Name: Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprende a generar rápidamente fibrillas de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro mediante calor y reticulación con EDC. Este método permite estudiar los mecanismos del plegamiento incorrecto de proteínas.

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Este trabajo está respaldado por subvenciones a W.C. de los Institutos Nacionales de Salud AI074809 y el Programa de Becas de Investigación Institucional del Centro Oncológico M. D. Anderson de la Universidad de Texas.

1. Preparar el búfer MES
<ol>
	<li>Utilice tampón MES (ácido 0,1 M, 2-(N-morfolino)etanosulfónico y NaCl 0,9 M) para preparar amiloide solo proteína, así como oligómeros de proteínas solubles estabilizadas. Pesa 1,95 g de MES y 5,27 g de NaCl. Agregue H2O y ajuste el pH a 4.7. Completar el volumen final hasta 100 ml. Almacenar a 4º C hasta por 6 meses.</li>
</ol>
2. Prepare amiloide solo para proteínas directamente a partir de proteínas nativas
<ol>
	<li>Pesar la proteína de elección (cualquier proteína o péptido nativo) y reconstituir a 10 mg/ml en tampón MES.</li>
	<li>Incubar a 65 ºC en baño maría durante 4 h. Al final del período, el precipitado blanco es visible en solución.</li>
	<li>Neutralizar la muestra con 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
	<li>Diálisis la proteína en un casete de diálisis durante la noche para intercambiarla al tampón deseado para su posterior análisis.</li>
	<li>Se puede preparar una muestra de control de proteína nativa siguiendo los pasos 2.1, 2.3 y 2.4 sin precipitación de calor (paso 2.2).</li>
</ol>
3. Prepare amiloide híbrido a partir de oligómeros solubles estabilizados de proteínas nativas
<ol>
	<li>Preparación de oligómeros de proteínas solubles estabilizadas
	<ol>
		<li>Pesar la proteína de elección y reconstituirla a 10 mg/ml en tampón MES. Dejar a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
		<li>Pesar el clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y preparar un caldo fresco de 20 mg/ml en tampón MES.</li>
		<li>Mezcle las soluciones de proteínas y EDC en una proporción de 2:5 (v/v), es decir, 2 mg de proteína por cada 10 mg de EDC.</li>
		<li>Incubar a temperatura ambiente durante 2 horas.</li>
		<li>Neutralizar la muestra con 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
		<li>Diálisis la proteína en un casete de diálisis durante la noche para intercambiarla al tampón deseado para su posterior análisis.</li>
		<li>Almacenar el oligómero de proteína soluble estabilizada a 4 ºC hasta 4 semanas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare amiloides híbridos a partir de oligómero de proteínas solubles estabilizadas.
	<ol>
		<li>Para preparar amiloide que contenga ADN, mezcle el ADN y el oligómero de proteína soluble estabilizada en una proporción de 1:1 (p/p). Dejar a 4 ºC durante al menos 2 hr. Durante este período, el precipitado insoluble es visible en solución cuando la concentración inicial de proteína es de 0,5 mg/ml o superior.</li>
		<li>Para preparar amiloide que contenga ARN, mezcle ARN y oligómero de proteína soluble estabilizada en una proporción de 1:1 (p/p). Dejar a 4 ºC durante al menos 2 hr. Durante este período, el precipitado insoluble es visible en solución cuando la concentración inicial de proteína es de 0,5 mg/ml o superior.</li>
		<li>Para preparar amiloide que contenga heparina, mezcle heparina y oligómero de proteína soluble estabilizada en una proporción de 1:1 (p/p). Dejar a 4 ºC durante al menos 2 hrs. Durante este período, el precipitado insoluble es visible en solución cuando la concentración inicial de proteína es de 0,5 mg/ml o superior.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
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<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
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<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

El método descrito aquí ofrece un medio rápido y flexible para preparar fibrillas amiloides in vitro a partir de prácticamente cualquier proteína o péptido de elección. Se pueden preparar de manera confiable varios tipos diferentes de amiloide: fibrillas solo de proteínas o agregados híbridos que contienen ADN, ARN o glicosaminoglicanos. Los procedimientos involucrados son simples, directos y no requieren capacitación técnica avanzada. El amiloide preparado por este método es bastante estable y puede almacenarse...

