Name: Métodos para el estudio de los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprende a evaluar los efectos de fármacos antipsicóticos en el desarrollo y la bombeo faríngeo de Caenorhabditis elegans mediante ensayos sincronizados. Este método permite estudiar mecanismos de acción farmacológica en nematodos.

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El trabajo fue apoyado por un premio de Desarrollo Científico Clínico de los NIH K08NS002083, un Instituto de Investigación Shervert Frazier Grant, y un premio Young Investigator NARSAD a Edgar A. Büttner.

1. Retraso en el desarrollo / letalidad Ensayo: Las dos cepas mutantes (Mut1 y Mut2) de tipo salvaje (N2) y se ponen a prueba en tres Clozapina Las concentraciones en una placa de 12 pocillos <ol><li> El día 1, vierta 2 ml NGM medio 10 en cada pocillo de una placa de 12 pocillos (cada pozo con un diámetro de 2 cm) y se deja endurecer en el banquillo a temperatura ambiente (TA) durante la noche. El mismo día, elegir una colonia de bacterias Escherichia coli OP50, infectar a una botella de 50 ml de solución de LB, y la cultura en un agitador de 37 ° C a 220 rpm de rotación durante la noche. </li><li> En el día 2, transferir 20 l de cultivo bacteriano OP50 en el centro de cada NGM bien. Incubar las placas en una incubadora a 37 ° C o dejarlos a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el césped bacteriano a crecer más grueso. </li><li> Haga una solución de clozapina de stock 80 mM disolviendo la clozapina en DMSO (dimetilsulfóxido) solvente. A continuación, hacer una solución de trabajo de 80 l con la solución madre diluida en 1,7 mM de ácido acético basándose en la Tabla 1. Nota: La solución de trabajo para un fármaco particular de interés debe ser determinada por hacer una serie de pruebas preliminares de concentración para encontrar la concentración más apropiado para distinguir el tipo salvaje de los mutantes. </li><li> Transferencia de 80 l clozapina solución de trabajo en la placa de NGM sembrado bien y agitar la placa para permitir que la solución para distribuir de manera uniforme sobre la superficie. Espere a que la placa se seque. Utilice la placa para el ensayo en el mismo día o colocarlo en una incubadora de 20 ° C para su uso al día siguiente. Nota: La solución de trabajo es una suspensión del fármaco debido a la baja solubilidad de la clozapina, especialmente a mayor concentración. Por lo tanto, vórtice el tubo antes de transferir la solución a la placa de fármaco con el fin de garantizar que la concentración de fármaco es exacta. </li><li> Lavar los gusanos de un plato de 3,5 cm que contiene muchos adultos grávidas con tampón M9 y luego girar hacia abajo en un tubo de 15 mla 2.000 rpm durante 1 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Añadir 5 ml de solución de lejía (NaOH: hipoclorito: ddH2O a 4:01:05) y desbaratar los nematodos invirtiendo suavemente los tubos. </li><li> Observar a los animales hasta la mitad de ellos se disuelven en torno al 5 min. Centrifugar los huevos a 2.000 rpm durante 1 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y añadir 14 ml de buffer M9 rápidamente. </li><li> Centrifugar los huevos a 2000 rpm durante 1 min y aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 100 l solución. Vortex para suspender los huevos. </li><li> Transferencia de 2 l huevos suspendidos en M9 en un plato regular de NGM para probar cuántos huevos se transfieren. Ajustar el volumen de los huevos en suspensión para asegurar que hay aproximadamente 30-35 huevos en cada transferencia. Transferencia 30-35 huevos a cada pocillo de la placa de ensayo, y luego incubar en una incubadora de 20 º C durante 24 h. </li><li> En el primer día del ensayo, anotar el número de huevos eclosionados. Ajuste el número total de animales que nacieron para 25/well por Pickión de los gusanos adicionales si es necesario. </li><li> En los días siguientes, observar a los animales y la puntuación de ellos cada 24 horas. El grado de desarrollo se obtuvo sobre la base del tamaño del animal y la forma de la vulva 11. El experimento dura 5-6 días con el efecto más robusto típicamente visto en la tercera o cuarta día. </li><li> Ingrese los datos en un archivo de Excel y calcular el porcentaje de animales en cada etapa de desarrollo para todos los días del experimento. Generar gráficos con la función de &#39;100% Stacked columna &#39;en &#39;2 D-columna &quot;del menú. </li></ol> 2. Faríngea Ensayo de Bombeo: animales adultos jóvenes y para los de tipo salvaje y cepas mutantes se califican en placas Clozapina ensayo <ol><li> La placa de ensayo se obtiene siguiendo el mismo protocolo utilizado para el ensayo de retardo / letalidad del desarrollo. </li><li> Elige 50 animales L4 para cada cepa a NGM placas sembradas 24 horas antes del ensayo y se incuba a los gusanos a 20 ° C. </li><li> Elige 10 animales a un ASSAy placa también. A continuación, elija 10 animales al siguiente bien cada 15-20 min. </li><li> Después de que los animales en el primer pozo han sido expuestos a drogas durante 30 min, iniciar el ensayo mediante la observación de bombeo faríngea bajo un microscopio de disección y la puntuación de las bombas durante 20 s 9. Una vez que el bombeo de la faringe se anotó, recoger el gusano de la placa. </li></ol>

