Name: Métodos para identificar las resonancias de RMN de la amina 13C-dimetilN-terminal en proteínas metiladas reductivamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Aprende a asignar las resonancias de RMN de dimetilaminas α y ε en lisina N-terminal de lisozima mediante metilación reductiva selectiva por pH y degradación con aminopeptidasa.

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Esta investigación fue apoyada por el Premio Número R00RR024105 del Centro Nacional de Recursos de Investigación del Instituto Nacional de Salud.

1. Metilación reductiva de la lisozima
<ol>
	<li>Preparar 500 ml de un tampón de fosfato sódico de 50 mM a pH 7,5. Almacene a temperatura ambiente.</li>
	<li>Etiquete tres tubos de microcentrífuga de 1 ml para muestra completamente marcada (FLS), muestra parcialmente marcada (LpH) de pH bajo y muestra parcialmente marcada con pH alto (HpH).</li>
	<li>Pesar 10 mg de lisozima y disolver en 2 ml de tampón de fosfato de sodio para crear una solución acuosa con una concentración de 5 mg/ml. Cubra los tubos con papel de aluminio para proteger el formaldehído de la degradación debida a la exposición a la luz. Añadir 500 μl de solución de lisozima a cada tubo.</li>
	<li>Prepare soluciones frescas de 1,0 M de complejo de dimetilamina borono (DMAB) y 13C-formaldehído. Conservar a 0 °C.</li>
	<li>Para la muestra completamente marcada, use una proporción molar de 1:10 (amina reactiva: formaldehído), y para las muestras parcialmente marcadas, use una proporción de 1:5. Alternativamente, se puede optimizar la relación. Por ejemplo, para ver el pico de dominancia de la α-13C-dimetilamina a pH bajo, se requirió una proporción de 2:7.</li>
	<li>Añadir 6,1 μl de DMAB de 1,0 M al FLS, añadir 3,2 μl de DMAB de 1,0 M al LpH y al HpH, y vórtice suavemente. A continuación, añada 12,3 μl de 1,0 M 13C-formaldehído al FLS y 6,1 μl de 1,0 M 13C-formaldehído al LpH y al HpH. Agite las mezclas de reacción a 4 °C durante 2 horas.</li>
	<li>Añadir otra alícuota de 1,0 M DMAB y 13C-formaldehído como en el paso anterior y agitar la mezcla de reacción durante la noche a 4 °C para un tiempo de reacción total de 18-24 horas.</li>
	<li>Cambie el tampón de la muestra por fosfato a pH 7,5 para eliminar el exceso de reactivos y productos secundarios mediante un filtro centrífugo (corte de peso molecular de 3 kDa).</li>
	<li>Para las muestras parcialmente marcadas, metilar las muestras a pH 7,5 con formaldehído de abundancia natural para crear una proteína modificada homogéneamente. Prepare nuevas soluciones 1.0 M de DMAB y formaldehído de abundancia natural.</li>
	<li>Cubra los tubos de muestra con papel de aluminio, agregue 6,1 μl de DMAB al LpH y HpH, y haga un vórtice suave. A continuación, añada 12,3 μl de formaldehído de abundancia natural. Agitar las mezclas de reacción a 4 °C durante 2 horas.</li>
	<li>Añadir otra alícuota de 1,0 M de DMAB y formaldehído de abundancia natural como en el paso anterior y agitar las mezclas de reacción durante la noche a 4 °C para un tiempo de reacción total de 18-24 horas. A continuación, realice el intercambio tampón utilizando los pasos 2.5-2.6 y almacene muestras de 50 μg a -20 °C para MS.</li>
</ol>
2. Preparar la muestra para el análisis de RMN
<ol>
	<li>Prepare una solución tampón de borato de sodio 2.0 M a pH 8.5 en H2O.</li>
	<li>Añadir 375 μl de solución tampón de borato sódico 2,0 M a cuatro tubos cónicos de 15 ml. Parafilma la parte superior y haz agujeros. Coloque el matraz en un matraz liofilizador y congele la muestra.</li>
	<li>Coloque la muestra congelada en un liofilizador para que se seque. Retirar cuando esté seco.</li>
	<li>Con una pipeta, añadir 15 ml deD2O a cada tubo y mezclar.</li>
	<li>Etiquete tres filtros centrífugos de 4 ml (corte de peso molecular de 3 kDa) con FLS, LpH y HpH. Agregue la muestra correspondiente a los tubos del filtro (~500 μl). Añadir 3,0 ml de tampón de borato de sodio de 50 mM a pH 8,5 a cada tubo. Haga un tubo de equilibrio para el tercer tubo y concentre las muestras a 500 μl utilizando una centrífuga con un rotor de ángulo fijo de 35° a 4 °C y 7.500 rcf.</li>
	<li>Vacíe la trampa debajo de cada filtro. Añada otros 3,0 ml de tampón a las muestras y concéntrelas de nuevo a 500 μl. Repita el paso 2.5 4 veces.</li>
