Análisis sistemático de In Vitro Celda balanceo Utilizando un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos

El objetivo general del siguiente experimento es realizar estudios de laminación de células con un mayor rendimiento bajo un flujo de cizallamiento estrictamente controlado y fisiológicamente relevante. Esto se logra utilizando un sistema microfluídico de pozos múltiples en el que los pozos adyacentes en una placa especializada están conectados a través de un canal microfluídico. La interfaz del sistema conecta una bomba electroneumática a la parte superior de la placa de pocillos múltiples y aplica una presión neumática que impulsa el fluido desde el interior de los pozos a través de los canales microfluídicos a un caudal definido.

Una vez que el canal microfluídico está recubierto con el sustrato deseado o la monocapa de celda, las células de interés se introducen en el canal microfluídico para explorar sus interacciones de laminación específicas con la superficie recubierta, las propiedades de laminación de las celdas a medida que interactúan con el sustrato o la superficie recubierta de monocapa en diferentes condiciones experimentales se pueden analizar con el software adecuado. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la cámara de flujo de placas paralelas, es que esta técnica permite el estudio de las propiedades de laminación de plata con un rendimiento significativamente mayor bajo un flujo de tubo fisiológicamente relevante y controlado con precisión, al tiempo que minimiza el consumo de reactivos y celdas. Esta plataforma puede ayudar a avanzar en las terapias exógenas basadas en células al permitir el análisis rápido y preciso de los enfoques de ingeniería diseñados para impactar en el laminado y la localización de células.

Para recubrir un canal microfluídico con un sustrato de proteína, primero agregue de 25 a 50 microlitros de la solución de proteína recién preparada en la entrada. Pues bien, entonces aplique una fuerza pura de dos centavos por centímetro cuadrado durante cinco minutos para perfundir la solución en el canal. Cuando una gota de líquido se hace visible en la salida, detenga el flujo, incube la placa durante el tiempo adecuado con la proteína de interés y luego aspire la solución de cada una. Pozo.

A continuación, agregue de 200 a 500 microlitros de PBS en el pozo de salida y luego aplique un flujo puro de dos dines por centímetro cuadrado durante cinco minutos para lavar el canal y crear una monocapa celular dentro del canal microfluídico. Comience por tripsina suavemente las células de interés de su placa de cultivo durante tres minutos, detenga la reacción con un volumen doble de medio completo y luego centrifugue las células durante cinco minutos a 400 Gs y rt. A continuación, lave el pellet en 10 mililitros de medio completo.

A continuación, vuelva a suspender las células en un mililitro de medio completo fresco y cuéntelas, ajuste la solución celular a la concentración adecuada y, a continuación, coloque de 25 a 50 microlitros de la suspensión celular en cada entrada. Bueno, ahora coloque la placa en la platina del microscopio y aplique un flujo puro de dos monedas por centímetro cuadrado para que las células fluyan hacia el canal hasta que se observe que las células están llenando todo el canal. Después de detener el flujo, llene los pozos de salida y del interior con 200 microlitros del medio celular apropiado, y luego deje que las células se asienten y se adhieran a 37 grados Celsius en 5% de CO2.

Después de tres horas, lave el canal con medios completos para eliminar las células no adheridas. Las células ahora deberían estar completamente confluentes y listas para su uso para inducir la activación inflamatoria de las células endoteliales en los canales. Agregue 100 microlitros de solución de TNF alfa recién preparada al pozo de entrada y luego introduzca la solución en el canal aplicando un flujo puro de dos dines por centímetro cuadrado durante cinco minutos.

Para el control de los canales de células endoteliales no activadas, agregue 100 microlitros de medio basal de células endoteliales a la entrada. Pues bien, para bloquear la selectina P o E en la superficie de las células endoteliales, se introducen cinco microgramos por mililitro del anticuerpo neutralizante adecuado en el canal y se incuba la placa durante una hora a 37 grados centígrados. A continuación, lave los canales con medios basales antes de comenzar el ensayo de laminación.

Examine cuidadosamente los canales bajo un microscopio para confirmar que los canales estén correctamente recubiertos. A continuación, lave la suspensión de células HL 60 con medios basales dos veces después del segundo recuento de lavados y, a continuación, vuelva a suspender las células en IMDM a una concentración de cinco veces 10 a la sexta célula por mililitro. Después de agregar de 25 a 50 microlitros de la suspensión de celdas en la salida, coloque la placa en el soporte de placa con control de temperatura de 37 grados Celsius y coloque el soporte de placa en la platina del microscopio.

Introducir las células en el canal microfluídico. Deben observarse dentro de los 10 a 15 segundos que fluyen desde la salida hasta la entrada. Aquí, se pueden observar las células HL 60 marcadas con fluorescencia, que interactúan con la superficie codificada P select, mostrando una respuesta de rodadura para examinar la respuesta de rodadura en función del esfuerzo de cizallamiento, reducir el cizallamiento a 0,25 dines por centímetro cuadrado y adquirir de 20 a 32 videos utilizando la función de adquisición de flujo en cada cizallamiento deseado, y aumentando gradualmente el cizallamiento desde 0,25 hasta cinco centavos por centímetro cuadrado.

