El accionamiento a distancia magnética del micrométrica Sondas para

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar en C dos mediciones de las propiedades físicas locales de un biofilm bacteriano a escala micrométrica. Para ello, se introducen partículas magnéticas en un biofilm en crecimiento para que actúen como sondas que pueden activarse a distancia sin perturbar las propiedades estructurales del biofilm. Luego se utilizan pinzas magnéticas especializadas para ejercer una fuerza definida sobre cada partícula.

Incrustado en la película del biofilm, el desplazamiento de las partículas inducido por la tracción magnética se monitorea mediante microscopía de video para obtener los parámetros viscoelásticos locales y proporcionar la distribución espacial tridimensional de las propiedades mecánicas del biofilm. Se obtienen resultados que muestran la heterogeneidad mecánica del biofilm de e coli y ofrecen indicios sobre qué componentes del biofilm sustentan sus propiedades físicas. Por lo tanto, la ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía, la reología o el estudio de biovegetación completa es que permite informar la distribución espacial de las propiedades mecánicas in situ sin alterar la estructura original del material.

Para preparar las partículas magnéticas para este protocolo, agite mediante vórtex el vial del lote de partículas de 2,8 micrómetros para resuspenderlas. Luego, transfiera 10 microlitros a un tubo de microcentrífuga. A continuación, para lavar las partículas, añada 190 microlitros de medio mínimo, agite suavemente el tubo, colóquelo en un soporte magnético, espere la formación del botón y aspire la solución sobrenadante.

Repita este paso de lavado otras dos veces y re suspenda las perlas en 190 microlitros de medio mínimo. A continuación, agregue 950 microlitros de M 63 B uno con 0,4 % de glucosa a 50 microlitros de la solución de perlas lavadas para ajustar la concentración de partículas a aproximadamente 5 millones de perlas por mililitro. Para preparar el canal, utilice un cortador de vidrio de diamante para cortar dos capilares cuadrados de vidrio borosilicatado de 10 centímetros de longitud y obtener dos piezas de ocho centímetros de largo.

Utilizando el cortador de vidrio, corte un portaobjetos por la mitad. Luego, usando un pegamento de cianoacrilato de acción rápida o pegamento instantáneo, fije las dos piezas capilares a dos piezas de portaobjetos como se muestra en este diagrama. Colóquelas a dos centímetros de distancia con un saliente de un centímetro en cada extremo y esterilice mediante autoclave todo el montaje y los tubos necesarios.

Para la conexión adicional de canales, reúna los siguientes materiales estériles bajo una campana de flujo laminar. El tubo del canal montado y los conectores, dos filtros pediátricos de burbujas o trampas, dos pinzas, jeringas de 30 mililitros llenas con M 63 B, 1,4 % de glucosa y la botella de desecho.

Conecte los dos capilares de la misma manera. Utilizando uno de los tubos, conecte la botella de desecho a uno de los extremos del capilar.

Luego, utilizando conectores tipo cerradura como uniones, conecte el otro extremo del capilar al atrapador de burbujas casero o del atrapador uno al atrapador dos. A continuación, conecte la jeringa de 30 mililitros de M 63 B uno al atrapador dos. Posteriormente, llene el sistema con M 63 B uno estéril con 0,4 % de glucosa.

Instale la jeringa en la bomba de jeringa y encienda la bomba a una velocidad de aproximadamente cinco mililitros por hora superior a las velocidades experimentales. Controle cuidadosamente y elimine todas las burbujas del circuito si es necesario. Desconecte y vuelva a conectar el circuito mientras realiza este procedimiento.

Tenga cuidado de eliminar cualquier burbuja antes y durante la introducción de la mezcla de partículas celulares en el tubo; es útil colocar la basura por encima de las capilares, lo cual favorecerá el crecimiento continuo del biofilm. Permita que el medio fluya a través del sistema durante 10 a 15 minutos. Mientras tanto, en un tubo de microcentrífuga, mezcle un mililitro de la suspensión bacteriana con densidad óptica 0,5 con un mililitro de la solución de perlas lavadas preparada anteriormente.

Desactive el flujo, vuelva a colocar el tubo y luego cierre las pinzas. A continuación, llene una jeringa de un mililitro con la mezcla de perlas bacterianas e introdúzcala en el capilar. Después del trampa de burbujas casera, traslade el aparato al microscopio que se encuentra allí.

Instale el capilar en la platina del microscopio y coloque el recipiente de desecho a un nivel ligeramente más alto. Coloque la bomba de jeringa sobre la encimera al lado del microscopio. Deje el aparato en reposo durante 15 a 20 minutos para permitir que las bacterias sedimenten y se adhieran a la superficie del capilar.

Una vez que las bacterias se hayan adherido al capilar, abra las pinzas y ajuste la velocidad de flujo en la bomba de jeringa e inicie el flujo. A lo largo de 24 a 48 horas, se desarrollará un biofilm sobre la superficie del capilar, enfoque el plano inferior del capilar e inicie la grabación de imágenes del tiempo transcurrido. Por lo general, una frecuencia de adquisición de dos imágenes por minuto reportará adecuadamente el crecimiento del biofilm.

Este vídeo muestra la etapa inicial del biofilm justo después de la inyección de la mezcla de partículas celulares. En la adquisición capilar, la frecuencia es de una imagen por segundo, y el vídeo se reproduce a 10 cuadros por segundo. Después de cuatro horas de crecimiento, las partículas se desprendieron progresivamente de la superficie para distribuirse en el volumen del biofilm.

Las flechas azules indicaron eventos de desprendimiento. Aquí, la frecuencia de adquisición es de dos imágenes por minuto, y la película se reproduce a 15 cuadros por segundo. Después de 20 horas de crecimiento, se pueden monitorear una docena de partículas distribuidas uniformemente en un plano focal.

