Name: Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprende a evaluar el sentido de la glucosa en neuronas del hipotálamo ventromedial de ratones adultos mediante imagen de tinte sensible al potencial de membrana. Este método permite cuantificar la actividad neuronal en respuesta a cambios de glucosa.

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NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

<ol><li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+neurons%3A+are+they+physiologically+relevant%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li>
<li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li>
<li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+insulin%2C+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li>
<li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li>
<li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 4th edn, Academic Press. (1998).</li>
<li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li>
<li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

La clave para ser capaz de estudiar la actividad de las neuronas de ratones adultos es la capacidad de disociar las neuronas sanas. La disociación de las neuronas del hipotálamo de ratones adultos es más difícil en varios pasos clave en el protocolo en comparación con las neuronas de ratones jóvenes. Hemos superar este problema en un número de maneras. Hacer rodajas gruesas 500 micras cerebrales minimiza los daños mecánicos a las neuronas en comparación con los habituales 250-350 micras rodajas utilizados para el tejido...

El cerebro regula la homeostasis de la energía a través de la neuroendocrino y el sistema nervioso autónomo. El hipotálamo ventromedial (HVM), compuesto por el núcleo ventromedial (VMN) y el núcleo arqueado (ARC), es importante para la regulación central de la homeostasis energética. Neuronas de detección de glucosa especializados, dentro del hipotálamo ventromedial, vinculan la actividad neuronal y periférico homeostasis de la glucosa 1. Hay dos tipos de glucosa de detección de glucosa en las neuronas; excitado (GE), las neuronas aumentan mientras que la glucosa inhibe (GI), las neuronas disminuyen su actividad a medida que aumenta extracelulares de glucosa. Neuronas de detección VMH glucosa se estudian generalmente usando electrofisiología o calcio / potencial de membrana de formación de imágenes colorante sensible. La técnica de patch clamp electrofisiológico se considera el estándar de oro en el estudio ex vivo de la actividad neuronal. En esta técnica, un electrodo de micropipeta de vidrio está unido a la membrana celular a través de una alta resistencia(GΩ) sello. Electrodos de patch clamp permiten la grabación en tiempo real de la acción potencial de la frecuencia (pinza de corriente) o conductancia de iones (fijación de voltaje) cambia dentro de una sola neurona. Mientras que la técnica de patch clamp proporciona información detallada con respecto a los cambios en las conductancias de los canales de iones específicos, un gran inconveniente es que sólo una neurona puede observado a la vez. Se tarda aproximadamente 30 a 45 min de la grabación para comprobar que uno está grabando desde una neurona detección de glucosa, incluso antes de comenzar un tratamiento experimental específico. Por otra parte, las neuronas GI y GE comprenden &lt;20% de la población total neuronal hipotálamo ventromedial. Agravando este problema es la falta, en muchos casos, de un marcador celular para la identificación de estas neuronas. Por lo tanto, está claro que a pesar de que proporciona valiosa información eléctrica que otras técnicas no pueden, el análisis de patch clamp es laborioso, lento y bajo rendimiento. El uso de imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas VMH permite el estudio de Hundreds de neuronas simultáneamente. Colorantes sensibles al calcio pueden ser utilizados para medir los cambios de calcio intracelular, lo que indirectamente se correlacionan con los cambios en la actividad neuronal. Potenciales colorantes sensibles de membrana se utilizan para supervisar los cambios potenciales de membrana. La medición de potencial de la membrana celular es un índice más directa de la actividad neuronal en comparación con los cambios en los niveles de calcio intracelulares. Por otra parte, el potencial de formación de imágenes de membrana tinte (MPD) potencialmente detecta pequeños cambios en el potencial de membrana en la potencial de acción disparando no se altera y los niveles intracelulares de calcio podría no cambiar. Ambas técnicas de formación de imágenes de fluorescencia se han utilizado para estudiar VMH neuronas de detección de glucosa a partir de ratones jóvenes 2-7. Si bien los resultados son menos detalladas que las obtenidas con la electrofisiología de pinzamiento zonal, la fuerza de los experimentos de imagen es que evaluar simultáneamente una gran población de células que incluyen inevitablemente un importante número de neuronas de detección de glucosa. MPD imágenes is particularmente útil para el