Name: Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprende a evaluar el sentido de la glucosa en neuronas del hipotálamo ventromedial de ratones adultos mediante imagen de tinte sensible al potencial de membrana. Este método permite cuantificar la actividad neuronal en respuesta a cambios de glucosa.

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NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

<ol><li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+neurons%3A+are+they+physiologically+relevant%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li>
<li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li>
<li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+insulin%2C+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li>
<li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li>
<li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Reg.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 4th edn, Academic Press. (1998).</li>
<li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li>
<li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

La clave para ser capaz de estudiar la actividad de las neuronas de ratones adultos es la capacidad de disociar las neuronas sanas. La disociación de las neuronas del hipotálamo de ratones adultos es más difícil en varios pasos clave en el protocolo en comparación con las neuronas de ratones jóvenes. Hemos superar este problema en un número de maneras. Hacer rodajas gruesas 500 micras cerebrales minimiza los daños mecánicos a las neuronas en comparación con los habituales 250-350 micras rodajas utilizados para el tejido...

El cerebro regula la homeostasis de la energía a través de la neuroendocrino y el sistema nervioso autónomo. El hipotálamo ventromedial (HVM), compuesto por el núcleo ventromedial (VMN) y el núcleo arqueado (ARC), es importante para la regulación central de la homeostasis energética. Neuronas de detección de glucosa especializados, dentro del hipotálamo ventromedial, vinculan la actividad neuronal y periférico homeostasis de la glucosa 1. Hay dos tipos de glucosa de detección de glucosa en las neuronas; excitado (GE), las neuronas aumentan mientras que la glucosa inhibe (GI), las neuronas disminuyen su actividad a medida que aumenta extracelulares de glucosa. Neuronas de detección VMH glucosa se estudian generalmente usando electrofisiología o calcio / potencial de membrana de formación de imágenes colorante sensible. La técnica de patch clamp electrofisiológico se considera el estándar de oro en el estudio ex vivo de la actividad neuronal. En esta técnica, un electrodo de micropipeta de vidrio está unido a la membrana celular a través de una alta resistencia(GΩ) sello. Electrodos de patch clamp permiten la grabación en tiempo real de la acción potencial de la frecuencia (pinza de corriente) o conductancia de iones (fijación de voltaje) cambia dentro de una sola neurona. Mientras que la técnica de patch clamp proporciona información detallada con respecto a los cambios en las conductancias de los canales de iones específicos, un gran inconveniente es que sólo una neurona puede observado a la vez. Se tarda aproximadamente 30 a 45 min de la grabación para comprobar que uno está grabando desde una neurona detección de glucosa, incluso antes de comenzar un tratamiento experimental específico. Por otra parte, las neuronas GI y GE comprenden &lt;20% de la población total neuronal hipotálamo ventromedial. Agravando este problema es la falta, en muchos casos, de un marcador celular para la identificación de estas neuronas. Por lo tanto, está claro que a pesar de que proporciona valiosa información eléctrica que otras técnicas no pueden, el análisis de patch clamp es laborioso, lento y bajo rendimiento. El uso de imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas VMH permite el estudio de Hundreds de neuronas simultáneamente. Colorantes sensibles al calcio pueden ser utilizados para medir los cambios de calcio intracelular, lo que indirectamente se correlacionan con los cambios en la actividad neuronal. Potenciales colorantes sensibles de membrana se utilizan para supervisar los cambios potenciales de membrana. La medición de potencial de la membrana celular es un índice más directa de la actividad neuronal en comparación con los cambios en los niveles de calcio intracelulares. Por otra parte, el potencial de formación de imágenes de membrana tinte (MPD) potencialmente detecta pequeños cambios en el potencial de membrana en la potencial de acción disparando no se altera y los niveles intracelulares de calcio podría no cambiar. Ambas técnicas de formación de imágenes de fluorescencia se han utilizado para estudiar VMH neuronas de detección de glucosa a partir de ratones jóvenes 2-7. Si bien los resultados son menos detalladas que las obtenidas con la electrofisiología de pinzamiento zonal, la fuerza de los experimentos de imagen es que evaluar simultáneamente una gran población de células que incluyen inevitablemente un importante