Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta

El objetivo general de este procedimiento es investigar la función del factor de transcripción NF kappa B en el cerebro adulto. Esto se logra mediante la cría inicial de ratones transgénicos que inhiben específicamente la actividad de NF kappa B en las neuronas. El segundo paso del procedimiento es probar las consecuencias conductuales de la inhibición de NF kappa B utilizando el patrón espacial, separación o graneros, laberinto.

El tercer paso es la profusión cuidadosa de los animales, la extracción de los cerebros y la sección adecuada de los mismos. El paso final es analizar los efectos histológicos y estructurales, como la visualización de proyecciones de fibras musgosas mediante inmunotinción. En última instancia, el uso de la prueba de comportamiento seguida de histología puede correlacionar cambios en el aprendizaje dependiente del giro dentado con cambios estructurales en los tejidos asociados.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como Mars Vase es que los lazos de separación de patrones espaciales MA ofrecen la oportunidad de medir específicamente los procesos de aprendizaje anti dependencia del niño, así como la neurodegeneración y regeneración en esta área del cerebro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis adulta, como el aprendizaje como separación de patrones especiales. La demostración del laberinto estará a cargo de Angela Kula, una técnica de mi laboratorio.

La perfusión será presentada por Peter Hyman, investigador asociado. A continuación, el técnico de Ulrich KA mostrará el corte de los cerebros. Y, por último, la microscopía de barrido confocal será presentada por Jeanine Muah, estudiante de doctorado de mi laboratorio Llevar a cabo la separación de patrones espaciales.

Barnes Maze Pruebas de comportamiento de acuerdo con las directrices internacionales y locales. Para este ensayo, es importante utilizar solo ratones machos de al menos seis meses de edad. Para cada serie de ensayos, los animales deberán tener una edad inferior a cuatro días y el mismo operador deberá realizar todas las pruebas antes de las mismas.

Los ratones deben ser alimentados con una dieta estándar para que se motiven con la comida dulce. Para configurar la prueba primero, obtenga una placa blanca de 120 centímetros de diámetro hecha de plástico duro. Los tacos de laberinto adicionales pueden estar hechos de diferentes materiales y pueden tener diferentes formas.

Es importante destacar que deben tener un alto contraste para ser claramente reconocidos por las ruedas de los animales. Las escaleras y los túneles son buenas señales. Coloque la placa debajo de varias lámparas fluorescentes de neón que sean moderadamente intensas, para que los ratones estén motivados a salir de la luz.

La habitación debe estar con humedad controlada y a una temperatura constante de 22 grados centígrados. Ahora configure el sistema de seguimiento de video. Coloque la cámara a 115 centímetros por encima del centro de la placa.

A continuación, coloque tacos de laberinto adicionales multicolores en un paño de color blanco que se ajuste al plato. Colócalos cerca del centro de la tela para que sean fácilmente visibles para los animales. Ahora, limpie cuidadosamente la placa con el desinfectante rápido que puede eliminar cualquier olor de la configuración experimental.

Coloque siete casas de comida amarillas idénticas en el plato blanco. Sus posiciones deben estar marcadas inequívocamente un día antes de comenzar las pruebas, habituando cada ratón al disco. Coloque las recompensas de gránulos de comida dulce como un bucle de fruta en cuartos dentro de cada una de las siete casas de comida para la prueba de habitación.

Coloque cada mouse en el punto de inicio del plato y déjelo explorar durante 10 minutos. Graba esta exploración entre ratones. Limpie el plato circular y las casas de alimentos con desinfectante rápido.

También reponga las recompensas de comida. En los próximos siete días consecutivos, ejecute las pruebas de prueba para las pruebas. Todas las casas, excepto una, están cerradas con cinta transparente durante todo el experimento.

Siempre es la misma casa. Cada casa todavía está cargada con una recompensa y la prueba se lleva a cabo como la prueba de habituación. Realice las pruebas a la misma hora del día para cada animal para evitar variaciones circadianas.

Posteriormente, analice la latencia, la distancia recorrida y los errores utilizando las estadísticas adecuadas. El software define los errores como acercarse a la casa de alimentos equivocada o hacer contacto con la caja adecuada, pero no entrar y recuperar la recompensa. Para comparar los grupos, utilice un ANOVA de dos factores con una prueba post hoc de bon, fer.

Después de anestesiar al animal con una inyección interperitoneal de vertina, perfundirlo cuidadosamente por vía transcordial con PBS que contenga heparina y propano. Haz un orificio en el ventrículo izquierdo con una aguja de calibre 26. También haga un corte en la aurícula derecha para permitir que la sangre y la perfusión fluyan hacia afuera.

Inserte la aguja de perfusión en el ventrículo izquierdo en el orificio con un ángulo recto y a una profundidad de uno a dos milímetros. Utilice de 1,2 a 1,4 metros de presión hidrostática y perfunda el ratón durante dos a cuatro minutos. Siga la heparina y el propano con 4% de paraldehído en PBS durante 10 a 15 minutos.

