Name: Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T23:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Aprende a modular y analizar la neurogénesis adulta dependiente de NF-κB en ratones mediante el laberinto de Barnes para separación espacial. Este protocolo integra pruebas conductuales con análisis histológico de proyecciones de fibras musgosas.

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Damos las gracias a Angela Kralemann-Köhler por su excelente apoyo técnico. El trabajo experimental descrito en este documento se llevó a cabo en nuestro laboratorio y el apoyo de subvenciones del Consejo de Investigación Alemana (DFG) a CK y BK y una subvención del Ministerio alemán de Investigación y Educación (BMBF) de BK.

Declaración de Ética Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las normas del comité uso cuidado de los animales y gubernamental, LANUV del estado Renania del Norte-Westfalia, (Düsseldorf, Alemania). Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por LANUV, Düsseldorf bajo el número de licencia 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar la angustia y el número de animales necesarios para el estudio. 1. Cuidado de Animales y Vivienda <ol><li> Todos los animales utilizados en los protocolos descritos en el presente documento deben mantenerse en condiciones libres de patógenos específicos, según la definición de la Asociación Federación Europea Laboratory Animal Science (FELASA). </li><li> Los ratones deben mantenerse en jaulas estándar en una habitación con temperatura y humedad controladas (22 ° C) en condiciones diurnas (12 horas de luz / oscuridad ciclo) con filtros HEPA el aire. </li><li> Alimento normalizado y el agua deben ser proporcionados ad libitum. &lt;/ Li&gt; <li> Si / IkB / TTA y IkB - Se utilizan ratones de control, genotipificación basados ​​en PCR debe realizarse para cada animal, como se describe en 7, 18. </li><li> Los machos con una diferencia de edad de menos de cuatro días deben de ser utilizados para reducir la variabilidad individual. </li><li> (Opcional): Para los experimentos de reactivación de NF-kB, doxiciclina debe administrarse en el agua potable (2 mg / ml con 2,5% de sacarosa) durante al menos 14 días. </li></ol> 2. Espacial del patrón de separación-Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Todas las pruebas de comportamiento debe ser llevada a cabo de acuerdo con las directrices internacionales y locales. </li><li> ¡IMPORTANTE! Utilice sólo los ratones machos con una edad de seis meses o más. La diferencia de edad entre los animales de una serie de pruebas debe ser inferior a cuatro días. La prueba debe ser realizada por el mismo operador para cada serie. Los ratones debe recibir una dieta estándar antes de la prueba para aumentar aún más la motivación parcialmente impulsado por comorecompensa de comida weet. </li><li> Configurar una placa circular blanco hecho de plástico duro (diámetro 120 cm, ver Figura 5 A) en una y humedad de la sala de temperatura controlada (22 º C), iluminada con un mínimo de 4 x 80 W y 3 x 215 W lámparas fluorescentes de neón . ¡IMPORTANTE! Asegurar que se utilice la iluminación correcta, ya que la motivación de los ratones para entrar en las casas de los alimentos es impulsada en parte por su aversión a, lugares expuestos brillantes. </li><li> Establezca el sistema de vídeo-seguimiento. La cámara debe ser colocado 115 cm por encima del centro de la placa (véase la Figura 5A). </li><li> Conecte las señales extra-laberinto multicolor (EMC) en un paño de color blanco en posiciones fácilmente visibles para los animales, unos 100 cm desde el borde de la placa (ver figura 5A). </li><li> Limpiar cuidadosamente la placa con un desinfectante rápida que puede eliminar cualquier olor del montaje experimental. </li><li> Coloque siete casas idénticas amarillas de alimentos (12 