Las proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes presentes en todo tipo de células. Se presentan en una gran variedad de tamaños, estructuras y modificaciones postraduccionales, y cumplen una enorme gama de funciones biológicas importantes cuando se encuentran en sus formas nativas. Más de dos docenas de polipéptidos aberrantes han sido implicados en numerosas condiciones patológicas humanas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la diabetes tipo2 1-4. Las proteínas terminales mal plegadas se acumulan como fibrillas de amiloide, los agregados estables insolubles que se producen extracelular o intracelularmente.
A pesar de la implicación de proteínas específicas en ciertas enfermedades, cada vez hay más pruebas que apoyan la idea de que todos los polipéptidos tienen propiedades intrínsecas que permiten la transformación del amiloide. Un estudio de la secuencia de todo el genoma identificó el "amiloma", por el cual los fragmentos propensos a la amiloide constituyen aproximadamente el 15% de todos los segmentos de péptidos codificantes de E. coli a los humanos5. En consecuencia, en los últimos años se ha descubierto un número cada vez mayor de amiloides funcionales, que participan en varios procesos celulares importantes. Por ejemplo, las bacterias ensamblan amiloides para formar biopelículas y estructuras de esporas que son críticas para su supervivencia y patogénesis6-9. Las hormonas peptídicas forman depósitos de amiloide durante el almacenamiento dentro de los gránulos secretores de mamíferos antes de ser liberadas, lo que implica además que la forma de la proteína amiloide puede cumplir funciones biológicas beneficiosas6,10,11. Además, las proteínas también pueden ensamblarse en fibrillas amiloides para transmitir señales celulares críticas12,13.
Durante muchos años, los amiloides más estudiados se preparan a partir de péptidos individuales que están asociados con enfermedades humanas, como el beta amiloide o el péptido priónico. Estos péptidos suelen carecer de una estructura bien definida y forman espontáneamente amiloide en solución con el tiempo, un proceso mediado por un intermediario parcialmente mal plegado que sirve como precursor del amiloide insoluble. El precursor del amiloide también se llama oligómero de proteína soluble, que es raro e inestable cuando se genera a partir de péptidos naturales14,15. Sin embargo, como se describió anteriormente, casi cualquier proteína, en principio, puede adoptar la conformación de amiloide en las condiciones adecuadas. Recientemente establecimos un método para preparar oligómeros solubles estabilizados de proteínas nativas, que forman fácilmente amiloide en presencia de varios cofactores16. Las fibrillas amiloides resultantes reflejan la naturaleza compleja de los agregados terminales de plegamiento incorrecto de proteínas17,18. Aquí usamos el término amiloide solo proteína para referirnos a las fibrillas de proteína sin cofactores y amiloide híbrido para las fibrillas que contienen componentes no proteicos.
Anteriormente, se han desarrollado varios métodos para generar amiloide in vitro mediante la aplicación de condiciones conocidas por favorecer el mal plegamiento de proteínas, como alta temperatura, ambiente hidrofóbico y variacionesde pH 19-23. Sin embargo, se asocian con varios problemas, como baja eficiencia, plegado reversible, variaciones de lotes grandes o cinética lenta. El enfoque descrito aquí es reproducible, fácil de escalar y permite controlar con precisión el momento y la condición de la conversión de amiloide.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de carbodiimida de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil] (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>ARN de levadura torula</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparina de la mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Equipo:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer casete de diálisis</td><td>Thermo/Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Las proteínas llevan a cabo tareas cruciales en los organismos al ejercer funciones derivadas de sus pliegues tridimensionales específicos. Aunque las estructuras nativas de los polipéptidos cumplen muchos propósitos, ahora se reconoce que la mayoría de las proteínas pueden adoptar un ensamblaje alternativo de amiloide rico en láminas beta. Las fibrillas insolubles de amiloide se asocian inicialmente con múltiples dolencias humanas, pero cada vez se muestran más como actores funcionales que participan en varios procesos celulares importantes. Además, el amiloide depositado en los tejidos del paciente contiene componentes no proteicos, como ácidos nucleicos y glicosaminoglicanos (GAG). Estos cofactores pueden facilitar la formación de amiloide, lo que resulta en la generación de diferentes tipos de precipitados insolubles. Aprovechando nuestra comprensión de cómo las proteínas se pliegan mal a través de una etapa intermedia del precursor de amiloide soluble, hemos ideado un método para convertir las proteínas nativas en fibrillas de amiloide in vitro. Este enfoque permite preparar amiloide en grandes cantidades, examinar las propiedades del amiloide generado a partir de proteínas específicas y evaluar los cambios estructurales que acompañan a la conversión.

