDSZ de B subtilis y E. coli, ensamblada en presencia de dos GTP milimolares en el tampón de cloruro de potasio de 50 milimolares.

F-D-S-E-B-S proporciona una señal de dispersión de luz de 20 a 40 veces mayor que FDSC EC dependiendo del pH del tampón. Curiosamente, el aumento de la concentración de cloruro de potasio en el tampón no influyó significativamente en la señal de dispersión de luz de F-D-S-Z-E-C, pero la señal de F-T-S-Z-B-S disminuyó aproximadamente 80 veces a pH 7.5, 30 veces a pH 6.8 y 45 veces a pH 6.5 en cloruro de potasio de 300 milimolares en comparación con los tampones con cloruro de potasio de 50 milimolares. La actividad de hidrólisis de GTP de FDSZ se midió en diferentes condiciones de tampón utilizando un ensayo colorimétrico para fosfato libre.

Se encontró que la actividad GTPS de FT SZ aumenta con el aumento de la concentración de cloruro de potasio en cada una de las diferentes condiciones de pH. A 50 milimolares de cloruro de potasio, la actividad de gtpa se redujo debido a la agrupación de filamentos F-D-S-Z-B-S a 50 milimolares. El cloruro de potasio FDSZ EEC tuvo una actividad GTPS de tres a seis veces mayor que F-D-S-Z-B-S debido al desmontaje más rápido de los polímeros FDSC EEC.

Finalmente, la diferencia en la actividad de hidrólisis de GTP entre F-D-S-Z-B-S y F-D-S-Z-E-C se redujo a 300 milimolares de cloruro de potasio, posiblemente debido a la reducción del agrupamiento de filamentos F-D-S-Z-B-S. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros metales como la electromicroscopía para responder preguntas adicionales relacionadas con la estructura de los polímeros fts en la muestra.