Name: Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprende a generar rápidamente fibrillas de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro mediante calor y reticulación con EDC. Este método permite estudiar los mecanismos del plegamiento incorrecto de proteínas.

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Este trabajo está respaldado por subvenciones a W.C. de los Institutos Nacionales de Salud AI074809 y el Programa de Becas de Investigación Institucional del Centro Oncológico M. D. Anderson de la Universidad de Texas.

1. Preparar el búfer MES
<ol>
	<li>Utilice tampón MES (ácido 0,1 M, 2-(N-morfolino)etanosulfónico y NaCl 0,9 M) para preparar amiloide solo proteína, así como oligómeros de proteínas solubles estabilizadas. Pesa 1,95 g de MES y 5,27 g de NaCl. Agregue H2O y ajuste el pH a 4.7. Completar el volumen final hasta 100 ml. Almacenar a 4º C hasta por 6 meses.</li>
</ol>
2. Prepare amiloide solo para proteínas directamente a partir de proteínas nativas
<ol>
	<li>Pesar la proteína de elección (cualquier proteína o péptido nativo) y reconstituir a 10 mg/ml en tampón MES.</li>
	<li>Incubar a 65 ºC en baño maría durante 4 h. Al final del período, el precipitado blanco es visible en solución.</li>
	<li>Neutralizar la muestra con 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
	<li>Diálisis la proteína en un casete de diálisis durante la noche para intercambiarla al tampón deseado para su posterior análisis.</li>
	<li>Se puede preparar una muestra de control de proteína nativa siguiendo los pasos 2.1, 2.3 y 2.4 sin precipitación de calor (paso 2.2).</li>
</ol>
3. Prepare amiloide híbrido a partir de oligómeros solubles estabilizados de proteínas nativas
<ol>
	<li>Preparación de oligómeros de proteínas solubles estabilizadas
	<ol>
		<li>Pesar la proteína de elección y reconstituirla a 10 mg/ml en tampón MES. Dejar a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
		<li>Pesar el clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y preparar un caldo fresco de 20 mg/ml en tampón MES.</li>
		<li>Mezcle las soluciones de proteínas y EDC en una proporción de 2:5 (v/v), es decir, 2 mg de proteína por cada 10 mg de EDC.</li>
		<li>Incubar a temperatura ambiente durante 2 horas.</li>
		<li>Neutralizar la muestra con 10% (v/v) de Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
		<li>Diálisis la proteína en un casete de diálisis durante la noche para intercambiarla al tampón deseado para su posterior análisis.</li>
		<li>Almacenar el oligómero de proteína soluble estabilizada a 4 ºC hasta 4 semanas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare amiloides híbridos a partir de oligómero de proteínas solubles estabilizadas.
	<ol>
		<li>Para preparar amiloide que contenga ADN, mezcle el ADN y el oligómero de proteína soluble estabilizada en una proporción de 1:1 (p/p). Dejar a 4 ºC durante al menos 2 hr. Durante este período, el precipitado insoluble es visible en solución cuando la concentración inicial de proteína es de 0,5 mg/ml o superior.</li>
		<li>Para preparar amiloide que contenga ARN, mezcle ARN y oligómero de proteína soluble estabilizada en una proporción de 1:1 (p/p). Dejar a 4 ºC durante al menos 2 hr. Durante este período, el precipitado insoluble es visible en solución cuando la concentración inicial de proteína es de 0,5 mg/ml o superior.</li>
		<li>Para preparar amiloide que contenga heparina, mezcle heparina y oligómero de proteína soluble estabilizada en una proporción de 1:1 (p/p). Dejar a 4 ºC durante al menos 2 hrs. Durante este período, el precipitado insoluble es visible en solución cuando la concentración inicial de proteína es de 0,5 mg/ml o superior.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
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<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
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<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
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<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

El método descrito aquí ofrece un medio rápido y flexible para preparar fibrillas amiloides in vitro a partir de prácticamente cualquier proteína o péptido de elección. Se pueden preparar de manera confiable varios tipos diferentes de amiloide: fibrillas solo de proteínas o agregados híbridos que contienen ADN, ARN o glicosaminoglicanos. Los procedimientos involucrados son simples, directos y no requieren capacitación técnica avanzada. El amiloide preparado por este método es bastante estable y puede almacenarse...