	<li>Utilizando el ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA)36, determine la concentración de cada muestra. Diluya las muestras de lisozima con 50 mM de tampón de borato de sodio para hacer muestras de 150 μM.</li>
	<li>Transfiera 530 μl a un tubo de RMN de 5 mm o 250 μM a un tubo de susceptibilidad magnética de 5 mm.</li>
	<li>Prepare una solución madre de 80 mM de 1,2-dicloroetano-13 C 2 en D2O. Almacene esta solución madre a -80 °C. Diluya a 24 mM en 80 μl y transfiérala a un tubo de inserción coaxial para utilizarla como referencia en el análisis de RMN. Analice las muestras con RMN. Nota: Ejecute un HSQC 1D 1 H-13C e integre las áreas de pico para cada resonancia. Las áreas de los picos deben ser las mismas para la muestra completamente etiquetada.</li>
</ol>
3. Degradación de la aminopeptidasa de la lisozima
<ol>
	<li>Prepare una solución de 5 mg/ml de lisozima en agua ultrapura.</li>
	<li>Añadir 250 μl de la solución de lisozima a un tubo de centrífuga limpio de 1 ml.</li>
	<li>Añadir 25 μl de una solución de tricina 0,1 M, pH 8,0, y 6 μl de una solución de 2,16 μg/ml de Aeromonas proteolytica aminopeptidasa.</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 6 horas.</li>
	<li>Añadir 6 μl adicionales de la solución de aminopeptidasa de 2,16 μg/ml a la muestra para obtener una proporción molar de 1:50 de aminopeptidasa a lisozima. Incubar durante 20 horas adicionales a 37 °C.</li>
	<li>Desala 30 μl de la muestra utilizando una columna de centrifugación C18 (siga el protocolo del fabricante). Almacenar a -20 °C para el análisis MALDI MS.</li>
	<li>Prepare la muestra de proteína restante para la RMN como se describe en el protocolo 2).</li>
</ol>
4. Preparar muestras para espectrometría de masas
<ol>
	<li>Utilizando los 50 μg de muestra reservados en el paso 2.3, cambie el tampón a 100 mM de bicarbonato de amonio, pH 8,0, y concéndalo a aproximadamente 50 μl utilizando un filtro centrífugo de 1 ml (corte de peso molecular de 3 kDa). Transfiera la muestra a un tubo de centrífuga de 1 ml y envuélvala en papel de aluminio.</li>
	<li>Añadir 2,0 μl de 500 mM de ditiotreitol para reducir los enlaces disulfuro. Incubar la solución a 60 °C durante 1 hora.</li>
	<li>Añadir 2 μl de yodoacetamida 500 mM recién preparado para alquilar los grupos tiol. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.</li>
	<li>Retire el papel de aluminio y agregue 1,0 μl de la solución de ditiotreitol de 500 mM para apagar la reacción.</li>
	<li>Agregue 2.0 μg de tripsina de grado de secuenciación para digerir la proteína. Incubar la mezcla a 37 °C durante 16-24 horas.</li>
	<li>Agregue TFA hasta que el pH sea inferior a 2 para saciar la digestión. (También se pueden usar ácidos fórmico y acético)</li>
	<li>Desala la muestra en una columna de centrifugación C18 y eluye la proteína en acetonitrilo al 80%/TFA al 0,1%. Seque la muestra con un concentrador de vacío.</li>
	<li>Reconstituya la muestra en 5,0 μl de acetonitrilo al 50%/TFA al 0,1% para el análisis de MS de MALDI. Mezcle volúmenes iguales de la muestra reconstituida y una solución saturada de solución de matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico en la placa objetivo MALDI. Analice las muestras en un MALDI MS. Nota: Utilice el MS en tándem para confirmar la identidad de los picos peptídicos. Suavizar los espectros de masas y analizar. Para cada péptido que contenga dimetilamina, determine la intensidad máxima y el área máxima de cada isótopo en el perfil. Calcule el porcentaje de incorporación de 13C como se describió anteriormente34.</li>
</ol>

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Es necesario asignar las señales de RMN de 13proteínas C metiladas de forma reductiva para utilizar completamente este método de etiquetado isotópico. El uso de MS para ayudar en la asignación de las señales de RMN a través de la correlación de los datos parciales de incorporación de 13C es una técnica prometedora. La ventaja de esta técnica sobre otros métodos de asignación es que solo se necesita la secuencia primaria de aminoácidos. El método de asignación asistida por MS está limitado cuando el ...