estudio de las neuronas GI que se localizan a lo largo de todo el hipotálamo ventromedial de manera más uniforme; proporcionando así una población adecuada para estudiar en el hipotálamo ventromedial disociado (~ 15% GI). En contraste, mientras que las neuronas de GE están densamente localizado en el ventrolateral-VMN y pobres de células región entre el arco y VMN, que no representan un número significativo de neuronas dentro del hipotálamo ventromedial (&lt;1% GE). Por otra parte, mediante el estudio de las neuronas aisladas, astrocítica y efectos presinápticos son eliminados. Esto puede ser una ventaja en el estudio de efectos de primer orden de las neuronas, así como una desventaja ya que se pierden las conexiones y procesos fisiológicos. Un factor limitante en tanto patch clamp electrofisiología y la imagen de colorante MPD / calcio es la necesidad de utilizar animales jóvenes (por ejemplo, ratones o ratas. &lt;8 semanas de edad). Esto se produce principalmente debido al aumento de tejido conectivo en combinación con la disminución de la viabilidad neuronal que se produce con la edad. En el cerebro-slice espárrago electrofisiologíaIES, el aumento de tejido conectivo hace que sea más difícil de visualizar las neuronas. El aumento de tejido conectivo también hace más difícil disociar un gran número de neuronas sanas para los estudios de imagen. Además, las neuronas de los animales más jóvenes sobreviven más tiempo durante la grabación de patch clamp o imágenes. Sin embargo, el uso de ratones jóvenes puede ser una limitación importante. Actividad y / o respuestas a neurotransmisores o nutrientes que circulan neuronal cambian con la edad. Por ejemplo, dado que el balance de energía está estrechamente ligada a la situación reproductiva, las neuronas del hipotálamo que regulan el equilibrio energético pueden responder de manera diferente en la pre-vs animales postpubescent. Además, muchas enfermedades requieren tratamiento a largo plazo o no se manifiestan hasta la edad adulta. Los principales ejemplos de tales enfermedades son obesidad dietética o diabetes mellitus tipo 2. Dado que las neuronas de detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en estas enfermedades hemos desarrollado una metodología para el cultivo con éxito neuronas adultas del VMH saludables para su uso en formación de imágenes de exp MPDeriments.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal-A Medio (Personalizado)</td><td>Invitrogen</td><td>0050128DJ</td><td>hecho a medida sin glucosa</td></tr><tr><td>Hibernate-A Medio (Personalizado)</td><td>BrainBits</td><td></td><td>hecho a medida sin glucosa</td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina (20,000 U/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>otros proveedores aceptables</td></tr><tr><td>Unidades de filtro de vacío Stericup (0.22 &mu; m)</td><td>Millipore</td><td></td><td>otros proveedores aceptables</td></tr><tr><td>25 mm Cubreobjetos de vidrio</td><td>Warner</td><td>#1 25 mm redondos</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Cubreobjetos de vidrio</td><td>Warner</td><td>#1 18mm redondos</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>B27 menos insulina (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar VWR</td><td></td><td>55411</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome y cámara de enfriamiento</td><td>Vibratome</td><td>Serie 1000 Sistema</td><td></td>de seccionamiento</tr><tr><td>Cuchillas de vibratome</td><td>Polysciences</td><td>22370</td><td>inyector o cuchillas de doble filo de otros proveedores aceptables</td></tr><tr><td>Papaína, suspensión</td><td>Worthington</td><td>LS003124</td><td></td></tr><tr><td>BSA, adecuada para cultivo celular</td><td>Sigma</td><td></td><td>otro proveedor aceptable</td></tr><tr><td>ADNasa, para cultivo celular</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>otro proveedor aceptable</td></tr><tr><td>cilindros de clonación, 6 mm x 8 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de potencial de membrana (azul)</td><td>Molecular Devices</td><td>R8042</td><td></td></tr><tr><td>Calentador en línea</td><td>Warner</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Bombas de jeringa</td><td>WPI</td><td>sp100i</td><td>otro proveedor aceptable</td></tr><tr><td>Cámara cerrada</td><td>Warner</td><td>RC-43C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Warner</td><td>PE-90</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>software de análisis de imágenes alternativo aceptable</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX61 WI</td><td> utilizado con 10X&nbsp; objetivo </td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Fotometría</td><td>Cool Snap HQ</td><td></td></tr><tr><td>Narrow Cy3</td> Juego de filtros <td>Chroma</td><td>41007A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de iluminación</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr></tbody></table>

potencial de membrana tinte imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el estudio de la glucosa sensing