cm x 7 cm x 8 cm, ver Figura 5A </strong&gt;) en el plato blanco. Las posiciones deben ser inequívocamente marcados (ver Figura 5 A). </li><li> Coloque las recompensas de pellets de alimentos dulces (cuarto de una casa Froot Loop / comida `s Kellogs) dentro de todas las casas de comida en posiciones definidas (ver Figura 5 A) con sólo una casa de comida definido siendo de libre acceso para el animal (la ubicación F, véase la Figura 5A ). Cierre las casas de comida no-objetivo con papel transparente. </li><li> Antes de la prueba, realice la habituación (un día antes de comenzar la tarea). Haga todas las casas de comida de acceso libre y permiten a los ratones para explorar el laberinto libre y para recuperar una recompensa bolita de comida (10 min / animal). </li><li> Encienda el ordenador y la cámara y ejecutar el software de sistema de vídeo-seguimiento. </li><li> Inicie la grabación. </li><li> Colocar el animal en el punto inicial definido en la placa circular (Figura 5 A, S: Posición de inicio) y permiten a los ratones para buscar la casa de comida de destino durante 10 min. </li><li> Stop el video-seguimiento. </li><li> ¡IMPORTANTE! Limpie la placa circular y las casas de comida después de cada ensayo con desinfectante rápido. </li><li> Repita la prueba al día durante siete días consecutivos (por cada animal). </li><li> Analizar los resultados (latencia, la distancia recorrida y errores) utilizando el software de estadísticas adecuadas. Definir los errores como acercarse a la casa de comida equivocada y / o contacto con la caja apropiada sin entrar y recuperar la recompensa bolita de comida. Para el análisis agrupado utilizar dos vías ANOVA con test post-hoc de Bonferroni. </li><li> (OPCIONAL) Sacrificar los ratones y analizar los hipocampos como se describe a continuación. </li></ol> 3. Etiquetado BrdU <ol><li> Inyectar por vía intraperitoneal 50 mg / kg de BrdU IP una vez al día durante 3 días (análisis de la diferenciación y la integración) o IP 200 mg / kg para una sola inyección (análisis de la proliferación). </li><li> Sacrificio de los animales, diseccionar el hipocampo y preparar 40 micras secciones como se describe a continuación. </li><li> Desnaturalizar lasecciones con 2 M de HCl durante 10 min y se incuba en tampón borato 0,1 M durante 10 min. </li><li> Etiquetar una serie de uno de cada doce de 40 micras secciones (240 micras de distancia) de cada animal mediante inmunohistoquímica, como se describe a continuación utilizando anticuerpos dirigidos contra BrdU. </li><li> Cuantificar las células marcadas por análisis de microscopía confocal en toda la extensión rostrocaudal de la capa de células granulares y zona subgranular. Multiplica los números resultantes por 12 para obtener el número total estimado de células BrdU marcado por el hipocampo y se dividen por dos para obtener el número total de células marcadas por la Dirección General. </li></ol> 4. La separación de los cerebros y Preparación de criosecciones de nonperfused Animales <ol><li> Observe los procedimientos aprobados localmente para la eutanasia de animales. Los ratones pueden ser sacrificados directamente por dislocación cervical. </li><li> (OPCIONAL) Los animales pueden ser anestesiados antes de la eutanasia de acuerdo con las normas locales e internacionales, por ejemplo, por inje intraperitonealcción de 0,8 ml de Avertin para una 33 g de ratón (recién hecha mediante la mezcla de 150 ml de la solución hecha de 2,2 mg de 2,2,2-tribromoetanol en 1 ml de isoamilo etanol con 1,85 ml de solución salina o tampón fisiológico). </li><li> Esterilizar la cabeza con Betadine (10% de povidona yodada) empapado en gasas y esponja posteriormente con una gasa empapada en alcohol al 70%. </li><li> Decapitar al animal usando tijeras quirúrgicas adecuadas y tire de la piel a un lado. </li><li> (Opcional) Fijadores se pueden aplicar