número de neuronas de detección de glucosa. MPD imágenes is particularmente útil para el estudio de las neuronas GI que se localizan a lo largo de todo el hipotálamo ventromedial de manera más uniforme; proporcionando así una población adecuada para estudiar en el hipotálamo ventromedial disociado (~ 15% GI). En contraste, mientras que las neuronas de GE están densamente localizado en el ventrolateral-VMN y pobres de células región entre el arco y VMN, que no representan un número significativo de neuronas dentro del hipotálamo ventromedial (&lt;1% GE). Por otra parte, mediante el estudio de las neuronas aisladas, astrocítica y efectos presinápticos son eliminados. Esto puede ser una ventaja en el estudio de efectos de primer orden de las neuronas, así como una desventaja ya que se pierden las conexiones y procesos fisiológicos. Un factor limitante en tanto patch clamp electrofisiología y la imagen de colorante MPD / calcio es la necesidad de utilizar animales jóvenes (por ejemplo, ratones o ratas. &lt;8 semanas de edad). Esto se produce principalmente debido al aumento de tejido conectivo en combinación con la disminución de la viabilidad neuronal que se produce con la edad. En el cerebro-slice espárrago electrofisiologíaIES, el aumento de tejido conectivo hace que sea más difícil de visualizar las neuronas. El aumento de tejido conectivo también hace más difícil disociar un gran número de neuronas sanas para los estudios de imagen. Además, las neuronas de los animales más jóvenes sobreviven más tiempo durante la grabación de patch clamp o imágenes. Sin embargo, el uso de ratones jóvenes puede ser una limitación importante. Actividad y / o respuestas a neurotransmisores o nutrientes que circulan neuronal cambian con la edad. Por ejemplo, dado que el balance de energía está estrechamente ligada a la situación reproductiva, las neuronas del hipotálamo que regulan el equilibrio energético pueden responder de manera diferente en la pre-vs animales postpubescent. Además, muchas enfermedades requieren tratamiento a largo plazo o no se manifiestan hasta la edad adulta. Los principales ejemplos de tales enfermedades son obesidad dietética o diabetes mellitus tipo 2. Dado que las neuronas de detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en estas enfermedades hemos desarrollado una metodología para el cultivo con éxito neuronas adultas del VMH saludables para su uso en formación de imágenes de exp MPDeriments.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal-A Medio (Personalizado)</td><td>Invitrogen</td><td>0050128DJ</td><td>hecho a medida sin glucosa</td></tr><tr><td>Hibernate-A Medio (Personalizado)</td><td>BrainBits</td><td></td><td>hecho a medida sin glucosa</td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina (20,000 U/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>otros proveedores aceptables</td></tr><tr><td>Unidades de filtro de vacío Stericup (0.22 &mu; m)</td><td>Millipore</td><td></td><td>otros proveedores aceptables</td></tr><tr><td>25 mm Cubreobjetos de vidrio</td><td>Warner</td><td>#1 25 mm redondos</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Cubreobjetos de vidrio</td><td>Warner</td><td>#1 18mm redondos</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>B27 menos insulina (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar VWR</td><td></td><td>55411</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome y cámara de enfriamiento</td><td>Vibratome</td><td>Serie 1000 Sistema</td><td></td>de seccionamiento</tr><tr><td>Cuchillas de vibratome</td><td>Polysciences</td><td>22370</td><td>inyector o cuchillas de doble filo de otros proveedores aceptables</td></tr><tr><td>Papaína, suspensión</td><td>Worthington</td><td>LS003124</td><td></td></tr><tr><td>BSA, adecuada para cultivo celular</td><td>Sigma</td><td></td><td>otro proveedor aceptable</td></tr><tr><td>ADNasa, para cultivo celular</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>otro proveedor aceptable</td></tr><tr><td>cilindros de clonación, 6 mm x 8 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de potencial de membrana (azul)</td><td>Molecular Devices</td><td>R8042</td><td></td></tr><tr><td>Calentador en línea</td><td>Warner</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Bombas de jeringa</td><td>WPI</td><td>sp100i</td><td>otro proveedor aceptable</td></tr><tr><td>Cámara cerrada</td><td>Warner</td><td>RC-43C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Warner</td><td>PE-90</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>software de análisis de imágenes alternativo aceptable</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX61 WI</td><td> utilizado con 10X&nbsp; objetivo </td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Fotometría</td><td>Cool Snap HQ</td><td></td></tr><tr><td>Narrow Cy3</td> Juego de filtros <td>Chroma</td><td>41007A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de iluminación</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr></tbody></table>