La capacidad de convertir proteínas nativas directamente en amiloide depende del cambio conformacional que ocurre a alta temperatura en el tampón MES. La precipitación en la solución es una buena indicación de agregación proteica y posiblemente de formación de amiloide. Por otro lado, para permitir que el oligómero proteico soluble se estabilice, se utiliza EDC para entrecruzar las proteínas y solidificar la conformación oligomérica inducida en el tampón MES. Como resultado, los oligómeros proteicos estabilizados son pro...

Las proteínas pueden adoptar una estructura nativa o plegarse erróneamente en amiloide insoluble. Las condiciones que favorecen la vía de plegamiento incorrecto conducen a la formación de diferentes tipos de fibrillas amiloides. Los métodos aquí descritos permiten la rápida conversión de proteínas nativas en amiloide in vitro.

Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

El objetivo general del siguiente experimento es obtener rápidamente fis de amiloide a partir de cualquier proteína in vitro. Esto se logra disolviendo la proteína de elección en el tampón MES para inducir el mal plegamiento de la estructura. Luego, la proteína se puede incubar a alta temperatura, lo que promueve la formación de amiloide en ausencia de otros cofactores.Alternativamente, la proteína se reticula mediante EDC para generar ligamentos de proteínas solubles estabilizados, el precursor del amiloide. Finalmente, los cofactores no proteicos se mezclan con oligómeros de proteínas solubles estabilizadas para permitir la formación de amiloide híbrido. Se obtienen resultados que muestran que las proteínas nativas se pueden convertir fácilmente en confirmación de amiloide cuando las condiciones favorables lo facilitan. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas, como la precisión con la que se forma el amiloide a partir de oligómeros de proteínas solubles y si los diferentes tipos de amiloide tienen funciones biológicas y patológicas distintas.Para comenzar, prepare el tampón MES como se describe en el protocol

rapid-generation-of-amyloid-from-native-proteins-in-vitro

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Generación rápida de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

SDD-AGE es una técnica útil para la detección y caracterización de polímeros como el amiloide en las células. Aquí se demuestra una adaptación que hace que esta técnica susceptible de aplicaciones a gran escala.

La detección de la agregación amiloide de Semi-desnaturalización electroforesis en gel de agarosa-detergente

Fuente: Balczon, R., et al. Métodos para detectar amiloides citotóxicos después de la infección de células endoteliales pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra el procedimiento para generar sobrenadante citotóxico a partir de células endoteliales pulmonares después de la infección por Pseudomonas aeruginosa. Describe cómo las proteínas efectoras bacterianas alteran la estructura de la célula huésped e inducen la liberación de oligómeros amiloides...

Obtención de amiloides citotóxicos después de la infección bacteriana de las células endoteliales pulmonares de rata

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Purificación y replegamiento de amiloide fibrillas de (Su)<sub&gt; 6</sub&gt;-etiquetados proteína recombinante Shadoo Expresado como cuerpos de inclusión en<em&gt; E. coli</em

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Aquí se proporciona un protocolo para investigar las interacciones entre la forma nativa, las fibrillas prefibrilares y las fibrillas amiloideas maduras de diferentes péptidos y proteínas con mitocondrias aisladas de diferentes tejidos y diversas áreas del cerebro.

Interacciones con y la permeabilización de membrana de las mitocondrias cerebrales por Amiloide Fibrils

Aquí, describimos un sistema de levadura que reconstituye la γ-secretasa humana. Este sistema permite la identificación y el estudio de las mutaciones que afectan a la actividad y el cribado de los inhibidores de la γ-secretasa (GSIs). Utilizando las propiedades de pérdida de función de los mutantes familiares de la enfermedad de Alzheimer, es posible detectar moduladores de la γ-secretasa (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modelos de la enfermedad de Alzheimer para detectar genes, mutaciones y sustancias químicas que afectan la producción de beta amiloide por γ-secretasa

Aprende a generar rápidamente fibrillas de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro mediante calor y reticulación con EDC. Este método permite estudiar los mecanismos del plegamiento incorrecto de proteínas.

Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

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