Métodos para el estudio de los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos en
4 de febrero de 2014
Enfoques para probar los efectos de los fármacos antipsicóticos (APD) en Caenorhabditis elegans se demuestran. Los ensayos se describen para las pruebas de efectos del fármaco sobre el desarrollo y la viabilidad y sobre la tasa de bombeo de la faringe. Estos métodos se aplican también para los experimentos farmacogenéticos con clases de fármacos diferentes a APD.
El objetivo general de este procedimiento es examinar los efectos de los fármacos antipsicóticos en el desarrollo y el bombeo faríngeo del elgan marino. Esto se logra cultivando primero una población de nematodos adultos y, a partir de ellos, generando una población sincronizada de animales. El siguiente paso es transferir óvulos sincronizados o adultos a placas de ensayo mezcladas con fármacos.
El paso final es observar y puntuar los efectos de los medicamentos en los gusanos. En última instancia, los resultados pueden mostrar que los fármacos antipsicóticos retrasan el desarrollo e inhiben el bombeo faríngeo en animales expuestos al fármaco. Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos, también se puede aplicar para estudiar otras moléculas pequeñas e incluso moléculas grandes como los lípidos.
Comience cargando una placa de 12 pocillos con dos mililitros de NGM, medio por pocillo. Deje la placa a un lado para que se endurezca a temperatura ambiente. A continuación, elija una colonia de bacterias OP 50 y transfiérala a una botella de 50 mililitros de cultivo LB.
Las bacterias durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 220 RPM al día siguiente en cada pocillo del plato preparado. A 20 microlitros del cultivo bacteriano, configure la placa para incubar durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente. Cargue cada pozo asentado con 80 microlitros de fármaco de interés a la concentración de trabajo.
En este caso, el medicamento es C Clozapina. Asegúrese de vórtice la solución antes de tomar alícuotas. Agite la solución para distribuirla uniformemente en el pocillo y deje que se absorba a temperatura ambiente sin la tapa de la placa.
A continuación, proceda con el ensayo o almacene la placa a 20 grados centígrados durante la noche y comience el ensayo al día siguiente. Comience recolectando huevos del genotipo de interés. Comience con una población de gusanos con muchos adultos GR.
Lave las lombrices en un plato de 3,5 centímetros con tampón M nine. Luego gírelos en un tubo de 15 mililitros a 2000 RPM durante un minuto. Retire el sobrenadante por aspiración y reemplácelo con cinco mililitros de lejía.
A continuación, interrumpa suavemente a los adultos invirtiendo el tubo y espere a que los animales empiecen a disolverse continuamente. Observe los gusanos que se disuelven debajo del visor. Cuando aproximadamente la mitad de los gusanos se hayan disuelto.
Después de unos cinco minutos, gire el tubo para recoger los huevos, aspire el sobrenadante y reemplácelo rápidamente con tampón M nine. A continuación, vuelva a girar el tubo hacia abajo como antes y retire todos los microlitros del sobrenadante M nine, excepto unos 100. Para suspender los huevos, vórtice el tubo.
Luego transfiera dos microlitros de la suspensión a una placa NGM y cuente el número de huevos transferidos. A continuación, cargue la placa tratada con fármaco de 30 a 35 huevos por pocillo e incube la placa a 20 grados centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, marque el número de huevos eclosionados.
Si hay más de 25 lombrices en alguno, retire el exceso de gusanos. Regrese los gusanos en el plato a la incubadora para su posterior observación a intervalos de 24 horas cada día, califique la etapa de desarrollo de los gusanos en los pocillos según el tamaño de los gusanos y la forma de sus vulvas. Por lo general, se observan efectos fuertes en el tercer y cuarto día.
El experimento debería durar alrededor de una semana. Para este protocolo, se deben preparar placas de prueba de drogas como se describió anteriormente el día anterior, iniciando el ensayo. Elija 50 L animales de cuatro etapas para cada genotipo en el experimento.
Transfiéralos a placas NGM e incube las placas durante 24 horas a 20 grados centígrados. Al día siguiente, cada 15 a 20 minutos, cargue un pozo de prueba con 10 animales después de que un grupo haya estado expuesto al medicamento durante media hora. Comienza a observar su bombeo faríngeo bajo un microscopio de disección.
Primero, encuentra un gusano, luego cuenta sus bombas faríngeas durante 20 segundos. Una vez anotado, retira el gusano del plato. Marque todos los gusanos en el pozo de la misma manera.
Los resultados esperados de la realización del retraso experimental. El ensayo de letalidad con controles de tipo salvaje debe mostrar que, a diferencia de la tasa de crecimiento típica hasta la etapa adulta de tumba, los animales expuestos a la clozapina c todavía se encuentran en las etapas larvales jóvenes o están muertos. Las pruebas de mutantes en diferentes concentraciones de clozapina revelaron mutantes supresores como el mute uno y mutantes potenciadores como el MU dos. Universalmente, la letalidad del mute uno fue menor que la del tipo salvaje, y la letalidad del MU dos fue mayor de lo esperado en comparación con los animales del mute uno supervivientes del control que son más capaces de desarrollarse, mientras que los supervivientes del mute dos son más retrasados.
Un examen más detallado reveló que la exposición a clozapina redujo las tasas de bombeo faríngeo de una manera dependiente de la concentración. Sin embargo, la tasa disminuida del mute uno fue menor que la del tipo salvaje, mientras que la tasa disminuida del mudo dos fue mayor que la del tipo salvaje. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de medicamentos antipsicóticos a pequeña escala.
El mensaje también se puede ampliar para llevar a cabo un cribado genético a gran escala.