Por último, utilice una cámara CCD para adquirir vídeo del ensayo con una adquisición de flujo de 11 fotogramas por segundo. Por ejemplo, aquí se muestra una célula HL 60 rodando sobre una monocapa de células chope. Analice las trayectorias y velocidades de rodadura con el software compatible adecuado.

celdas HL 60 se consideran rodillos estándar de oro, ya que expresan una variedad de ligandos homing, incluidos los ligandos rodantes, P select y ligando de glicoproteína uno y CI Lewis X.To probar las capacidades del sistema microfluídico de placas de pocillos múltiples, numerosos canales microfluídicos se recubrieron simultáneamente con diferentes sustratos y las interacciones de laminación de las celdas HL 60. Con esos sustratos analizados, las celdas exhibieron un comportamiento de balanceo robusto en la superficie codificada con P select con las celdas primero capturadas del flujo, seguidas de un movimiento de balanceo distinto. Como se ilustra en este gráfico y de acuerdo con la literatura, las celdas HL 60 exhiben un comportamiento de rodadura similar en superficies de selectina e y p, pero no en sustratos recubiertos con FiberInc.

La velocidad de la célula, analizada a través de un software compatible, se trazó contra la tensión pura, mostrando una respuesta de rodadura robusta de las células en la selectina p y e, con una velocidad media entre una y 12 micras por segundo. Para evaluar la viabilidad de este sistema microfluídico en la prueba eficiente de las interacciones entre las células de interés y una monocapa celular que recubre la superficie, se utilizaron células CHO P, que se transfectaron para expresar de manera estable P, pero no e selectina, como se muestra aquí. Las células HL 60 muestran una respuesta de rodadura significativa en una monocapa de células CHO P para probar si el movimiento de rodadura de HL 60 está realmente mediado por la pectina.

La monocapa se preincubó con anticuerpos bloqueantes para la selectina P o E antes de la profusión de células HL 60 en el canal. Como se muestra en este gráfico, el bloqueo de la monocapa de CHO p con un anticuerpo P selectina resultó en una disminución significativa en el número de células HL 60 que ruedan por la superficie, lo que demuestra que P selecciona y, de hecho, media el rodaje de HL 60. Como se describió anteriormente, la placa microfluídica de pocillos múltiples consta de numerosos canales microfluídicos separados, lo que permite pruebas de mayor rendimiento de múltiples condiciones diferentes.

Este diseño ventajoso se utilizó para colocar células endoteliales dentro de los canales microfluídicos para un análisis rápido de las interacciones entre las células HL 60 y las células endoteliales en una variedad de condiciones experimentales para simular condiciones inflamatorias, las células endoteliales se trataron previamente con la citocina proinflamatoria TNF alfa, lo que resultó en una regulación positiva de E, pero no de P selectina en la superficie de la célula endotelial. Curiosamente, las células HL 60 no interactuaron con las células endoteliales inactivadas, y no se observó que las células rodaran sobre esta superficie. Por el contrario, las células HL 60 mostraron un comportamiento de balanceo robusto en las células endoteliales activadas con TNF alfa con una velocidad promedio de cinco a 15 micras por segundo para explorar la participación de la selectina p o E en las interacciones de balanceo entre las células HL 60 y las células endoteliales activadas.

Las células endoteliales activadas por TNF alfa se preincubaron con selección P o E en anticuerpos bloqueantes, y se analizó el rodamiento de las células HL 60 como se ilustra en el gráfico El bloqueo seleccionado en las células endoteliales alfa del TNF dio lugar a una disminución significativa en el número de células rodantes en la monocapa endotelial activada. Por el contrario, el uso de un control de isótopos o un anticuerpo contra la pectina, que no se expresa en las células endoteliales activadas, no tuvo un efecto significativo sobre el rodaje de HL 60 en la capa endotelial activada. Estos datos demuestran la implicación directa de la selectina S en el rodaje de HL 60 en células endoteliales activadas por TNF alfa, lo que concuerda con informes anteriores.

El software de análisis permite el seguimiento de las trayectorias de las células individuales a medida que interactúan con la superficie. Por lo tanto, se rastrearon específicamente las trayectorias de las células individuales a medida que interactuaban con las células endoteliales activadas por TNF alfa con o sin selección e y bloqueo de anticuerpos. Como se ilustra en esta figura, el número de células rodantes en las células endoteliales activadas no bloqueadas fue significativamente mayor que en las células endoteliales activadas elegidas y bloqueadas. Además, parecía que el movimiento de rodadura de las células HL 60 sobre las células endoteliales no bloqueadas era continuo y robusto, mientras que las trayectorias de rodadura de las células sobre las células endoteliales elegidas y bloqueadas estaban fragmentadas.

De acuerdo con este hallazgo, la velocidad de rodadura de las células HL 60 en las células endoteliales activadas por TNF alfa no bloqueadas fue significativamente menor que la velocidad de rodadura en las células endoteliales seleccionadas y bloqueadas. Este estudio demuestra el uso de un sistema microfluídico múltiple para realizar de manera eficiente experimentos de laminación de celdas con un mayor rendimiento de hasta 10 gases de laminación por hora bajo un flujo de tubo estrictamente controlado. En general, este sistema microfluídico surge como una poderosa técnica para estudiar el laminamiento celular, un aspecto clave de la excavación celular.

Por ejemplo, nuestro laboratorio está utilizando actualmente este sistema para detectar condiciones que mejoren la localización de células madre mesenquimales como estrategia para mejorar su impacto terapéutico.