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es una valiosa herramienta de elucidación de estructuras para proteínas1. La espectroscopia de RMN se puede utilizar para determinar la estructura de la solución de una proteína en su estado nativo. Para superar la baja abundancia natural de isótopos magnéticos estables, es necesario incorporar 13C y 15N a la proteína de interés. El método más común empleado es la expresión recombinante en un huésped bacteriano2-3. Sin embargo, dos desventajas de la sobreexpresión del huésped bacteriano son que no puede producir modificaciones postraduccionales y no funciona para todas las proteínas3-4. Cuando la expresión bacteriana no es una ruta viable para la producción de proteínas, se puede utilizar la sobreexpresión en huéspedes no bacterianos, pero el marcaje isotópico es difícil y costoso5. Los métodos de expresión alternativos para incorporar isótopos 13C y 15N en proteínas para el análisis de RMN incluyen técnicas de marcaje dispersas que utilizan precursores metabólicos para el marcaje de metilo6 y aminoácidos individuales 13C, 15N7-9. Un enfoque químico para el marcaje disperso utilizado en este documento es la reacción reductiva de metilación de 13C bien establecida (Figura 1), donde los grupos amino primarios de una proteína, la α-amina N-terminal y la lisina, ε-aminas de cadena lateral) se metilan. Una vez que se forman las monometilaminas, la amina vuelve a sufrir fácilmente metilación, debido al mayor valor de pKa, para formar dimetilaminas.
La metilación reductiva se introdujo por primera vez como un método para modificar químicamente proteínas por Means y Feeney10. Las ventajas de esta reacción son su amplia aplicabilidad y las condiciones de reacción suaves a pH fisiológico tamponado y bajas temperaturas11,12. En presencia de formaldehído y un agente reductor, como el complejo de dimetilamina borano (DMAB), los grupos ε-amino lisina y el grupo α-amino N-terminal se metilan selectivamente para producir aminas dimetilados. Aunque se sabe que el formaldehído entrecruza proteínas a través de la formación de puentes de metileno, este proceso es bloqueado por el agente reductor13,14.
La metilación reductora se ha utilizado con éxito para estudiar proteínas tanto con RMN como con cristalografía de rayos X. La metilación reductora se utiliza para facilitar la cristalización de proteínas que de otro modo serían intratables15. La lisozima de clara de huevo de gallina fue la primera proteína cristalizada en su forma dimetila. La diferencia cuadrática media entre los átomos pesados en las estructuras de lisozima metilada y no metilada es de 0,40 Å16. Esta comparación demuestra que la estructura de la proteína se puede mantener después de la metilación reductora, lo que convierte a la reacción en una herramienta de etiquetado viable para la elucidación de la estructura.
Al utilizar 13formaldehído marcado con C en la reacción de metilación reductora, se producen 13aminas C-dimetiladas. Las 13C-dimetilaminas son sondas detectables por RMN que se han utilizado ampliamente para estudiar la dinámica, la estructura y la función de las proteínas. La RMN y la metilación reductora de 13C se han utilizado para estudiar las interacciones proteína-ligando y proteína-proteína para el receptor adrenérgico β2 17, la ribonucleasa A18, la lisozima19, la proteína20 del gen fd 5 y el citocromo c21. Del mismo modo, se han estudiado las propiedades estructurales y funcionales de la ribonucleasa A22 (13 C-metilada) reductivamente (13), la lisozima23, la proteína24 del gen fd 5, la ferredoxina25 de Clostridium pasteurianum, el fragmento Fc de IgG26, la apolipoproteína A-I27 y la MIP-1α28.