potencial de membrana tinte imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el estudio de la glucosa sensing

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Estudios de la actividad neuronal se realizan a menudo utilizando las neuronas de los roedores de menos de 2 meses de edad, debido a las dificultades técnicas asociadas con el aumento de tejido conectivo y la disminución de la viabilidad neuronal que se producen con la edad. Aquí se describe una metodología para la disociación de las neuronas hipotalámicas sanos de ratones adultos en edad. La capacidad para estudiar las neuronas de los ratones de edad adulta permite el uso de modelos de enfermedades que se manifiestan a una edad más tarde y podría ser de desarrollo más preciso para ciertos estudios. Imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas se puede utilizar para estudiar la actividad de una población de neuronas, en lugar de utilizar la electrofisiología para estudiar una sola neurona. Esto es particularmente útil cuando el estudio de una población neuronal heterogéneo en el que el tipo neuronal deseada es rara como para las neuronas hipotalámicas de glucosa de detección. Hemos utilizado el potencial de membrana de imagen de colorante de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos para estudiar sus respuestas a changes en glucosa extracelular. Neuronas detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en la regulación central del balance de energía. La capacidad para estudiar detección de glucosa en roedores adultos es particularmente útil ya que el predominio de enfermedades relacionadas con el balance de energía disfuncional (por ejemplo. La obesidad) aumentar con la edad.

La disección precisa de la VMH lejos de otras zonas del hipotálamo es importante para obtener resultados consistentes. La inclusión de otras áreas podría diluir la población neuronal VMH, cambiando el% de neuronas despolarizadas calculados. Además, las neuronas de detección de glucosa se ​​han identificado en otras regiones hipotalámicas, tales como el hipotálamo lateral, la cual puede diferir funcionalmente y mecánicamente a partir de glucosa detección de neuronas VMH. Figura 1 ilustra las ubicaciones ...

La actividad de las neuronas individuales de ratones adultos en edad puede ser estudiado por disociar las neuronas de regiones específicas del cerebro y el uso de membrana fluorescente potencial de formación de imágenes de colorante. Por respuestas de prueba a cambios en la glucosa, esta técnica se puede utilizar para estudiar la sensibilidad a la glucosa de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la detección de glucosa en neuronas hipotalámicas mediales ventrales o VMH de ratones mayores, utilizando un colorante sensible al potencial de membrana como índice de actividad neuronal. Esto se logra realizando primero la perfusión cardíaca para expulsar la sangre del cerebro de un ratón anestesiado antes de la extracción del cerebro. El segundo paso es crear cortes coronales de cerebro y diseccionar el VMH.A continuación, las neuronas VMH se disocian y se cultivan en cubreobjetos. El paso final es medir la fluorescencia de las neuronas a medida que la glucosa disminuye en presencia de colorante de potencial de membrana. En última instancia, cada cambio de neurona en fluorescencia se utiliza para cuantificar la respuesta de esa neurona inhibida por la glucosa a los cambios en la glucosa.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la electrofisiología, es la capacidad de estudiar las neuronas de un ratón adulto. Esto nos permite estudiar los estados de enfermedad en la edad adulta. Comience este procedimiento colocando el cerebro diseccionado en el mandril en la cámara Vibram con el Vibram configurado

membrane-potential-dye-imaging-ventromedial-hypothalamus-neurons-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes...