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Descripción general
Este artículo demuestra enfoques para evaluar los efectos de fármacos antipsicóticos (APDs) en Caenorhabditis elegans. Los métodos incluyen ensayos para evaluar los efectos de los fármacos sobre el desarrollo, la viabilidad y la tasa de bombeo faríngeo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Farmacología
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Caenorhabditis elegans es un organismo modelo utilizado para estudiar los efectos de fármacos.
- Los fármacos antipsicóticos pueden influir en los procesos de desarrollo.
- La bomba faríngea es un comportamiento crítico para evaluar el impacto de los fármacos.
- Se pueden realizar experimentos farmacogenéticos utilizando estos métodos.
Objetivo del estudio
- Examinar los efectos de los fármacos antipsicóticos en el desarrollo de nematodos.
- Evaluar el impacto de estos fármacos en las tasas de bombeo faríngeo.
- Proporcionar información sobre los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos (APDs).
Métodos Utilizados
- Criar una población de Caenorhabditis elegans adultos.
- Generar una población sincronizada a partir de nematodos adultos.
- Transferir huevos sincronizados o adultos a placas de ensayo con fármacos.
- Observar y evaluar los efectos de los fármacos sobre el desarrollo y el comportamiento.
Resultados principales
- Los fármacos antipsicóticos retrasan el desarrollo en nematodos expuestos.
- La bombeo faríngeo se inhibe en animales tratados con fármacos.
- Los resultados pueden contribuir a la comprensión de los mecanismos de acción de los fármacos.
- Los métodos son aplicables a otras moléculas pequeñas y grandes.
Conclusiones
- El estudio proporciona un marco para evaluar los efectos de fármacos en C. elegans.
- Los conocimientos obtenidos pueden extenderse a diversos estudios farmacológicos.
- Estos métodos pueden adaptarse para aplicaciones más amplias más allá de los fármacos antipsicóticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los estudios sobre el mecanismo de acción de fármacos antipsicóticos en C. elegans permiten una desestimación temprana de objetivos al vincular resultados fenotípicos con vías neuromoleculares. Los ensayos de desarrollo y bombeo faríngeo proporcionan lecturas cuantitativas y escalables para la investigación del mecanismo de acción en biología del descubrimiento. Esto respalda una confianza predictiva en la validación de objetivos y la clasificación de carteras para indicaciones neuropsiquiátricas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Cuestionar hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la exposición a antipsicóticos con retrasos en el desarrollo y fenotipos de inhibición faríngea.
- Valor operativo: Permitir la validación funcional de dianas mediante análisis genéticos de supresores y potenciadores que identifiquen modificadores de la respuesta al fármaco.
- Valor predictivo: Apoyar la reducción mecanicista de riesgos al revelar efectos dependientes de la concentración sobre salidas neuromusculares conservadas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Preparar sistemas biológicos validados para ensayos posteriores mediante protocolos de trabajo sincronizados de embriones y adultos en etapas definidas.
- Valor operativo: Abordar la estandarización de ensayos mediante puntuaciones diarias del desarrollo y protocolos de conteo del bombeo faríngeo en 20 segundos.
- Valor de escalabilidad: Destacar la preparación para cribados y la reutilización de la plataforma para probar moléculas pequeñas y grandes más allá de los antipsicóticos.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor Translacional: Discutir la relevancia de la enfermedad mediante genes conservados en la síntesis de neurotransmisores y la función sináptica en el genoma de C. elegans.
- Continuidad Preclínica: Describir la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación fenotípica en un sistema de organismo completo relevante para la enfermedad.
- Avance Ajustado al Riesgo: Abordar decisiones basadas en mecanismos de avance o no-avance utilizando la letalidad del desarrollo y la supresión de la tasa de bombeo como biomarcadores de eficacia.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método sitúa los estudios sobre el mecanismo de los antipsicóticos en las primeras etapas del descubrimiento hasta la identificación de compuestos líderes, apoyando la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en neurofarmacología.
- Biología del Descubrimiento: Explique cómo el método apoya la prueba de hipótesis mediante la determinación de etapas del desarrollo y la cuantificación del bombeo faríngeo.
- Selección: Describa la preparación del ensayo mediante la transferencia sincronizada de huevos a placas con fármacos y la puntuación fenotípica diaria.
- Análisis: Destaque los resultados cuantitativos, incluida la puntuación por etapas de desarrollo y el número de bombeos faríngeos por unidad de tiempo, para comparaciones entre condiciones.
- Investigación Traducional: Relacione el método con la continuidad preclínica a través de fenotipos neuromusculares conservados que predicen el mecanismo del fármaco.
- Reutilización Empresarial: Presente el método como una capacidad reutilizable para estudios del mecanismo de acción en diversas áreas terapéuticas mediante análisis genéticos y químicos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la vinculación fenotípica de los efectos antipsicóticos a la función neuromuscular.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante poblaciones sincronizadas e intervalos de puntuación definidos para el desarrollo y el comportamiento.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción al reducir la ambigüedad mecanicista en la selección temprana de antipsicóticos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante el uso de retraso del desarrollo e inhibición faríngea como puntos finales biomarcadores traducibles.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en cultivo de nematodos, sincronización y evaluación fenotípica mediante microscopía de disección.
- Los equipos necesarios incluyen incubadoras, microscopios y sistemas de dispensación de fármacos para ensayos en placas de 12 pocillos.
- La estandarización entre equipos requiere protocolos compartidos para la preparación de huevos, la siembra de fármacos y los criterios de clasificación del estadio de desarrollo.
- Las consideraciones para la adaptación entre sistemas modelo implican la conservación de los blancos de neurotransmisores y la escalabilidad de los ensayos hacia formatos de mayor rendimiento.
- Las limitaciones prácticas incluyen una duración del ensayo de aproximadamente una semana y la sensibilidad a la calidad del césped bacteriano, que afecta la salud de los gusanos.