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Estudios de la actividad neuronal se realizan a menudo utilizando las neuronas de los roedores de menos de 2 meses de edad, debido a las dificultades técnicas asociadas con el aumento de tejido conectivo y la disminución de la viabilidad neuronal que se producen con la edad. Aquí se describe una metodología para la disociación de las neuronas hipotalámicas sanos de ratones adultos en edad. La capacidad para estudiar las neuronas de los ratones de edad adulta permite el uso de modelos de enfermedades que se manifiestan a una edad más tarde y podría ser de desarrollo más preciso para ciertos estudios. Imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas se puede utilizar para estudiar la actividad de una población de neuronas, en lugar de utilizar la electrofisiología para estudiar una sola neurona. Esto es particularmente útil cuando el estudio de una población neuronal heterogéneo en el que el tipo neuronal deseada es rara como para las neuronas hipotalámicas de glucosa de detección. Hemos utilizado el potencial de membrana de imagen de colorante de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos para estudiar sus respuestas a changes en glucosa extracelular. Neuronas detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en la regulación central del balance de energía. La capacidad para estudiar detección de glucosa en roedores adultos es particularmente útil ya que el predominio de enfermedades relacionadas con el balance de energía disfuncional (por ejemplo. La obesidad) aumentar con la edad.

La disección precisa de la VMH lejos de otras zonas del hipotálamo es importante para obtener resultados consistentes. La inclusión de otras áreas podría diluir la población neuronal VMH, cambiando el% de neuronas despolarizadas calculados. Además, las neuronas de detección de glucosa se ​​han identificado en otras regiones hipotalámicas, tales como el hipotálamo lateral, la cual puede diferir funcionalmente y mecánicamente a partir de glucosa detección de neuronas VMH. Figura 1 ilustra las ubicaciones ...