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

El video muestra una técnica para medir la absorción de glucosa en las neuronas motoras de las larvas de Drosophila utilizando un sensor de glucosa intracelular basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET). Después de diseccionar las larvas para exponer el cordón nervioso ventral, las neuronas motoras se visualizan a través de la fluorescencia emitida por el fluoróforo donante del sensor. Cuando se estimula con glucosa, el FRET entre los fluoróforos donantes y...

Evaluación de la absorción de glucosa en las neuronas motoras de larvas de Drosophila con metabolismo de glucosa regulado al alza

Fuente: Changou, C. A., et. al. Imágenes en vivo del tráfico de proteínas GLUT4 en neuronas hipotalámicas primarias de ratón utilizando microscopía de deconvolución. J. Vis. Exp. (2017). Este video muestra la imagen de la translocación de GLUT4 inducida por insulina en neuronas hipotalámicas, empleando microscopía de deconvolución para capturar y analizar la dinámica de tráfico de GFP-GLUT4 con alta resolución.

Obtención de imágenes del tráfico de proteínas GLUT4 en neuronas hipotalámicas primarias de ratón mediante microscopía de deconvolución

Se describe un método para obtener imágenes de los cambios en el potencial de membrana utilizando indicadores de voltaje codificados genéticamente.

Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

Aquí describimos un protocolo para medir y analizar las respuestas de temperatura en el bulbo olfatorio de Xenopus laevis. Las neuronas receptoras olfativas y las células mitrales se tiñen diferencialmente, después de lo cual se registran los cambios en el calcio, lo que refleja una sensibilidad de algunas redes neuronales en el bulbo a las caídas de temperatura inducidas en la nariz.

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; Xenopus laevis</em

Este protocolo describe una técnica para la observación de la fluorescencia verde en tiempo real la proteína (GFP) etiquetado proteína del transportador de glucosa 4 (GLUT4) trata sobre la estimulación de la insulina y la caracterización de la función biológica de CCR5 en la insulina, GLUT4 señalización vía con microscopía de deconvolución.

Imágenes en vivo de la proteína GLUT4 trata de ratón las neuronas hipotalámica primaria utilizando microscopía de deconvolución

La absorción de glucosa aumenta en las neuronas motoras de Drosophila afectadas por la proteinopatía de unión al ADN TAR (TDP-43), según lo indicado por un sensor de glucosa codificado genéticamente basado en FRET.

Medición de la absorción de glucosa en modelos de Drosophila de proteinopatía por TDP-43

La comunicación intestino-cerebro, facilitada por el nervio vago, es crucial para la comunicación entre el sistema endocrino gastrointestinal y el cerebro. Sin embargo, aún no se comprende si la inyección intragástrica de glucosa puede cambiar la actividad cortical. Aquí, ofrecemos un protocolo integral para observar los cambios en la actividad cortical después de la inyección de glucosa en el duodeno.

Análisis en tiempo real de la comunicación neuronal intestino-cerebro: dinámica del calcio en toda la corteza en respuesta a la estimulación intestinal de la glucosa

Múltiples tipos de células en la retina, incluidas las células endoteliales, las neuronas y las células gliales, expresan transportadores de glucosa (GLUT) para permitir la absorción de glucosa en las células. Utilizando retina neuronal de ratón ex vivo y el análogo de glucosa fluorescente 6-NBDG, describimos un método relativamente rápido y barato para medir la absorción de glucosa en toda la retina del ratón.

Medición de la absorción del análogo de glucosa, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-desoxiglucosa, en retina neural murina intacta

Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos

Aprende a evaluar el sentido de la glucosa en neuronas del hipotálamo ventromedial de ratones adultos mediante imagen de tinte sensible al potencial de membrana. Este método permite cuantificar la actividad neuronal en respuesta a cambios de glucosa.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing (Video) | JoVE Journal

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

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