Las proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes presentes en todo tipo de células. Se presentan en una gran variedad de tamaños, estructuras y modificaciones postraduccionales, y cumplen una enorme gama de funciones biológicas importantes cuando se encuentran en sus formas nativas. Más de dos docenas de polipéptidos aberrantes han sido implicados en numerosas condiciones patológicas humanas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la diabetes tipo2 1-4. Las proteínas terminales mal plegadas se acumulan como fibrillas de amiloide, los agregados estables insolubles que se producen extracelular o intracelularmente.
A pesar de la implicación de proteínas específicas en ciertas enfermedades, cada vez hay más pruebas que apoyan la idea de que todos los polipéptidos tienen propiedades intrínsecas que permiten la transformación del amiloide. Un estudio de la secuencia de todo el genoma identificó el "amiloma", por el cual los fragmentos propensos a la amiloide constituyen aproximadamente el 15% de todos los segmentos de péptidos codificantes de E. coli a los humanos5. En consecuencia, en los últimos años se ha descubierto un número cada vez mayor de amiloides funcionales, que participan en varios procesos celulares importantes. Por ejemplo, las bacterias ensamblan amiloides para formar biopelículas y estructuras de esporas que son críticas para su supervivencia y patogénesis6-9. Las hormonas peptídicas forman depósitos de amiloide durante el almacenamiento dentro de los gránulos secretores de mamíferos antes de ser liberadas, lo que implica además que la forma de la proteína amiloide puede cumplir funciones biológicas beneficiosas6,10,11. Además, las proteínas también pueden ensamblarse en fibrillas amiloides para transmitir señales celulares críticas12,13.
Durante muchos años, los amiloides más estudiados se preparan a partir de péptidos individuales que están asociados con enfermedades humanas, como el beta amiloide o el péptido priónico. Estos péptidos suelen carecer de una estructura bien definida y forman espontáneamente amiloide en solución con el tiempo, un proceso mediado por un intermediario parcialmente mal plegado que sirve como precursor del amiloide insoluble. El precursor del amiloide también se llama oligómero de proteína soluble, que es raro e inestable cuando se genera a partir de péptidos naturales14,15. Sin embargo, como se describió anteriormente, casi cualquier proteína, en principio, puede adoptar la conformación de amiloide en las condiciones adecuadas. Recientemente establecimos un método para preparar oligómeros solubles estabilizados de proteínas nativas, que forman fácilmente amiloide en presencia de varios cofactores16. Las fibrillas amiloides resultantes reflejan la naturaleza compleja de los agregados terminales de plegamiento incorrecto de proteínas17,18. Aquí usamos el término amiloide solo proteína para referirnos a las fibrillas de proteína sin cofactores y amiloide híbrido para las fibrillas que contienen componentes no proteicos.
Anteriormente, se han desarrollado varios métodos para generar amiloide in vitro mediante la aplicación de condiciones conocidas por favorecer el mal plegamiento de proteínas, como alta temperatura, ambiente hidrofóbico y variacionesde pH 19-23. Sin embargo, se asocian con varios problemas, como baja eficiencia, plegado reversible, variaciones de lotes grandes o cinética lenta. El enfoque descrito aquí es reproducible, fácil de escalar y permite controlar con precisión el momento y la condición de la conversión de amiloide.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de carbodiimida de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil] (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>ARN de levadura torula</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparina de la mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Equipo:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer casete de diálisis</td><td>Thermo/Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Las proteínas llevan a cabo tareas cruciales en los organismos al ejercer funciones derivadas de sus pliegues tridimensionales específicos. Aunque las estructuras nativas de los polipéptidos cumplen muchos propósitos, ahora se reconoce que la mayoría de las proteínas pueden adoptar un ensamblaje alternativo de amiloide rico en láminas beta. Las fibrillas insolubles de amiloide se asocian inicialmente con múltiples dolencias humanas, pero cada vez se muestran más como actores funcionales que participan en varios procesos celulares importantes. Además, el amiloide depositado en los tejidos del paciente contiene componentes no proteicos, como ácidos nucleicos y glicosaminoglicanos (GAG). Estos cofactores pueden facilitar la formación de amiloide, lo que resulta en la generación de diferentes tipos de precipitados insolubles. Aprovechando nuestra comprensión de cómo las proteínas se pliegan mal a través de una etapa intermedia del precursor de amiloide soluble, hemos ideado un método para convertir las proteínas nativas en fibrillas de amiloide in vitro. Este enfoque permite preparar amiloide en grandes cantidades, examinar las propiedades del amiloide generado a partir de proteínas específicas y evaluar los cambios estructurales que acompañan a la conversión.

La capacidad de convertir proteínas nativas directamente en amiloide depende del cambio conformacional que ocurre a alta temperatura en el tampón MES. La precipitación en la solución es una buena indicación de agregación proteica y posiblemente de formación de amiloide. Por otro lado, para permitir que el oligómero proteico soluble se estabilice, se utiliza EDC para entrecruzar las proteínas y solidificar la conformación oligomérica inducida en el tampón MES. Como resultado, los oligómeros proteicos estabilizados son pro...

Las proteínas pueden adoptar una estructura nativa o plegarse erróneamente en amiloide insoluble. Las condiciones que favorecen la vía de plegamiento incorrecto conducen a la formación de diferentes tipos de fibrillas amiloides. Los métodos aquí descritos permiten la rápida conversión de proteínas nativas en amiloide in vitro.

Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

El objetivo general del siguiente experimento es obtener rápidamente fis de amiloide a partir de cualquier proteína in vitro. Esto se logra disolviendo la proteína de elección en el tampón MES para inducir el mal plegamiento de la estructura. Luego, la proteína se puede incubar a alta temperatura, lo que promueve la formación de amiloide en ausencia de otros cofactores.Alternativamente, la proteína se reticula mediante EDC para generar ligamentos de proteínas solubles estabilizados, el precursor del amiloide. Finalmente, los cofactores no proteicos se mezclan con oligómeros de proteínas solubles estabilizadas para permitir la formación de amiloide híbrido. Se obtienen resultados que muestran que las proteínas nativas se pueden convertir fácilmente en confirmación de amiloide cuando las condiciones favorables lo facilitan. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas, como la precisión con la que se forma el amiloide a partir de oligómeros de proteínas solubles y si los diferentes tipos de amiloide tienen funciones biológicas y patológicas distintas.Para comenzar, prepare el tampón MES como se describe en el protocolo de texto tanto para la proteína amiloide solo como para la proteína soluble estabilizada. A continuación, todos los ligamentos pesan la proteína elegida y la reconstituyen a 10 miligramos por mililitro en tampón MES. En esta demostración, se utiliza albúmina sérica humana o HSA, se incuba la solución a 65 grados centígrados en un baño de agua durante cuatro horas.Al final del período, un precipitado blanco es visible en la solución. Neutralizar la muestra con un 10% de volumen por volumen. T tris, HCL dializa la proteína en un casete de diálisis durante la noche para intercambiarla al tampón deseado.Para un análisis posterior, prepare una muestra de control de proteína nativa siguiendo estos pasos sin precipitación de calor. Para preparar la proteína soluble estabilizada, todos los ligamentos pesan la proteína elegida y la reconstituyen a 10 miligramos por mililitro. En tampón MES, deje la solución de proteína a temperatura ambiente durante 15 minutos.Prepare un caldo fresco de 20 miligramos por mililitro EDC en tampón MES. Mezcle las soluciones de proteína y EDC en una proporción de dos a cinco, luego incube a temperatura ambiente durante dos horas después de la incubación. Neutralice la muestra con un 10% de volumen por volumen de tris HCL, dialice la proteína en un casete de diálisis durante la noche para intercambiarla con el tampón deseado.Para un análisis más detallado. Almacene la proteína soluble estabilizada en todo el ligamento a cuatro grados centígrados durante un máximo de cuatro semanas. Esta suspensión se utilizará para preparar amiloides híbridos para la preparación tanto del ADN que contiene amiloide como del ARN que contiene amiloide.Mezcle el ácido nucleico y la proteína soluble estabilizada en todo el ligamento en una proporción de uno a uno. Deje la mezcla a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas durante este período. El precipitado insoluble es visible en solución cuando la concentración inicial de proteína es de 0,5 miligramos por mililitro o más.Para preparar la heparina, que contiene amiloide, mezcle heparina y proteína soluble estabilizada, todo el ligamento en una proporción de uno a uno antes de incubarlo a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas. Al igual que el ácido nucleico que contiene amiloides, el precipitado soluble es visible en la solución. Cuando la concentración inicial de proteína es de 0,5 miligramos por mililitro o más, la capacidad de convertir las proteínas nativas directamente en amiloide depende del cambio de confirmación incurrido a alta temperatura.En el tampón MES, la precipitación en la solución es una buena indicación de la agregación de proteínas y la posible formación de amiloide para permitir que los oligómeros de proteínas solubles se estabilicen. El EDC se utiliza para entrecruzar las proteínas y solidificar la confirmación oligomérica inducida en el tampón MES. Como resultado, las proteínas estabilizadas allgas son proteínas multiméricas distintas de las proteínas nativas monoméricas o de los agregados inducidos por calor.Cuando se separan por la proteína soluble estabilizada por página SDS, todos los ligamentos pueden unirse fácilmente a los ácidos nucleicos, incluidos el ADN y el ARN de manera independiente de la secuencia. Por lo tanto, se puede realizar un ensayo de cambio de gel para visualizar la interacción directa entre la proteína soluble estabilizada, todos los ligamentos y el ADN, lo que resultaría en la migración retardada del ADN en un gel AROS. La citotoxicidad es un carácter arquetípico de las proteínas solubles.Todos los ligamentos estabilizaron la proteína soluble, todos los ligamentos indujeron la muerte celular dependiente de la dosis que es detectable por clasificación celular activada por fluorescencia. Como se muestra aquí, las células RP I 8 2 2 6 son extremadamente susceptibles a la proteína soluble, toda muerte inducida por ligamentos que se mide mediante tinción de yoduro de propidio. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar diferentes tipos de amiloide a partir de cualquier proteína de su elección in vitro.

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Generación rápida de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

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