A pesar de que la metilación reductiva de 13C se ha utilizado ampliamente para estudiar proteínas con RMN, el método de marcaje siempre ha estado limitado por las dificultades de asignar las resonancias de RMN26. La mayoría de las estrategias de asignación para proteínas 13C-metiladas reductivamente se han basado en un pequeño número de sitios,20,28 propiedades estructurales conocidas11,19,23,26,31,32. o modificaciones genéticas extensas33. Ninguno de estos estudios asignó con éxito todos los 13picos de C-dimetilamina, excepto el estudio de calmodulina, donde los picos se asignaron mediante mutagénesis dirigida al sitio de cada lisina33. En el estudio de la formación de dímeros MIP-1α, se informó por primera vez del uso de la espectrometría de masas (MS) para ayudar en la asignación de RMN de 13aminas C-metiladas de forma reductiva28. Se utilizó el MS de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) para identificar la lisina en la interfaz del dímero. Las lisinas parcialmente metiladas de los péptidos trípticos MIP-1α humanos se identificaron con MS y se correlacionaron con la aparición de señales de mono y dimetilamina de la proteína intacta observadas en los espectros 28 28 de RMN2D 1 H-13C HSQC. Nuestro grupo amplió el uso de la EM y presentó un método de asignación que no requiere ningún conocimiento previo de la estructura o las propiedades de la proteína, aparte de la secuencia de aminoácidos34. Este método es aplicable a la mayoría de las proteínas. Una excepción es cuando una proteína tiene una lisina N-terminal porque el perfil isotópico MS de las α- y ε-13C-dimetilaminas de lisina N-terminal no se puede medir de forma independiente.
Aquí presentamos dos métodos, uno químico y otro enzimático, para identificar los sitios N-terminales de α-dimetilamina y los sitios de cadena lateral ε-dimetilamina de un residuo de lisina N-terminal. El primer método se inspiró en Córdova et al.que utilizaron el pH para controlar la selectividad de la acetilación de proteínas35. La reacción favorece la α-amina N-terminal a pH bajo y la cadena lateral ε-aminas a pH alto, permitiendo distinguir los grupos α y ε-amino de las proteínas, en sus estudios, con electroforesis capilar35. Demostramos cómo se utiliza el pH alto y bajo para alterar el marcaje de los grupos amino proteicos utilizando la reacción reductora de metilación 13C y para permitir la aplicación de la estrategia de asignación asistida por MS. El segundo método para asignar las N-terminales α- y ε-13C-dimetilaminas aprovecha la eliminación selectiva de los residuos N-terminales utilizando Aeromonas proteolytica aminopeptidasa recombinante.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Filtro centrífugo de 4 ml (3k MWCO)</td><td>Fisher Scientific UFC800308</td><td>(8pk)</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidasa</td><td>Creative Biomart</td><td>Aminopeptidasa-86A</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Complejo de borano-dimetilamina</td><td>Sigma 180238</td><td></td><td>Prepare una solución fresca de 1 M antes de usar.</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Insulina de páncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 Columnas de centrifugado</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dicloroetano-13C2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>Solución madre de 80 mM almacenada a -80 &deg;C. Utilizada como referencia en espectros de RMN a 24 mM.</td></tr><tr><td>Formaldehído (36.5% wt/wt)</td><td>Sigma</td><td>33220</td><td>Prepare una solución fresca de 1 M antes de usar.</td></tr><tr><td>13C-formaldehído (99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-806-1</td><td>Prepare una solución fresca de 1 M antes de usar.</td></tr><tr><td>Lisozima (clara de huevo de gallina)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio (heptahidrato dibásico)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio (monobásico)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Tricina</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS con sonda HCN 5922 de 5 mm</td><td>Agilent Tecnologías</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para identificar las resonancias de rmn de la amina 13c-dimetiln-terminal en proteínas metiladas reductivamente