<ol><li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+%28PI3K%29%2Finsulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li>
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<li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
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<li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Res%22%5BJournal%5D)">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+effects+of+clozapine%3A+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li>
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<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existe conflicto de interés involucrados.

A continuación, describimos métodos para probar los efectos de la APD sobre el desarrollo y el comportamiento de C. elegans. DMSO o etanol se usa para disolver la clozapina, ya que el fármaco es relativamente insoluble en agua. Debido a que los disolventes se han reportado para afectar C. elegans biología 12, DMSO-solas o grupos de control de etanol por sí sola, son esenciales. La concentración más alta de DMSO utilizada en nuestros ensayos es hasta 3%, que no tiene un efecto obvio sobre <em...

Caenorhabditis elegans es un organismo genético simple susceptibles de pantallas genéticos directo e inverso a gran escala y pantallas genéticos químicos. C. elegans es sensible a un amplio espectro de compuestos bioactivos y por lo tanto se ha utilizado con éxito para definir los mecanismos de acción de una variedad de tales compuestos. Por ejemplo, compuestos bioactivos estudiados usando la farmacogenética gusano incluyen agonistas del receptor de acetilcolina (por ejemplo, levamisol, nicotina, morantel, y pirantel), anestésicos (por ejemplo, halotano), cafeína, inhibidores de la colinesterasa (por ejemplo, el aldicarb, LANNATE, y triclorfón), fluoruro, el GABA-relacionados compuestos (por ejemplo, GABA y muscimol), ivermectina, paraquat, ésteres de forbol y fármacos relacionados con la serotonina (por ejemplo, la serotonina y imiprimine) 3. Además, C. elegans se ha utilizado para pantallas de molécula pequeña a gran escala, lo que permite el descubrimiento de nueva compuesto bioactivos y la identificación de dianas genéticas nuevas 4. El C. elegans genoma incluye fármaco potencial antipsicótico (APD) objetivos conservadas en los seres humanos, incluidos los genes que codifican las proteínas necesarias para la síntesis de neurotransmisores y de la estructura y función sináptica 5. Por lo tanto, C elegans neurogenetics y métodos ofrecen la neurobiología para descubrir nuevos mecanismos moleculares de la acción de la APD. En los nematodos, la exposición APD en el desarrollo temprano produce retraso en el desarrollo, y en concentraciones más altas, la letalidad de 2,6. Exposición APD durante la edad adulta produce fenotipos conductuales. Por ejemplo, la exposición a la clozapina inhibe la locomoción y el bombeo faríngeo y mejora la postura de huevos 1,2,7. Retraso en el desarrollo inducido por APD y letalidad son los fenotipos de gran alcance para las pantallas de genética química a gran escala. Estos fenotipos son complejos en la medida en que es probable que tengan más de un basi celulares y genéticoss. Por lo tanto, se espera que tales pantallas genéticas para producir una variedad de dianas de medicamentos indirectos. Sin embargo, nuestro laboratorio ha realizado candidatos pantallas de genes y una pantalla de RNAi de todo el genoma de los supresores de retraso en el desarrollo inducido por APD y la letalidad y ha genes que probablemente codifican blancos directos, incluyendo la dopamina, la insulina y los receptores nicotínicos de la acetilcolina 2,8 recuperado con éxito. Pantallas genéticas basadas en los comportamientos inducidos por el APD en el adulto también han conducido a la identificación de los objetivos de APD novedosas, y ahora estamos validando dianas de las pantallas tanto de desarrollo y de comportamiento en los mamíferos 7. Por lo tanto, un enfoque genético químico de invertebrados para descubrir nuevos mecanismos moleculares de acción de APD parece ser factible 5,8. El C. elegans faringe es un órgano que incluye 20 neuronas, las células musculares 20, y 20 células accesorias, envueltos por una membrana basal. Similar al corazón de los mamíferos, la faringe es un autónomaND constantemente Bombas de alimentación desde el medio ambiente externo 9. La inhibición de la velocidad de bombeo de la faringe compromete la absorción de los alimentos, y por lo tanto las mutaciones o medicamentos que inhiben la faringe de bombeo causa retraso en el desarrollo o la detención 9. APD inhiben la velocidad de bombeo de la faringe, lo que representa, en parte, por sus efectos sobre el desarrollo y viabilidad 1,2. Aquí, nosotros usamos la clozapina APD atípica como ejemplo para demostrar los ensayos de medicamentos para el desarrollo del nematodo y el bombeo de la faringe.