para evitar el repliegue de la piel retardado. </li><li> Haga una incisión en la línea media en el cráneo y tire con cuidado los fragmentos de cráneo de lado. </li><li> Retire con cuidado todo el cerebro usando un instrumento quirúrgico adecuado (por ejemplo Moria Spoon). </li><li> PreCool 25 ml de 2-metilbutano en un vaso de precipitados de 50 ml (por ejemplo, Schott Duran) a -30 a -40 º C en hielo seco. Nota: Para la tinción de libre flotación de las secciones &quot;densas&quot; que son ideales para la microscopía confocal de barrido láser, eliminar cerebro, lavar 3veces en tampón y se almacenan a 4 ° C en PBS solución de sacarosa al 30% en el tubo de 50 ml hasta el cerebro se ha hundido hasta el fondo (generalmente durante la noche). </li><li> Con cuidado, coloque el cerebro en un pedazo de Nescofilm (Parafilm) y cubrir con una amplia cantidad de compuesto TissueTek octubre, congelar en Nescofilm en 2-metil-butano, almacenar a -80 ° C hasta su uso. Nota: Para el almacenamiento de largo plazo a -20 ° C en la tienda 9% de sacarosa, 7 mM MgCl 2, tampón fosfato 50 mM, 44% de glicerol. </li><li> Cortar el cerebro en 10-12 micras de espesor secciones sobre criomicrotomo apropiado. Nota: Para las secciones gruesas, que flotan libremente, congelar el cerebro en cryotome etapa de cryotome apropiado (por ejemplo Reichert Jung, Frigomobil.) Y cortar 40 micras secciones horizontales a -20 ° a - 25 ° C. Recoger las secciones de cuchillo con pincel fino y recoger en tampón o mantenerse en la solución de almacenamiento (paso 4.9) a -20 º C para el almacenamiento de largo plazo. </li><li> Monte con cuidado dos rebanadas en portaobjetos individuales. El nose de diapositivas Superfrost UltraPlus es muy recomendable para maximizar la adhesión de las secciones. </li><li> Secar los portaobjetos durante 5 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se pueden almacenar a -80 ° C hasta su uso. </li></ol> 5. Preparación de las secciones de perfundido Animales <ol><li> Se anestesia a los animales como se describió anteriormente (paso 4.2). </li><li> Perfundir con cuidado el animal transcardialmente con tampón fosfato salino (PBS) que contenía heparina (0,025 g/100 ml de PBS) y procaína (0,5 g/100 ml de PBS) durante 2-4 min, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10-15 min . La perfusión se lleva a cabo de manera óptima por perfusión a través del ventrículo izquierdo y la apertura de la aurícula derecha usando una presión hidrostática de aproximadamente 1.2 a 1.4 m o utilizando una bomba peristáltica se establece en aproximadamente 15 ml / min. Resultados óptimos en una perfusión cerebral blanco pálido, sin vasos sanguíneos rojos siendo visible. </li><li> Diseccionar y posteriores a fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% a 4 º C durante 24 horas. </li><li> Cryoproteger los cerebros en 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C durante al menos 24 horas. </li><li> Congele los cerebros en el escenario cryotome. </li><li> Preparar 40 micras secciones horizontales de prosencéfalos enteras usando un criotomo apropiada. </li><li> Los portaobjetos se pueden almacenar en la solución crioprotectora (tampón de fosfato 0,1 M, 50% de glicerol, 0,14% de MgCl 2, 8,6% de sacarosa) a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 6. La inmunohistoquímica de secciones de cerebro de nonperfused Animales <ol><li> Post-fijar las secciones criogénicas, preparados como se ha descrito anteriormente, usando -20 ° C metanol frío durante 10 min. </li><li> Se bloquea con 5% de suero normal que contiene 0,3% de Triton-X (de la especie que se utilizaron para elevar el anticuerpo secundario) durante la noche a 4 ° C. </li><li> Enjuague 3 veces con 1 × PBS y se incuban con anticuerpos primarios noche a 4 ° C. </li><li> Enjuagar 3 veces con 1 x PBS y se incuban