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica probada para estudios dinámicos y de estructura de proteínas. Para estudiar proteínas con RMN, los isótopos magnéticos estables se incorporan metabólicamente para mejorar la sensibilidad y permitir la asignación secuencial de resonancias. La metilación reductiva de 13C es un método de etiquetado alternativo para proteínas que no son susceptibles a la sobreexpresión del huésped bacteriano, el método más común de incorporación de isótopos. La metilación reductiva de 13C es una reacción química realizada en condiciones suaves que modifica los grupos amino primarios de una proteína (grupos ε-amino lisina y el grupo α-amino N-terminal) a 13grupos C-dimetilamino. La estructura y función de la mayoría de las proteínas no se ven alteradas por la modificación, lo que la convierte en una alternativa viable al marcaje metabólico. Debido a que la metilación reductiva de 13C agrega etiquetas isotópicas dispersas, los métodos tradicionales de asignación de las señales de RMN no son aplicables. Se ha desarrollado un método de asignación alternativo que utiliza espectrometría de masas (MS) para ayudar en la asignación de señales de RMN de proteína 13C-dimetilamina. El método se basa en cantidades parciales y diferentes de 13C-marcaje en cada grupo de aminoácidos primarios. Una limitación del método surge cuando el residuo N-terminal de la proteína es una lisina porque los grupos α y ε-dimetilamino de Lys1 no se pueden medir individualmente con MS. Para eludir esta limitación, se describen dos métodos para identificar la resonancia de RMN de las 13C-dimetilaminas asociadas tanto con la α-amina N-terminal como con la ε-amina de cadena lateral. Las señales de RMN de la α-dimetilamina N-terminal y la ε-dimetilamina de cadena lateral de la lisozima de clara de huevo de gallina, Lys1, se identifican en espectros de coherencia cuántica simple heteronuclear 1 H-13C.

Metilación reductiva y pH
Se ha demostrado una reacción quimioselectiva de metilación reductiva inducida por pH con 13C en la lisozima. A pH bajo, la reacción prefiere la α-amina del extremo N-terminal sobre las ε-amino de las cadenas laterales, y viceversa a pH alto. En solución, los grupos amino de la proteína existen en equilibrio entre la amina libre y su ácido conjugado, equilibrio que puede ajustarse mediante el pH. El rango óptimo de pH para esta reacción depende del ag...

Se describen dos métodos para asignar las señales de resonancia magnética nuclear de α y ε-dimetilamina de una lisina N-terminal reductivamente metilada con 13C. Un método utiliza la selectividad inducida por el pH de la reacción de metilación reductora, y el otro utiliza la aminopeptidasa para eliminar selectivamente la lisina N-terminal.

Métodos para identificar las resonancias de RMN de la amina 13C-dimetilN-terminal en proteínas metiladas reductivamente

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

El objetivo general de este procedimiento es asignar la resonancia NMR de la lisina terminal alfa y épsilon carbono. 13 dimetilamina de la lisina terminal, residuo de la lisozima. Esto se logra primero metilando reductivamente la lisozima a pH bajo y alto, con una cantidad subgeométrica de formaldehído de carbono 13.El segundo paso es metilar de forma reductiva las muestras de pH bajo y alto con exceso de abundancia natural para que el formaldehído complete la metilación. El paso final es intercambiar las muestras metiladas reductivamente en tampón D dos O para el análisis de RMN. En el segundo método, el objetivo se logra mediante la degradación de la aminopeptidasa de una muestra de lisozima.El segundo paso es metilar de forma reductiva la muestra de proteína truncada con exceso de formaldehído de carbono 13, seguido de un intercambio de tampones para el análisis de RMN. En última instancia, la espectroscopia de RMN se utiliza para mostrar la ausencia de resonancia de metilo de carbono 13 para realizar asignaciones. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que permite la asignación inequívoca de las resonancias de dimetillamina alfa y SSON y ML de la lisina interna de una proteína. Etiquete tres tubos de microcentrífuga de un mililitro con F-L-S-L-P-H y HPH disuelva tres muestras de lisozima en una solución tampón previamente preparada a pH seis, 7.5, y 10 para dar una concentración final de cinco miligramos por mililitro.Cubra los tubos con papel de aluminio para protegerlos de la degradación debido a la exposición a la luz. A continuación, agregue 6,1 microlitros de una solución compleja de perforación de dimetilamina molar previamente preparada al tubo FLS y 3,2 microlitros de la misma solución a los tubos LPH y HPH. Después de vorexionar suavemente las mezclas, agregue 12,3 microlitros de una solución de carbono 13 molar y formaldehído previamente preparada a la muestra FLS y 6,1 microlitros de la misma solución a las muestras L-P-H-N-H-P-H.Agitar las mezclas de reacción a cuatro grados centígrados durante dos horas. Repita los pasos anteriores añadiendo las mismas alícuotas de DMAB y formaldehído de carbono 13 a los tubos correspondientes. Agitar las mezclas de reacción durante la noche a cuatro grados centígrados durante un tiempo de reacción total de 18 a 24 horas, después de agitar cambiar el tampón de cada muestra por tres mililitros de tampón de fosfato a pH 7,5 para eliminar el exceso de reactivos y productos secundarios utilizando un filtro centrífugo a un corte de peso molecular de tres kilodalton, concentrar las muestras a 500 microlitros utilizando una centrífuga con un rotor de ángulo fijo de 35 grados a cuatro grados Celsius y 7, 500 RCF.Repita los pasos anteriores dos veces después de esto. Cubra los tubos de muestra parcialmente etiquetados con papel de aluminio y agrégueles 6,1 microlitros de una solución de DMAB de un molar recién preparada. Después de que las muestras hayan sido vertiginosas, agregue 12.3 microlitros de una solución de formaldehído de abundancia natural recién preparada para un molar a los tubos.Agitar las mezclas de reacción a cuatro grados centígrados durante dos horas. Agregue las mismas alícuotas de DMAB y formaldehído de abundancia natural que en el paso anterior, y agite las mezclas de reacción durante la noche a cuatro grados Celsius para un tiempo de reacción total de 18 a 24 horas después del intercambio de tampón con tampón de fosfato de sodio de 50 milimolares. Transfiera 10 alícuotas de microlitros de cada muestra a tubos de microcentrífuga limpios y almacene las muestras a menos 20 grados Celsius para el análisis MALDI MS.A continuación, agregue 375 microlitros de una solución tampón de borato de sodio de dos molares previamente preparada a cuatro tubos cónicos de 15 mililitros. Para filmar la parte superior de los tubos y hacer agujeros a través de la película para. Coloque los tubos en un matraz liofilizado y congele la muestra.Una vez congeladas las muestras, se coloca un matraz en un liofilizador para que se seque, después de retirar la muestra de la pipeta liofilizadora 15 mililitros de D dos O a cada tubo y se mezclan siguiendo esta etiqueta, tres tubos cónicos de cuatro mililitros que contienen filtros centrífugos con F-L-S-L-P-H y HPH. Agregue aproximadamente 500 microlitros de cada muestra a los tubos de filtro correspondientes. Luego agregue tres mililitros de tampón de sodio de 50 milimolares.Agregue pH 8.5 a cada tubo. Concentre las muestras en 500 microlitros utilizando una centrífuga con un rotor de ángulo fijo de 35 grados a cuatro grados Celsius y 7.500 RCF. Después de vaciar la trampa debajo de cada filtro, agregue otros tres mililitros de tampón a las muestras y concéntrelas en 500 microlitros.Repita los pasos anteriores cuatro veces utilizando el ensayo de proteína de ácido bissy. Determine la concentración de cada muestra. Diluir las muestras de lisozima con tampón de vacío de sodio de 50 milimolares para obtener una concentración final de 150 micromolares.A continuación, transfiera 530 microlitros de cada muestra a un tubo de RMN de cinco milímetros. A continuación, prepare una solución madre de 80 milimolares de carbono 13 marcada con dos DI CLORO etano en D, dos O. Diluya la solución a 24 milimolares con D, dos O y luego transfiérala a un tubo de inserción coaxial para utilizarla como referencia de RMN. Después de ejecutar un protón 1D de carbono H-S-Q-C-N-M-R integre las áreas de pico para cada resonancia.Prepare una solución de cinco miligramos por mililitro de lisozima en agua ultrapura. Transfiera 250 microlitros de la solución de lisozima a un tubo de centrífuga limpio de un mililitro. A continuación, añadir 25 microlitros de una solución de 0,1 molar a un pH de ocho y seis microlitros de un dos coma 16 microgramos por mililitro.Una solución de aminopeptidasa proteolítica romanis al tubo de centrífuga. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante seis horas. Después de la incubación, agregue seis microlitros adicionales de la solución de aminopeptidasa a la muestra para obtener una proporción de uno a 50 molares de aminopeptidasa para incubar durante 20 horas adicionales a 37 grados Celsius.A continuación, DESALT 30 microlitros de la muestra utilizando una columna de centrifugación C 18 y eluir la muestra en un ensayo de 80% de ACEDONITA por 0,1%TFA, almacene la muestra a menos 20 grados centígrados. Para el análisis de MS maldi, prepare la muestra de proteína restante para la RMN como se describió anteriormente, Se ha demostrado una reacción de metilación de carbono 13 reductora selectiva de quimioterapia inducida por pH en lisozima a pH bajo. La reacción prefiere la amina alfa terminal final sobre la amina épsilon de cadena lateral y viceversa a pH alto, como se ilustra en los espectros de RMN aquí.El pico siete está ausente para la muestra de lisozima reaccionada a pH 10, lo que indica que los picos uno a seis pertenecen a los grupos épsilon dimetil amino y el pico siete es el grupo alfa dimetil amino terminal. Alpha Amin favorecía el carbono reductivo. Se observó metilación de 13 a pH seis cuando la cantidad de formaldehído de carbono 13 utilizada se redujo a una proporción molar de dos a siete, y la muestra no reaccionó más con formaldehído de abundancia natural como se ilustra aquí, la metilación a pH bajo es una mezcla de monometilaminas y dimetilaminas.Tres grupos amino muestran la metilación diminu del carbono 13, lo que indica que estos grupos reaccionaron más rápido que los grupos que muestran carbono. 13 monometilo de las tres dimetilaminas de carbono 13. El pico siete tiene la intensidad más alta y se asignó como el grupo alfa dimetil amina N, lo que corrobora la asignación del pico siete.El uso de la muestra reaccionó a pH alto con la capacidad de alterar la tasa de metilación reductora del grupo alfa amino terminal N. Se puede aplicar el método asistido por EM para asignar al residente de RMN. La muestra de lisozima que fue metilada reductivamente con carbono 13 a pH 10 fue digerida con tripsina y analizada con maldi TOF MS porque el grupo alfa amino no fue metilado reductivamente con carbono 13.En estas condiciones, el perfil isotópico MS del péptido N terminal tetrametilado se puede utilizar para cuantificar el porcentaje de carbono 13 incorporado en el grupo dimetil amino épsilon terminal N. El péptido terminal N metilado con DIM marcado con carbono 13 6 6 2 dio un porcentaje escalado de carbono. 13 incorporación del 27%El análisis de RMN de la misma muestra de lisozima dio un porcentaje de incorporación de carbono 13 del 33% para el pico seis, lo que indica que el pico seis es el final terminal de lisina épsilon carbono 13 dimetilamina Maldi, los espectros de masas TOF de muestras de lisozima no tratadas y tratadas con aminopeptidasa se muestran aquí.La insulina, que se utilizó como control positivo, muestra un cambio a una relación de carga maestra promedio más baja en comparación con su forma nativa de 5731.2. La lisozima tratada muestra un cambio de 14305.8 a 13930.5, lo que corresponde a la pérdida de los tres primeros residuos terminales terminales finales de lisozima, lisina, valina y fenilalanina. Aquí se muestran los espectros de RMN de las muestras de lisozima metilada de carbono 13 no tratadas y tratadas con aminopeptidasa reductivamente en comparación con el espectro controlado, el espectro de la muestra tratada con aminopeptidasa muestra una disminución en la intensidad para los picos seis y siete y un pico adicional marcado como siete A A partir de estos datos, los picos seis y siete se pueden asignar por pares como lisina, alfa y épsilon dimetilamina.Antes de intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta la solubilidad de la proteína, los distintos ph y ajustar el protocolo en consecuencia.

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Química

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