<table><tbody><tr><td>Clozapina</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético (HAC)</td><td>Fisher</td><td>BP2401</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>EMD</td><td>SX0590-13</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de incubadora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1246-0006</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de baja temperatura 815</td><td>Precision Scientific</td><td>J1790-1B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 35 x 10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9434271</td><td></td></tr><tr><td>12 pocillos Placa de cultivo de tejidos</td><td>BD Falcon</td><td>REF 353043</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para el estudio de los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos en<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans es un organismo genético simple susceptible a gran escala de avance y retroceso genéticos pantallas y pantallas genéticos químicos. El C. elegans genoma incluye fármaco potencial antipsicótico (APD) objetivos conservadas en los seres humanos, incluidos los genes que codifican las proteínas necesarias para la síntesis de neurotransmisores y de la estructura y la función sináptica. Exposición APD produce una demora y / o mortalidad en los nematodos en el desarrollo de una manera dependiente de la concentración. Estos fenotipos son causados, en parte, por la inhibición inducida por APD de faríngea de bombeo 1,2. Por lo tanto, el fenotipo de desarrollo tiene una base neuromuscular, lo que es útil para estudios de farmacogenética de los neurolépticos. Aquí demostramos procedimientos detallados para probar los efectos de APD sobre el desarrollo del nematodo y el bombeo de la faringe. Para el ensayo de desarrollo, los embriones sincronizados se colocan en medio de crecimiento de nematodos (NGM) placas que contienen APD, y las etapas de desarrollo de Animales son entonces marcados diaria. Para el ensayo de velocidad de bombeo de la faringe, protagonizaron los animales adultos jóvenes se ponen a prueba en placas NGM contienen APD. El número de bombas faríngeas por unidad de tiempo se registra, y se calcula la tasa de bombeo. Estos ensayos se pueden usar para el estudio de muchos otros tipos de moléculas pequeñas o incluso moléculas grandes.

1. El retraso del desarrollo / resultado del ensayo de letalidad Un resultado típico para el ensayo de retardo / letalidad del desarrollo se demuestra en las Figuras 1a y 1b. Cuando los animales de tipo salvaje en el grupo de control se han convertido en la etapa adulta grávida (Figura 1a), de tipo salvaje animales expuestos a la clozapina se encuentran todavía en las etapas jóvenes larvas o están muertos (Figura 1b). Figura 1c...

Enfoques para probar los efectos de los fármacos antipsicóticos (APD) en Caenorhabditis elegans se demuestran. Los ensayos se describen para las pruebas de efectos del fármaco sobre el desarrollo y la viabilidad y sobre la tasa de bombeo de la faringe. Estos métodos se aplican también para los experimentos farmacogenéticos con clases de fármacos diferentes a APD.