La actividad de las neuronas individuales de ratones adultos en edad puede ser estudiado por disociar las neuronas de regiones específicas del cerebro y el uso de membrana fluorescente potencial de formación de imágenes de colorante. Por respuestas de prueba a cambios en la glucosa, esta técnica se puede utilizar para estudiar la sensibilidad a la glucosa de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la detección de glucosa en neuronas hipotalámicas mediales ventrales o VMH de ratones mayores, utilizando un colorante sensible al potencial de membrana como índice de actividad neuronal. Esto se logra realizando primero la perfusión cardíaca para expulsar la sangre del cerebro de un ratón anestesiado antes de la extracción del cerebro. El segundo paso es crear cortes coronales de cerebro y diseccionar el VMH.A continuación, las neuronas VMH se disocian y se cultivan en cubreobjetos. El paso final es medir la fluorescencia de las neuronas a medida que la glucosa disminuye en presencia de colorante de potencial de membrana. En última instancia, cada cambio de neurona en fluorescencia se utiliza para cuantificar la respuesta de esa neurona inhibida por la glucosa a los cambios en la glucosa.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la electrofisiología, es la capacidad de estudiar las neuronas de un ratón adulto. Esto nos permite estudiar los estados de enfermedad en la edad adulta. Comience este procedimiento colocando el cerebro diseccionado en el mandril en la cámara Vibram con el Vibram configurado a velocidad lenta en el nivel dos y amplitud alta en el nivel nueve, corte rodajas de 300 a 500 micras hasta llegar al área hipotalámica.A continuación, corte rodajas finas de 100 micras desde la parte posterior hasta la anterior para aislar la región VMH precisa. Preste mucha atención a los cambios anatómicos en bgma menos 2,30 milímetros. El tercer ventrículo se divide en secciones dorsal y ventral. Corona.Una vez que las secciones transversales del fusible del tercer ventrículo cortan dos cortes de 500 micras, estos cortes contendrán la región correcta de VMH. Transfiera estas rodajas a una placa de Petri en hielo que contenga medios de cultivo. A continuación, diseccione el VMH.Utilice una pipeta para transferir suavemente las piezas de VMH a mililitros de medio de cultivo en hielo. En este paso, retire el medio de cultivo que contiene el VMH del hielo y permita la aclimatación a temperatura ambiente. Agregue 20 unidades por mililitro de pape a cuatro mililitros de medio de cultivo, luego invierta para mezclar y coloque en un baño de agua a 34 grados centígrados Verifique y mezcle por inversión cada minuto hasta que el medio de digestión ya no esté turbio.Después de eso, fíltrelo en un matraz estéril y transfiera el tejido al medio de digestión. A continuación, digiere el tejido agitando a 100 RPM a 34 grados centígrados durante 30 minutos. Durante la digestión, prepare un mililitro de medio que contenga 8% de albúmina sérica bovina disolviendo 80 miligramos de BSA en un mililitro de medio de cultivo y filtrándolo en un tubo cónico.Lave el tejido transfiriéndolo a cinco mililitros de medio de cultivo en un tubo cónico e invirtiéndolo lentamente. Una vez después, agregue 30 microlitros de la enzima del ADN a seis mililitros de cultivo, medio y mezcle para hacer un medio de tación. A continuación, aspire el medio de lavado y añada tres mililitros del medio de tación.Use las pipetas de vidrio para tritratar suavemente en el orden de mayor a menor 10 veces, y luego espere cuatro minutos para que se asienten las piezas más grandes. A continuación, utilice la segunda pipeta para transferir los dos mililitros superiores que contienen la suspensión celular disociada a un nuevo tubo cónico. Agregue dos mililitros de tri media tri 10 veces y espere tres minutos.Utilice la tercera pipeta para transferir los dos mililitros superiores a la suspensión de celdas. Después de eso, agregue un mililitro de tri media tri rate cinco veces y espere dos minutos. Utilice la cuarta pipeta para transferir los dos mililitros superiores a la suspensión de celdas.Ahora coloque la suspensión de celda disociada encima del 8% de BSA, teniendo cuidado de no mezclarlos. Luego centrifugó 1000 RPM durante cinco minutos. A continuación, coloque los cilindros de clonación de autoclave de seis por ocho milímetros en el centro de cada cubreobjetos completamente secos.A continuación, aspire y vuelva a suspender el pellet en 440 microlitros de medio de crecimiento caliente. Posteriormente, llena los cilindros de clonación con la suspensión neuronal y colócala en la incubadora durante 20 minutos. Retire los cilindros de clonación y lave los desechos muy suavemente.A continuación, llene cada placa con dos mililitros de medio de crecimiento y deje que las células se recuperen durante al menos una hora antes de realizar cualquier ensayo. En este procedimiento, prepare la solución de registro y ajuste el pH a 7,4. Ahora agregue cuatro mililitros de tampón de temperatura ambiente a una mezcla de vial de MPD azul a fondo y agregue cinco microlitros de tinte por mililitro de solución de grabación. Después de eso, incubar las células en dos mililitros de solución de registro de glucosa 2,5 milimolares con tinte a 34 grados centígrados durante 30 minutos