La perfusión debe ser de 15 mililitros por minuto. Ahora disecciona el cerebro. Debe ser de color blanco pálido, sin vasos sanguíneos rojos visibles.

Fije todos los cerebros recolectados en formaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente. Cryo protege los cerebros en sacarosa al 30% en PBS, almacene a cuatro grados centígrados durante al menos 24 horas después.

Los cerebros se congelan en una etapa de tono criogénico y se cortan en secciones horizontales de 40 micras de grosor. Después de teñir las secciones con un anticuerpo para el neurofilamento M, las proyecciones de fibras musgosas se pueden visualizar utilizando un microscopio de barrido láser confocal a la longitud de onda adecuada para el anticuerpo fluorescente. Inicie el escaneo con un aumento bajo y oriéntese hacia el hipocampo y las proyecciones de fibras musgosas.

Luego, con un aumento mayor, recoja escaneos de cesárea de alta resolución de las fibras musgosas para analizarlas e investigar la expresión del transgén I kappa B alfa AA uno. En los cerebros de ratón transgénicos dobles se aislaron, crioseccionaron y tiñeron utilizando un anticuerpo contra el escaneo láser confocal GFP. La microscopía reveló una alta expresión del transgén en la región CA uno, la región CA tres y en la DG para determinar el tipo de célula más temprano que expresa el CAMK dos alfa kappa B alfa AA uno en la región neurogénica del hipocampo.

Secciones criogénicas de hipopótamo Campi de I Kappa BTTA. Los animales se tiñeron para la cortenina doble y el análisis confocal del transgén reveló señales de GFP en células granulosas jóvenes DCX positivas marcadas con las flechas que indican la inducción de la expresión del transgén por la actividad alfa de CAMK dos. Las secciones coronales del hipocampo de los ratones i kappa BTTA e i Kappa B minus se tiñeron para el neurofilamento M para visualizar las proyecciones de fibras musgosas y revelar una organización compleja y vesicular en ratones i kappa BTTA.

Las proyecciones de fibra musgosa estaban severamente deterioradas. Además, la inhibición de NF kappa B condujo a una reducción significativa del grosor de la hoja y a un menor volumen de DG para estudiar las posibles razones del dramático defecto estructural. Cortes de hipocampo frescos no fijados de ratones control y I kappa BTTA se tiñeron con jade fluorado C, lo que permite la detección específica de la muerte celular neuronal.

Se observó un aumento drástico del número de neuritas degeneradoras en los animales con doble transgénico en comparación con los controles con un solo transgénico. Además, se detectó un aumento significativo de células positivas para el caritmo escindido tres en ratones I kappa BTTA. Por el contrario, la tinción inmunohistoquímica contra DCX reveló un aumento significativo de las cantidades de células DCX positivas en los cerebros de los ratones I kappa BT.

Además, las células d CX positivas en I kappa B TTA hippo Campi no se dispusieron exclusivamente en la zona subgranular, sino que también se encontraron en las regiones más profundas del dg. Mientras que los progenitores D CX positivos en los animales de control se localizaron casi exclusivamente dentro de la zona subgranular. La prueba del aumento de la cantidad de células que expresan DCX fue el resultado de la maduración de progenitores anteriores o directamente debido a la proliferación de células DCX positivas.

Se inyectó BRDU por vía intraperitoneal en ratones BTTA y control, que luego fueron crioseccionados y teñidos con DCX y BRDU para el análisis de la proliferación. Se inyectó BRDU una vez, seguido de un análisis después de 24 horas. Para el análisis de la diferenciación, se realizaron tres inyecciones diarias, seguidas de un análisis a los siete días de una sola inyección de BRDU.

No se observaron diferencias significativas en el número total de células BRDU positivas entre los animales I kappa BTTA negativos y los controles. Por el contrario, el enfoque de tres inyecciones en serie reveló un claro aumento de la cantidad de células B-R-D-U-D-C-X en la capa DG de I, BTTA. La diferenciación o integración perturbada de las células que expresan DCX en ratones puede haber aumentado el número de células y las células de tipo tres pueden haber estado involucradas para probar específicamente el comportamiento de los ratones transgénicos dobles.

En una tarea dependiente de DG, se empleó el S-P-S-B-M. Los animales de control I kappa B exploraron las casas de alimentos en serie el primer día del experimento. Después de siete días de entrenamiento, los animales pudieron encontrar directamente el galpón de comida abierto.

Por el contrario, los animales de la IA BTTA continúan explorando las casas de comida en serie incluso después del entrenamiento. La observación de aumentos significativos en las distancias recorridas y latencias y tasas de error más altas en los animales I kappa BTTA en comparación con los animales de control i Kappa B sugiere que estos animales tenían graves defectos de aprendizaje. Una vez establecida, esta técnica se puede realizar en 30 minutos por animal si se realiza correctamente después de su desarrollo.

Esta técnica podría allanar el camino a otros neurocientíficos interesados en tareas dependientes de los giroscopios, como la neurogénesis, la degeneración o la regeneración de adultos en ratones.