con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante una hora. </li><li> Enjuague 3 veces con PBS 1x </li><li> Counterstain la sección de ADN utilizando verde SYTOX o DAPI (o un tinte de ADN alternativo). </li><li> Enjuague 3 veces con PBS 1x </li><li> Incorporar las secciones en un medio acuoso incrustación. </li><li> Deje que el medio de inclusión polimeriza durante al menos 48 horas. </li></ol> 7. La inmunohistoquímica de secciones de cerebro de animales perfundidos <ol><li> Bloquear tal como se describe en el paso 6.2 y posteriormente incubar las secciones de cerebro fijadas en solución de anticuerpo primario diluido en PBS que contenía 0,3% de Triton-X (de flotación libre) durante la noche a 4 ° C. </li><li> Enjuague tres veces con 1x PBS y se incuban en solución de anticuerpo secundario diluido en PBS que contenía 0,3% de Triton-X (de flotación libre) a temperatura ambiente durante 3 h. </li><li> Enjuague 3 veces con PBS 1x </li><li> Contrateñir la sección de ADN utilizando SYTOX verde o DAPI (o un tinte de ADN alternativo). </li><li> Enjuague tres veces con PBS 1x </li><li> Incorporar las secciones en un medio acuoso incrustación. </li><li> Deje que el medio de inclusión polimeriza para unt menos 48 horas. </li></ol> 8. Investigación de Proyecciones Mossy Fibra <ol><li> Sacrificio de los animales, se preparan 40 micras secciones coronales como los descritos anteriormente y manchar la sección de hipocampo utilizando anticuerpos para neurofilamentos M. </li><li> Analiza las secciones en la longitud de onda apropiada usando un microscopio de barrido láser confocal para visualizar las fibras musgosas y núcleos. Inicie el escaneo a bajo aumento. </li><li> Utilice las imágenes de baja magnificación para la orientación y el objetivo del hipocampo con proyecciones de fibras musgosas. </li><li> Escanear las secciones (z-seccionamiento) en alta resolución y una gran ampliación. </li><li> Analizar el aspecto morfológico y la conectividad de las fibras musgosas visualizados mediante tinción de NF-M. </li><li> (OPCIONAL) analizar el tamaño y el volumen de las cuchillas del hipocampo. Utilice la señal de ADN para las mediciones. </li></ol> 9. Fluoro-Jade C Assay (Neuronal Cell Death) <ol><li> Sacrificio de los animales, diseccionar el hippocampus, y preparar 12 micras secciones como se describe anteriormente. </li><li> Deje que las secciones se secan durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Fijar las secciones en PFA al 4% durante 40 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavan brevemente las secciones 3 veces con ddH 2 O. </li><li> Incubar las secciones con permanganato de potasio 0,06% (KMnO4) durante 10 min bajo continua, una agitación suave. </li><li> Lave las secciones 3 veces con ddH 2 O. </li><li> Incubar las secciones con solución de C fluoro-Jade 0,002% durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> (OPCIONAL) Para tinciones nucleares simultáneas, solución 0,002% fluoro-Jade C se puede complementar con 10 mg / ml DAPI. </li><li> Lavan brevemente las secciones 3 veces con ddH 2 O. </li><li> Deje que las secciones se secan durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Incubar las secciones con xileno (1 min) </li><li> Montar las secciones usando un medio de montaje basado en Xileno (DPX). </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Neurogénesis adulta, y la posibilidad de su manipulación a través de la inhibición de NF-kB en las neuronas, y su reactivación posterior a través de la doxiciclina, ofrece un sistema fascinante para la investigación de las neuronas recién nacidas en el cerebro adulto, así como en la neuronal, y de re-generación . La belleza de este sistema es que la inhibición de la vía de señalización NF-kB en las neuronas no sólo se traduce en cambios en la muerte neuronal celular, la proliferación de progenitores y la migración, y se...