protegidos de la luz.A continuación, llene las bombas de jeringa con una solución de registro de glucosa de 2,5 o 0,1 milimolares y el sistema de profusión con una solución de registro de glucosa de 2,5 milimolares. Conecte el tubo de jeringas de 60 mililitros a un colector. El tubo de salida del colector debe conectarse a un calentador en línea y luego a un tubo de polietileno, que luego se conecta a una cámara cerrada.Limpie las burbujas haciendo funcionar el sistema de perfusión y golpeando con un objeto duro si es necesario. A continuación, ajuste la tasa de perfusión a 0,5 mililitros por minuto y utilice un mínimo de luz durante el menor tiempo posible para configurar el sistema. A continuación, transfiera un cubreobjetos de 25 milímetros con neuronas adherentes a la cámara cerrada.Teniendo cuidado de no permitir que la funda se seque y de no introducir burbujas de aire. Alinee el deslizamiento en las ranuras de la pieza inferior. Coloque un par de gotas de solución de grabación a lo largo de los lados y ajuste suavemente la pieza superior para mantener el cubreobjetos en su lugar.A continuación, utilice un gotero para llenar la cámara con solución de grabación y coloque un cubreobjetos de 18 milímetros en la parte superior. Coloque suavemente el anillo blanco en la cámara para mantener el cubreobjetos más pequeño en su lugar. Después de eso, presione el anillo blanco hacia abajo muy lenta y ligeramente para evitar que se introduzcan burbujas de aire en la cámara cerrada.Ponga en marcha la bomba de jeringa para la solución de registro de glucosa de 2,5 milimolares. A continuación, presione el anillo blanco y conéctelo a la cámara cerrada. Libere lentamente la presión del anillo blanco y conéctelo a la tubería que conduce a un contenedor de desechos.Para el Centro de Imágenes MPD, las neuronas utilizan luz de campo claro bajo. Trate de minimizar la cantidad de tiempo que las células están expuestas a la luz y permita que el sistema de perfusión funcione durante 10 minutos para estabilizar la temperatura, el enfoque y el equilibrio de la matriz durante el cebado. Abra el programa METAMORPH y tome una imagen de campo claro de las neuronas con un aumento de 10 veces.Utilice la función de enfoque automático para tomar tres pilas de imágenes fluorescentes y determinar el enfoque con una precisión de cinco micras. Al final del período de cebado de 10 minutos, verifique el enfoque una vez más, luego comience a grabar imágenes fluorescentes cada 30 segundos durante 40 minutos. Establecer una línea de base en 2,5 milimolares de glucosa durante 10 minutos.Luego disminuya la glucosa durante 15 minutos y finalmente regrese a 2.5 milimolar de glucosa durante 15 minutos. Después de grabar todas las imágenes fluorescentes, tome una imagen de campo claro de las neuronas. Esta figura muestra una imagen de campo claro de las neuronas VMH sanas de un ratón adulto.Esta imagen se tomó 24 horas después de la disociación y se ha utilizado para la obtención de imágenes de MPD. A continuación, se muestran algunos ejemplos de neuronas que se utilizarían o no para el análisis. Aquí están las trazas representativas de fluorescencia MPD de una neurona GI indicada por verde y una neurona no GI indicada por glóbulos naranjas que se perfundieron con 2,5 milimolares de glucosa en solución de registro durante 10 minutos, seguido de una disminución a 0,1 milimolar G durante 15 minutos y un retorno a 2,5 milimolar G durante 15 minutos.Esta figura muestra el porcentaje de neuronas VMH adultas, que se despolarizan reversiblemente en respuesta a la disminución de glucosa detectada mediante imágenes fluorescentes de MPD. La magnitud del cambio en la glucosa se correlaciona positivamente con el porcentaje de neuronas despolarizadas después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el R-T-P-C-R de una sola célula, para identificar proteínas específicas expresadas por las neuronas sensibles a la glucosa.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

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La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

La absorción de glucosa aumenta en las neuronas motoras de Drosophila afectadas por la proteinopatía de unión al ADN TAR (TDP-43), según lo indicado por un sensor de glucosa codificado genéticamente basado en FRET.

Medición de la absorción de glucosa en modelos de Drosophila de proteinopatía por TDP-43

La comunicación intestino-cerebro, facilitada por el nervio vago, es crucial para la comunicación entre el sistema endocrino gastrointestinal y el cerebro. Sin embargo, aún no se comprende si la inyección intragástrica de glucosa puede cambiar la actividad cortical. Aquí, ofrecemos un protocolo integral para observar los cambios en la actividad cortical después de la inyección de glucosa en el duodeno.

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Aprende a evaluar el sentido de la glucosa en neuronas del hipotálamo ventromedial de ratones adultos mediante imagen de tinte sensible al potencial de membrana. Este método permite cuantificar la actividad neuronal en respuesta a cambios de glucosa.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing (Video) | JoVE Journal

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

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