Métodos para el estudio de los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar los efectos de los fármacos antipsicóticos en el desarrollo y el bombeo faríngeo del elgan marino. Esto se logra cultivando primero una población de nematodos adultos y, a partir de ellos, generando una población sincronizada de animales. El siguiente paso es transferir óvulos sincronizados o adultos a placas de ensayo mezcladas con fármacos.El paso final es observar y puntuar los efectos de los medicamentos en los gusanos. En última instancia, los resultados pueden mostrar que los fármacos antipsicóticos retrasan el desarrollo e inhiben el bombeo faríngeo en animales expuestos al fármaco. Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos, también se puede aplicar para estudiar otras moléculas pequeñas e incluso moléculas grandes como los lípidos.Comience cargando una placa de 12 pocillos con dos mililitros de NGM, medio por pocillo. Deje la placa a un lado para que se endurezca a temperatura ambiente. A continuación, elija una colonia de bacterias OP 50 y transfiérala a una botella de 50 mililitros de cultivo LB.Las bacterias durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 220 RPM al día siguiente en cada pocillo del plato preparado. A 20 microlitros del cultivo bacteriano, configure la placa para incubar durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente. Cargue cada pozo asentado con 80 microlitros de fármaco de interés a la concentración de trabajo.En este caso, el medicamento es C Clozapina. Asegúrese de vórtice la solución antes de tomar alícuotas. Agite la solución para distribuirla uniformemente en el pocillo y deje que se absorba a temperatura ambiente sin la tapa de la placa.A continuación, proceda con el ensayo o almacene la placa a 20 grados centígrados durante la noche y comience el ensayo al día siguiente. Comience recolectando huevos del genotipo de interés. Comience con una población de gusanos con muchos adultos GR.Lave las lombrices en un plato de 3,5 centímetros con tampón M nine. Luego gírelos en un tubo de 15 mililitros a 2000 RPM durante un minuto. Retire el sobrenadante por aspiración y reemplácelo con cinco mililitros de lejía.A continuación, interrumpa suavemente a los adultos invirtiendo el tubo y espere a que los animales empiecen a disolverse continuamente. Observe los gusanos que se disuelven debajo del visor. Cuando aproximadamente la mitad de los gusanos se hayan disuelto.Después de unos cinco minutos, gire el tubo para recoger los huevos, aspire el sobrenadante y reemplácelo rápidamente con tampón M nine. A continuación, vuelva a girar el tubo hacia abajo como antes y retire todos los microlitros del sobrenadante M nine, excepto unos 100. Para suspender los huevos, vórtice el tubo.Luego transfiera dos microlitros de la suspensión a una placa NGM y cuente el número de huevos transferidos. A continuación, cargue la placa tratada con fármaco de 30 a 35 huevos por pocillo e incube la placa a 20 grados centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, marque el número de huevos eclosionados.Si hay más de 25 lombrices en alguno, retire el exceso de gusanos. Regrese los gusanos en el plato a la incubadora para su posterior observación a intervalos de 24 horas cada día, califique la etapa de desarrollo de los gusanos en los pocillos según el tamaño de los gusanos y la forma de sus vulvas. Por lo general, se observan efectos fuertes en el tercer y cuarto día.El experimento debería durar alrededor de una semana. Para este protocolo, se deben preparar placas de prueba de drogas como se describió anteriormente el día anterior, iniciando el ensayo. Elija 50 L animales de cuatro etapas para cada genotipo en el experimento.Transfiéralos a placas NGM e incube las placas durante 24 horas a 20 grados centígrados. Al día siguiente, cada 15 a 20 minutos, cargue un pozo de prueba con 10 animales después de que un grupo haya estado expuesto al medicamento durante media hora. Comienza a observar su bombeo faríngeo bajo un microscopio de disección.Primero, encuentra un gusano, luego cuenta sus bombas faríngeas durante 20 segundos. Una vez anotado, retira el gusano del plato. Marque todos los gusanos en el pozo de la misma manera.Los resultados esperados de la realización del retraso experimental. El ensayo de letalidad con controles de tipo salvaje debe mostrar que, a diferencia de la tasa de crecimiento típica hasta la etapa adulta de tumba, los animales expuestos a la clozapina c todavía se encuentran en las etapas larvales jóvenes o están muertos. Las pruebas de mutantes en diferentes concentraciones de clozapina revelaron mutantes supresores como el mute uno y mutantes potenciadores como el MU dos. Universalmente, la letalidad del mute uno fue menor que la del tipo salvaje, y la letalidad del MU dos fue mayor de lo esperado en comparación con los animales del mute uno supervivientes del control que son más capaces de desarrollarse, mientras que los supervivientes del mute dos son más retrasados.Un examen más detallado reveló que la exposición a clozapina redujo las tasas de bombeo faríngeo de una manera dependiente de la concentración. Sin embargo, la tasa disminuida del mute uno fue menor que la del tipo salvaje, mientras que la tasa disminuida del mudo dos fue mayor que la del tipo salvaje. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de medicamentos antipsicóticos a pequeña escala.El mensaje también se puede ampliar para llevar a cabo un cribado genético a gran escala.

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