Ontológicamente, el hipocampo es una de las estructuras cerebrales anatómicas más antiguos conocidos. Es responsable de diversas tareas complejas, como las funciones clave en la regulación de la memoria a largo plazo, la orientación espacial y la formación y consolidación de la memoria respectiva. Anatómicamente, el hipocampo consiste en capas de células piramidales (estrato piramidal), incluyendo el cuerno de Ammonis (CA1, CA2, CA3, CA4 y) regiones y la circunvolución dentada (dentatus circunvolución), que contiene las células granulares y unos progenitores neuronales dentro de su zona subgranular . Las células granulares proyectan hacia la región CA3 a través de los llamados fibras musgosas (axones de las células granulares). Hasta finales del siglo pasado, el cerebro de los mamíferos adultos se cree que es un órgano estático que carecen de plasticidad celular y la neurogénesis. Sin embargo, durante las últimas dos décadas, una cantidad creciente de evidencia demuestra claramente la neurogénesis adulta que tiene lugar en al menosdos regiones del cerebro, la zona subventricular (SVZ) y la zona subgranular del hipocampo. Nuestros estudios previos y los de otros grupos, han demostrado que el factor de transcripción NF-kB es uno de los reguladores moleculares cruciales de la neurogénesis adulta, y que sus resultados de-regulación en los defectos del hipocampo estructurales graves y alteraciones cognitivas 1-6. NF-kappa B es el nombre genérico de un factor de transcripción inducible por compuesto de diferentes combinaciones diméricas de cinco subunidades de unión al ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, y p65 (de RelA), los tres últimos de los cuales tienen dominios de transactivación. Dentro del cerebro, la forma más abundante encontrada en el citoplasma es un heterodímero de p50 y p65, que se mantiene en una forma inactiva por el inhibidor de kappa B (IkB)-proteínas. Para estudiar y manipular directamente la neurogénesis impulsado por NF-kB, utilizamos modelos de ratones transgénicos para permitir simple inhibición de toda la subun NF-kBsu, específicamente en el cerebro anterior 7 (ver Figura 1). Con este fin, hemos mestizos, las siguientes líneas de ratones transgénicos, IkB / - y -/tTA. El transgénico IkB / - line se generó usando un mutante negativo trans-dominante de NF-kB-inhibidor IκBa (super-represor IκBa-AA1) 8. En contraste con la de tipo salvaje IκBα, IκBα-AA1 tiene dos residuos de serina mutado a alaninas (V32 y V36), que impiden la fosforilación y la degradación proteasómica subsiguiente del inhibidor. Para prosencéfalo neuronal específica la expresión de la IκBa-AA1-transgén, IkB / - ratones fueron cruzadas criados con ratones que albergan una quinasa de calcio-calmodulina dependiente IIα (CAMKIIα)-promotor que puede ser accionado por tetraciclina trans-activador (TTA) 9. p65 ratones knock-out tienen un fenotipo letal embrionaria, debido a la apoptosis masiva del hígado 10, por lo que el enfoque se muestra aquí ofrece un método elegantepara investigar el papel de NF-kappa B en posnatal y la neurogénesis adulta. La prueba de comportamiento clásico para estudiar el aprendizaje espacial y la memoria se describe en la década de 1980 por Richard Morris, una prueba conocida como el laberinto de agua de Morris (MWM) 11. En este campo abierto-laberinto de agua, los animales aprenden a escapar del agua opaca a una plataforma de búsqueda basado en la orientación y extra-laberinto señales. Una variante seco de MWM es el denominado laberinto de Barnes (BM) 12. Esta prueba utiliza una placa circular con 20 orificios circulares dispuestos en el borde de un plato, con un agujero definido como una caja de escape, y visuales señales extra-laberinto de orientación. Ambos paradigmas experimentales se basan en el comportamiento de vuelo inducida por una aversión al roedor `s al agua, o espacios abiertos, bien iluminado. Ambas pruebas permiten una investigación de la orientación espacial, y el rendimiento de la memoria relacionados. Aunque el hipocampo desempeña un papel general y esencial en la formación de la memoria espacial, el hipocampo rEGIONES involucrados difieren dependiendo de la prueba aplicada. La memoria a prueba en BM surge de la actividad neuronal entre la corteza enthorinal (CE) y las neuronas piramidales ubicadas en el CA1-región del hipocampo sin una contribución de la DG 13-16. En particular, el clásico BM se basa principalmente en la navegación a través de la vía temporo-amónico monosináptico de CE III de la CA1 a CE V. Es importante destacar que, la DG se crucial que participan en la llamada de reconocimiento de patrón espacial 17, lo que implica no sólo el procesamiento de información visual y espacial, sino también la transformación de las representaciones o recuerdos similares en representaciones diferentes, que no se superponen. Esta tarea requiere un circuito tri-sináptica funcional de la CE a la DG II a CA3 a CA1 y EC VI, que no puede ser probado en el BM 15. Para hacer frente a estos desafíos, hemos ideado SPS-BM como una prueba de comportamiento para probar específicamente el rendimiento cognitivo gyrus dentado dependiente en coanimales ntrol, y en el modelo de super-represor IkB / TTA consecuencia de la inhibición de NF-kB. Es importante destacar que, en contraste con el MWM o el BM, la MSF-BM puede revelar anomalías de comportamiento sutiles resultantes de deterioro de la neurogénesis. Desde espacial-pattern-separación es estrictamente dependiente de un circuito funcional entre EC II y la DG y CA3 y CA1 y EC VI, esta prueba es muy sensible a los cambios potenciales en la neurogénesis, modificaciones de la vía de las fibras musgosas o alteraciones de la homeostasis del tejido dentro de la DG. Técnicamente, la puesta a punto de nuestra prueba se basa en el estudio de Clelland et al., En la que el patrón de separación espacial fue probada usando una madera de 8 brazos brazo radial laberinto (RAM) 19. En nuestra configuración modificada, los ocho brazos fueron sustituidos por siete casas de comida amarillas idénticas. En resumen, los métodos que se muestran aquí, incluyendo el análisis de las células que expresan doblecortina (DCX +) en el hipocampo, las proyecciones de fibras musgosas, neuronal de células death y particularmente el SPS-BM presenta aquí, se puede aplicar a las investigaciones de otros modelos de ratones que incorporan los transgenes que tienen un impacto en la neurogénesis adulta. Otras aplicaciones pueden incluir el estudio de los agentes farmacológicos y la medición de su impacto en la separación patrón DG y espacial.

