Visualización del flujo citoplasmático durante la cicatrización de heridas unicelulares en Stentor coeruleus

El objetivo general de este procedimiento es medir el flujo de citoplasma durante la cicatrización de heridas en una sola célula. Esto se logra recolectando primero células vivas de stent o SEIUs para usarlas como un sistema modelo para el herido celular. El segundo paso es preparar las herramientas de vidrio para cortar las células.

A continuación, las células del stent sarius se abren en una configuración de microscopio personalizada que permite la cirugía simultánea de bajo aumento y la obtención de imágenes de alta resolución. El paso final es realizar un análisis computacional del flujo citoplasmático utilizando un software de simetría de velocidad de imagen de partículas. En última instancia, se utilizan imágenes de alta resolución del citoplasma para mostrar la respuesta activa de las células durante la cicatrización de heridas.

Este método se puede utilizar para abordar preguntas clave sobre la cicatrización de heridas celulares, como si el citoplasma se vuelve gelatinoso alrededor de la región de un corte para evitar fugas al medio circundante. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación y corte de la herramienta de manejo de células son difíciles de aprender, ya que requieren destreza manual. Para comenzar a obtener stent o células Sirius de protuberancia natural como se describe en tártaro o de un proveedor comercial, agregue 300 mililitros de stent modificado o medio adaptado de recetas de santar y deter como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Mantenga los cultivos cultivándolos en la oscuridad a 20 grados centígrados. A continuación, cultive cultivos de algas Chlamydomonas Rhine Hardy en medio de fosfato de acetato de tris. Usando métodos de cultivo estándar antes de la alimentación, lave las células de Chlamydomonas girándolas suavemente hacia abajo, eliminando el sobrenadante y suspendiéndolas en el stent o medio modificado.

Alimente los cultivos de stent o sarius de 300 mililitros con aproximadamente 30 millones de células chm dos o tres veces por semana cuando sea necesario. Recolectar stent o células para la cirugía. Para comenzar, agite suavemente el cultivo burbujeando aire a través de la punta de una pipeta hasta que las células comiencen a desprenderse y nadar libremente.

A continuación, capture las células natatorias con una pipeta de un mililitro equipada con una punta de diámetro ancho para evitar el cizallamiento de las células. Una vez recogidas, deje que las celdas se asienten. A continuación, pipetea lentamente los medios que se encuentran por encima y añade un stent o medio modificado nuevo.

Prepare las agujas de vidrio utilizadas para cortar las células del stent sosteniendo dos varillas agitadoras de vidrio sobre la abundancia y el quemador hasta que los extremos comiencen a derretirse. Luego toque los extremos de las dos varillas hasta que el vidrio fundido se fusione. Una vez que se fusionen, retíralos del fuego y déjalos enfriar durante uno o dos segundos.

Luego, sepáralos lentamente para hacer una ruptura limpia. Idealmente, esto producirá una aguja de aproximadamente uno a dos centímetros de largo con una punta fina en el extremo. Si la aguja resultante no es óptima, rompa la punta en la cintura de vidrio y reutilice las varillas.

A continuación, use un sello de goma cuadrado recubierto de vaselina para preparar una cámara cuadrada con paredes de vaselina presionándola en un cubreobjetos de vidrio. A continuación, añada 100 microlitros de stent modificado o medio que contenga un 2% de metilcelulosa al cuadrado de vaselina. Coloque el cubreobjetos preparado en un adaptador de plástico y luego agregue las células del stent lavadas al cubreobjetos.

Finalmente, organice las células en la metilcelulosa de manera que estén espaciadas uniformemente y se empujen lo suficientemente cerca de la superficie del cubreobjetos para estar enfocadas durante la toma de imágenes. Para comenzar, coloque el portaobjetos en la platina del microscopio invertido. A continuación, retire el cuerpo del microscopio de disección de su soporte y determine la posición aproximada en la que deberá colocarse para visualizar el portaobjetos con un aumento bajo desde la parte superior.

A continuación, construya un microscopio de dos pisos añadiendo una caja de cartón con el espacio deseado entre el ocular del microscopio invertido y el endoscopio de disección. Tape la caja en su lugar con cinta de laboratorio para que se pueda quitar fácilmente Cuando se complete el experimento, asegúrese de que la muestra esté en el campo de visión y enfocada sin necesidad de mover el endoscopio de disección Una vez que esté colocado, sostenga el endoscopio de disección contra la caja y péguelo a la caja con cinta de laboratorio. A continuación, configure el microscopio invertido utilizando la óptica DIC colocando un objetivo de aire de 20 x en su lugar.

Además, asegúrese de usar un condensador DIC de larga distancia de trabajo para proporcionar suficiente espacio para realizar la microcirugía desde arriba. A continuación, enfoca las células con el microscopio invertido con todo preparado y enfocado desde ambos lados. Comience a adquirir imágenes a una velocidad de fotogramas de dos imágenes por segundo, utilizando una cámara CCD de cinco de 12 por cinco 12.

A continuación, corte la celda con la aguja de vidrio. Capture el patrón de flujo citoplasmático inicial y observe todas las etapas del proceso de herida y cicatrización de la herida. Finaliza la adquisición cuando la célula ha recuperado su aspecto normal o ha vuelto a iniciar la motilidad activa.

Para empezar, descargue PIV lab, un paquete de MATLAB para medir el flujo citoplasmático utilizando la simetría de velocidad de imagen de partículas. A continuación, cargue la pila de imágenes TIFF para cada secuencia de vídeo en el manual del programa de simetría de velocidad de imagen de partículas dentro de MATLAB. Genere manualmente una máscara para cada pila de imágenes con el fin de enmascarar regiones de los datos sin procesar fuera del cuerpo del stent.

A continuación, configure PIV lab para que utilice la configuración de transformación rápida de Fourier y un tamaño de bin de 64 por 64 píxeles, que agrupará los píxeles de cada fotograma en píxeles cuadrados más grandes. A continuación, ejecute PIV lab para calcular las correlaciones cruzadas entre los píxeles de cada fotograma con los píxeles cercanos. En el siguiente fotograma, esto producirá un vector de flujo dependiente del tiempo centrado en cada píxel de curvatura, que tiene la misma resolución de tiempo que los datos sin procesar.

A continuación, calcule los promedios de tiempo de la salida del campo vectorial resultante para comparar los datos tomados con el stent antes del corte y durante la cicatrización de la herida. Además, calcule histogramas de velocidades de flujo para estudiar la intensidad del flujo y el cambio de velocidad en un píxel determinado a lo largo del tiempo para estudiar las fluctuaciones del flujo. Al obtener imágenes de secuencias con el stent o la célula dividida por la mitad, calcule el flujo total de citoplasma de regreso al cuerpo celular propiamente dicho multiplicando la velocidad promedio del flujo por el área de la sección transversal de la base de la burbuja del citoplasma extracelular.

Aquí se muestran imágenes en vivo de un stent o célula a medida que se corta y se interrumpe con una aguja de vidrio. Después del corte, se ha extraído una cantidad sustancial de citoplasma del cuerpo celular principal, pero fluye rápidamente de regreso a la célula. Después de este procedimiento, se pueden agregar inhibidores químicos para responder preguntas adicionales, como qué componentes del citoesqueleto podrían contribuir al movimiento citoplasmático durante la cicatrización del stent o la herida.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar las herramientas para cortar el stent en nuestras células y cómo obtener imágenes del flujo citoplasmático durante el proceso de corte y cicatrización de heridas dentro de una sola célula gigante.