Esta película se tomó en un plano medio, a 20 micrómetros por encima del fondo del capilar. Se adquirieron dos imágenes por minuto. La película se reproduce a 15 cuadros por segundo.

Una vez que el biofilm sembrado con partículas magnéticas esté creciendo manualmente, atornille las pinzas magnéticas en la platina del microscopio. Para asegurar que se generen los gradientes de campo magnético adecuados en la zona de observación, asegúrese de que las pinzas estén colocadas como se muestra en este diagrama, en el que la región de medición indicada en rojo se encuentra a 300 micrómetros de los bordes de los polos izquierdo y derecho de las pinzas a lo largo del eje Y. La parte inferior del capilar se coloca a 200 micrómetros por debajo de la base de las pinzas.

Para lograr este paso, utilice el control de movimiento XY de la platina del microscopio para alinear el borde del polo magnético izquierdo con el borde izquierdo del capilar. En el mismo campo de observación, ajuste la posición del polo a 300 micrómetros del borde del capilar utilizando el mando x del micromanipulador izquierdo de las pinzas. Realice la misma operación en el lado derecho.

Luego, ajuste la posición de las pinzas a lo largo del eje Z con respecto al fondo del capilar. Primero, alinee la base de los polos con el fondo del capilar y desplace los polos 200 micrómetros hacia arriba.

Utilizando el dial Z del micromanipulador, configure los parámetros del generador de funciones en 24 segundos de señal cero y 16 segundos de cuatro amperios. Corriente continua con un disparador. Envíe a la obturación de luz de campo brillante después de 20 segundos.

Para la sincronización de la señal, conecte la pinza al generador de funciones mediante el amplificador de potencia. Preste atención a conectar correctamente los polos en serie para obtener curvas de fluencia distribuidas espacialmente. Establezca un origen espacial, colocando el origen del eje Z en la parte inferior interna del capilar.

Registre la posición del control Z del microscopio. Luego, localice la intersección de los ejes x e Y, definidos por el borde del capilar y el borde de la pieza polar, respectivamente. Este es el origen del análisis.

Registre las coordenadas. Todas las coordenadas se tomarán con respecto a este origen en lo sucesivo. Una vez que el biofilm haya crecido, utilice el botón de control de enfoque fino para ajustar la posición vertical del capilar de manera que el primer plano quede ubicado entre cuatro y siete micrómetros por encima del fondo del capilar.

Este corte corresponde al corte de biofilm en el que el origen del sistema de referencia espacial se encuentra en la esquina superior izquierda. Luego encienda el generador de corriente y active manualmente la secuencia de adquisición de imágenes. Para iniciar la 42.ª secuencia de eventos, el flujo de imágenes adquirido aquí corresponde a un plano y un campo XY determinados.

Después de que se haya capturado la secuencia, mueva el capilar para capturar un video del nuevo campo. Continúe repitiendo este proceso para obtener todos los videos necesarios para analizar los datos. Abra las imágenes en ImageJ o un software equivalente de seguimiento de partículas para todas las series adquiridas en todas las partículas.

Convierta las imágenes en archivos de texto mediante el seguimiento del desplazamiento de partículas. A continuación, utilizando un software de tratamiento de datos, trace las curvas de desplazamiento y convierta dichas curvas de desplazamiento en curvas de compliancia, en las cuales la compliancia total del material JFT se calcula como una función del tiempo según la fórmula de compliancia mostrada aquí. Esta fórmula describe la relación entre el esfuerzo aplicado y la deformación del material para una partícula histórica de rojos, o incrustada en un medio viscoelástico e incompresible, tal como fue establecido previamente y por sus colegas. A partir del ajuste de la curva de compliancia de fluencia al modelo general de Burgers para materiales viscoelásticos, obtenga los parámetros viscoelásticos J cero, J uno, η cero, η uno prima, para proporcionar la distribución espacial de las propiedades viscoelásticas. Las curvas de fluencia se recopilaron a diferentes profundidades en un microvolumen de biopelícula de aproximadamente 200 por 200 por 40 micrómetros cúbicos. Se muestran aquí resultados típicos.

Los valores de J cero, la compliance elástica, se dan como una función del eje Z a lo largo de la profundidad y del eje Y a lo largo de una dimensión lateral del biofilm. Cada punto corresponde a una microesfera para la cual el análisis de la curva de fluencia ha proporcionado un valor de J cero. Los datos revelan que la compliance local varía a lo largo de la profundidad del biofilm en casi tres órdenes de magnitud.

Además, se produjo una fuerte heterogeneidad lateral en todas las alturas del biofilm. Los datos también proporcionan la distribución de los valores de compliancia, que presentan una forma amplia y asimétrica. La comparación de estos resultados con los obtenidos previamente en otros polímeros biológicos sugiere que las propiedades mecánicas del biofilm están sostenidas por geles poliméricos altamente reticulados.

En el caso C, también se realizaron dos mediciones del biofilm, analizando propiedades locales bajo diferentes condiciones ambientales, como una menor velocidad de flujo, tal como se observa aquí. Los valores de compliancia de un biofilm cultivado a 0,1 mililitro por hora aún exhiben un perfil mecánico altamente heterogéneo. Sin embargo, la clara dependencia con la profundidad Z de la rigidez del biofilm observada en el biofilm cultivado a un mililitro por hora ha desaparecido.

Estos resultados demuestran el impacto significativo de las condiciones externas en la organización del biofilm. Al ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo mapear las propiedades viscoelásticas del biofilm en el Instituto bajo condiciones de crecimiento completamente controladas.