<table><tbody><tr><td>Moria MC17 Cuchara perforada&nbsp;</td><td>FST</td><td>10370-18</td><td>extracción de los cerebros</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi SV8</td><td>extracción de los</td></tr><tr><td>cerebros Tijeras quirúrgicas&nbsp;</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td>extracción de los cerebros</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas&nbsp;</td><td>FST</td><td>14381-43</td><td>extracción de los cerebros Pinza</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>FST</td><td>11254-20</td> extracción <td>de los</td></tr><tr><td>cerebros SuperFrost Slides</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td>portaobjetos para inmunohistoquímica</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>fijador Compuesto TissueTek OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>1004200018</td><td>incrustación de los cerebros</td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Bloqueo de Jackson Immunolabs</td><td>005-000-001</td><td>en IHQ</td></tr><tr><td>Suero normal de conejo</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>011-000-001</td><td>en IHQ</td></tr><tr><td>Suero normal de burro</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>017-000-001</td><td>Bloqueo en IHC</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Neurofilamento-M</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>2H3</td><td>IHC, dilución 1:200</td></tr><tr><td>anti-Doublecortin&nbsp; anticuerpo</td><td>sc-8066</td><td>Santa Cruz</td><td>IHC, Dilución 1:800</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>IHC, Dilución 1:2.000</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-BrdU</td><td>OBT0030G</td><td>Accurate Chemicals</td><td>IHC, Dilución 1:2.000&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoro-Jade C</td><td>FJ-C</td><td>HistoChem</td><td>Determinación de la muerte celular neuronal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td>D08AG02 desinfectante</td></tr><tr><td>Criomicrótomo</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td>preparación de cortes de cerebro</td></tr><tr><td>Heparina sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td>perfusión</td></tr><tr><td>Placa circular de plástico duro (diámetro 120 cm)</td><td>Hecho en</td> <td>laboratorioninguna</td><td>placa para SPS-BM, diámetro 120 cm</td></tr><tr><td>Buraton desinfectante rápido&nbsp;</td><td>Sch&uuml; lke Mayr</td><td>113 911</td><td>desinfectante</td></tr><tr><td>Sistema de seguimiento de video TSE VideoMot 2 con paquete de software VideoMot2</td><td>Sistemas TSE</td><td>302050-SW-KIT</td><td>seguimiento y análisis de SPS-BM</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>permeabilización/IHC</td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Reichert Jung/Leica</td><td>Frigomobil 1206</td><td>preparación de 40 &micro; m Cortes de cerebro</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Carl Roth</td><td>Art.-Nr. 0713</td><td>Incrustación de las diapositivas</td></tr><tr><td>SYTOX verde</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Tinción nuclear</td></tr><tr><td>Pellets de alimentos (Kellog's Froot Loops)</td><td>Kellog's</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Prism, versión 3.0</td><td>Graph Pad Software, San Diego, EE. UU.</td><td></td><td>Evaluación estadística del software SPS-BM</td></tr><tr><td>Zen 2008 o Zen 2011</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Software (Microscopio confocal)</td></tr><tr><td>D.P.X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317616</td><td>medio de montaje para la tinción de Fluoro-Jade C</td></tr></tbody></table>

