Establecimiento de la concentración bactericida mínima de un agente antimicrobiano para las células planctónicas (MBC-P) y las células de biopelícula (MBC-B)

Este procedimiento compara directamente la resistencia planctónica y de biopelícula para una cepa bacteriana que puede formar una biopelícula. En primer lugar, establezca una biopelícula, reponga el medio y aplique una dilución en serie del agente antimicrobiano de elección. A continuación, permita que las células se recuperen en medio fresco.

Ahora pruebe la viabilidad de las células mediante la siembra en un sinfín LB. En última instancia, la determinación de la concentración bactericida mínima de las células planctónicas y de biopelícula se utiliza para mostrar el aumento de la resistencia que resulta del crecimiento en una biopelícula. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque contaminan los pozos adyacentes o no permiten que las puntas del dispositivo de múltiples puntas se enfríen lo suficiente como para que no maten a las bacterias.

El cultivo, la cepa de bacterias de tipo salvaje y mutante durante 16 horas en un medio rico a 37 grados centígrados, diluye los cultivos saturados durante la noche en un medio fresco como M 63, medio mínimo, suplementado con magnesio, sulfato y arginina. Luego Eloqua. 100 microlitros por pocillo.

Asignando 24 pocillos para cada cepa, incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados. A continuación, prepare 10 soluciones madre de una serie de dilución de antibiótico para siete pocillos y almacene en hielo. Con una pipeta multicanal, elimine el sobrenadante gastado que contiene células planctónicas.

A continuación, añada 90 microlitros de M 63 a todos los pocillos y añada 10 microlitros de la solución madre antibiótica adecuada al control sin antibióticos. Pues bien, por cada réplica y colada, añade 10 microlitros de agua. Incubar la placa de microtitulación durante 24 horas a 37 grados centígrados.

Con una pipeta multicanal, elimine el sobrenadante gastado que contiene células planctónicas. Agregue 115 microlitros de M 63 a todos los pocillos y continúe cultivando los cultivos durante 24 horas. A 37 grados centígrados.

Etiquete una placa de barrena de una libra por medio 96. Placa de microtitulación para esterilizar el dispositivo de múltiples puntas, sumérjalo en etanol al 100% y pase las puntas a través de la llama abierta de un quemador bunsen. Deja que las puntas se enfríen un poco.

Usando las puntas de las puntas. Transfiera el cultivo planctónico de cada pocillo de la placa de microtitulación a la superficie de una placa de barrena LB. Coloque las placas de barrena LB a 37 grados centígrados durante 16 horas.

A continuación, determine visualmente el punto de corte para el crecimiento bacteriano como la concentración bactericida mínima del cultivo de antibióticos, el tipo salvaje y la cepa mutante de bacterias durante 16 horas en un medio rico a 37 grados Celsius, diluya los cultivos saturados durante la noche del uno a 100 en medio fresco para ensayos de resistencia a antibióticos en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Añadir 90 microlitros de la dilución bacteriana. Ahora para exponer las células planctónicas a un gradiente de concentración de antibiótico.

Comience con 10 soluciones madre de una serie de diluciones de antibióticos como la tobramicina micina. Agregue 10 microlitros de los tallos de antibiótico según el diseño experimental. Luego agregue 10 microlitros de agua a los pozos de control sin antibióticos para cada réplica y cepa.

Incubar la placa de microtitulación durante 24 horas a 37 grados centígrados para analizar si hay células vivas. Comience etiquetando una placa de barrena LB para cada mitad de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Esterilice el dispositivo de múltiples puntas flameándolo con etanol al 100%.

Repita una vez. Luego, usando el dispositivo de múltiples puntas, transfiera aproximadamente tres microlitros de cultivo planctónico de cada pocillo de la placa de microtitulación a la superficie de una placa de barrena LB. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 16 horas.

A continuación, determine la concentración bactericida mínima del antibiótico identificando a ojo el límite para el crecimiento bacteriano. En este experimento, se utilizaron dos ensayos diferentes de concentración mínima bactericida para comparar la sensibilidad del tipo salvaje PA 14 con una cepa mutante que carece de resistencia a los antibióticos. Gen NDVB.

Aquí, se midieron las concentraciones bactericidas mínimas del antibiótico tobramicina para la biopelícula. El MBCB para PA 14 es de 100 microgramos por mililitro en comparación con los 12,5 microgramos por mililitro del mutante. Por el contrario, las concentraciones bactericidas mínimas de tobramicina para las células planctónicas fueron de ocho microgramos por mililitro tanto para el tipo salvaje como para el mutante PA 14.

Una vez dominado, el NBCB se puede hacer en alrededor de una hora, dividida en cinco días.