los métodos para la modulación y análisis de nf-kb dependiente de la neurogénesis adulta

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

El hipocampo desempeña un papel fundamental en la formación y consolidación de los recuerdos episódicos, y en la orientación espacial. Históricamente, el hipocampo adulto ha sido vista como una región anatómica muy estática del cerebro de los mamíferos. Sin embargo, hallazgos recientes han demostrado que el giro dentado del hipocampo es un área de enorme plasticidad en los adultos, con la participación no sólo de las modificaciones de los circuitos neuronales existentes, sino también la neurogénesis adulta. Esta plasticidad está regulada por redes de transcripción complejas, en la que el factor de transcripción NF-kB desempeña un papel prominente. Para estudiar y manipular la neurogénesis adulta, un modelo de ratón transgénico para la inhibición neuronal del cerebro anterior-específica de la actividad de NF-kappa B puede ser utilizado. En este estudio, se describen métodos para el análisis de la neurogénesis NF-KB dependiente, incluyendo sus aspectos estructurales, la apoptosis neuronal y la proliferación de células progenitoras, y la significación cognitiva, which se evaluó específicamente a través de un giro dentado (DG) dependiente de la prueba de comportamiento, el patrón espacial de separación-Barnes laberinto (SPS-BM). El protocolo de MSF-BM podría ser simplemente adaptado para su uso con otros modelos de animales transgénicos diseñados para evaluar la influencia de los genes particulares en la neurogénesis del hipocampo adulto. Además, MSF-BM podría ser utilizado en otros entornos experimentales destinados a investigar y la manipulación de aprendizaje DG-dependiente, por ejemplo, el uso de agentes farmacológicos.

El cruzamiento de las IkB / - líneas de ratones transgénicos y TTA conduce a la inhibición condicional de la actividad de NF-kappa B en el hipocampo. Para investigar la expresión de la IκBα-AA1-transgén en el ratón transgénico doble (Figura 1A), se aislaron, cryosectioned y se tiñeron utilizando un anticuerpo frente a GFP (proteína verde fluorescente) cerebros. Microscopía confocal de barrido láser reveló una alta expresión del transgén en las regiones CA1 y...

Se describen métodos para la manipulación y análisis de NF-kappa B dependiente de neurogénesis en el hipocampo adulto. Un protocolo detallado se presenta para una prueba de comportamiento circunvolución dentada-dependiente (denominado el patrón espacial de separación-Barnes laberinto) para la investigación de resultado cognitivo en ratones. Esta técnica también debería ayudar a permitir investigaciones en otros parámetros experimentales.

Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar la función del factor de transcripción NF kappa B en el cerebro adulto. Esto se logra mediante la cría inicial de ratones transgénicos que inhiben específicamente la actividad de NF kappa B en las neuronas. El segundo paso del procedimiento es probar las consecuencias conductuales de la inhibición de NF kappa B utilizando el patrón espacial, separación o graneros, laberinto.El tercer paso es la profusión cuidadosa de los animales, la extracción de los cerebros y la sección adecuada de los mismos. El paso final es analizar los efectos histológicos y estructurales, como la visualización de proyecciones de fibras musgosas mediante inmunotinción. En última instancia, el uso de la prueba de comportamiento seguida de histología puede correlacionar cambios en el aprendizaje dependiente del giro dentado con cambios estructurales en los tejidos asociados.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como Mars Vase es que los lazos de separación de patrones espaciales MA ofrecen la oportunidad de medir específicamente los procesos de aprendizaje anti dependencia del niño, así como la neurodegeneración y regeneración

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una manera de estudiar la integración de los recién nacidos las células granulares dentadas en los animales adultos se describe. Esta técnica utiliza un retrovirus modificados para etiquetar las neuronas recién nacidas, seguido por los registros electrofisiológicos para determinar la integración funcional en vivo.

El estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas

La función de las neuronas de mamíferos adultos nacidos sigue siendo un área activa de investigación. La radiación ionizante inhibe el nacimiento de nuevas neuronas. Usando el ordenador guiada por tomografía irradiación focal (CFIR), la orientación anatómica tridimensional de poblaciones específicas progenitoras neurales ahora se puede utilizar para evaluar el papel funcional de la neurogénesis adulta.

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

La migración de los neuroblastos es un paso crucial en la neurogénesis postnatal. El protocolo se describe aquí se puede utilizar para investigar el papel de los reguladores candidatos de la migración de los neuroblastos mediante el empleo de ADN / ARN de horquilla pequeña (shRNA) nucleofection y un ensayo de migración de neuroblastos 3D con aislados de la corriente migratoria rostral posnatal roedor.

Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast<em&gt; In vitro</em

Este artículo de video ilustra un protocolo completo para detectar y cuantificar todas las etapas de la neurogénesis del hipocampo adulto dentro de la misma sección de tejido. Elaboramos un método para superar las limitaciones de la inmunofluorescencia múltiple indirecta que surgen cuando no se dispone de anticuerpos adecuados de diferentes especies de huéspedes.

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Se describe un protocolo de inmunohistoquímica para estudiar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. Este protocolo se puede aplicar a ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

Aquí describimos un procedimiento basado en el uso de partículas lentivirales para la modificación genética a largo plazo de células madre neurales y/o sus células ependimarias adyacentes en el nicho neurogénico ventricular-subventricular adulto que permite el análisis por separado de los efectos autónomos y no autónomos, dependientes del nicho, sobre las células madre neurales.

Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.

Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Aquí se presenta un método para secuenciar núcleos individuales aislados del giro dentado de ratón que excluye la mayoría de las neuronas a través de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FAN). Este enfoque genera perfiles de expresión de alta calidad y facilita el estudio de la mayoría de los otros tipos de células representadas en el nicho, incluidas las poblaciones escasas, como las células madre neurales.

Clasificación negativa de neuronas de núcleos activados por fluorescencia combinada con secuenciación de ARN de núcleos únicos para estudiar el nicho neurogénico del hipocampo

Aquí, describimos un sistema de nucleofección diseñado para mejorar la eficiencia de la entrega de genes en células madre neurales expandidas (NSC) aisladas de la zona subventricular murina adulta. Los hallazgos demuestran que este método mejora significativamente la perturbación génica en las NSC, superando la efectividad de los protocolos tradicionales de transfección y mejorando la tasa de supervivencia celular.

Aislamiento, expansión y nucleofección de células madre neurales de la zona subventricular murina adulta

Los ensayos de excrecencia de neuritas proporcionan un valor cuantitativo sobre los procesos neuronales regenerativos. La ventaja de este software semiautomático es que segmenta los cuerpos celulares y las neuritas por separado mediante la creación de una máscara y mide varios parámetros, como la longitud de las neuritas, el número de puntos de ramificación, el área del grupo de cuerpos celulares y el número de grupos celulares.

Estandarización de un novedoso software semiautomático para la medición del crecimiento de neuritas 

Aprende a modular y analizar la neurogénesis adulta dependiente de NF-κB en ratones mediante el laberinto de Barnes para separación espacial. Este protocolo integra pruebas conductuales con análisis histológico de proyecciones de fibras musgosas.

Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta

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