El uso de escáneres planos para recopilar de alta resolución de duración transcurrido Imágenes de la gravitrópica Respuesta Arabidopsis Root
25 de enero de 2014
Este protocolo describe un proceso para la toma rápida de imágenes de plantas de semillero de Arabidopsis en respuesta a un estímulo de gravedad, utilizando escáneres planos disponibles en el mercado. El método permite barato, la captura de grandes volúmenes de imágenes de alta resolución susceptibles de algoritmos de análisis de aguas abajo.
El objetivo general de este video es ilustrar un método basado en escáner para la captura de imágenes de alta resolución de la respuesta del trópico radicular en la opsis de la planta modelo. Para comenzar este protocolo, las semillas del stock de semillas designado se plantan en placas de Petri que contienen un medio transparente Después de que las semillas hayan germinado durante el período de tiempo designado, las placas de Petri se retiran de la cámara de crecimiento, se preparan para el escaneo y luego se colocan en escáneres planos orientados verticalmente. Luego, las placas se giran 90 grados y se escanean durante un período de tiempo designado.
Las imágenes se guardan en el ordenador o en un dispositivo de almacenamiento de datos y se utilizan posteriormente para el procesamiento de imágenes. Antes de la adquisición de la imagen, prepare placas de aga que contengan los dos tejidos vegetales escaneados B. Primero, absorba la condensación acumulada en la tapa y los lados de la placa AGA con una toallita kim.
A continuación, aplique una cantidad generosa de Triton X 100 para evitar futuras condensaciones. Finalmente, termine este proceso envolviendo la placa con cinta adhesiva de microporos para asegurar la tapa y permitir que la ventilación comience la adquisición de imágenes. Configure carpetas para guardar las imágenes en la ubicación deseada.
Cada nombre de carpeta consta de una compilación de metadatos que se relacionan con la información que se va a analizar. En este ejemplo, la antigüedad, el tamaño y el stock de semillas de id únicos eran datos incluidos en los nombres de las carpetas. A continuación, estos metadatos se pueden copiar y pegar en un nombre de carpeta.
Este protocolo supone que se está utilizando más de un escáner para recopilar imágenes y proporciona instrucciones para conectar varios escáneres a un ordenador. Por esta razón, se configuran tres carpetas para guardar imágenes. El siguiente paso es configurar los temporizadores para una hora de recolección designada.
Dado que todavía hay bastante preparación por hacer en este punto, asegúrese de configurar los temporizadores para un poco más de tiempo. A continuación, encienda el primer escáner y abra el programa de escaneo de vista. En la pestaña de entrada, establezca la fuente en el escáner correcto y el cuadro desplegable de repetición automática en ninguno en la pestaña de recorte.
Establezca el área de vista previa en Máximo y presione vista previa. Elija un cuadro de recorte que capture la región de interés y establezca el área de vista previa en cuadro de recorte. A continuación, vuelva a obtener una vista previa de la imagen.
Para guardar los datos recopilados en la ubicación deseada, presione la pestaña de salida y busque los nombres de carpeta creados anteriormente que corresponden a cada escáner. Encienda el siguiente escáner y repita el escaneo de vista. Configure las instrucciones para los otros dos escáneres, asegurándose de elegir las carpetas correctas en las que guardar los datos.
También es importante revisar cada pestaña y asegurarse de que todos los ajustes del escáner sean los deseados. Nuestro laboratorio ha descubierto que los siguientes ajustes funcionan mejor para el tipo de recopilación de imágenes que se está realizando. Sin embargo, los diferentes tipos de recopilación de imágenes pueden requerir otros ajustes.
Una vez que todas las configuraciones estén marcadas, elija la pestaña de entrada y establezca el cuadro desplegable de repetición automática en continuo en los tres escáneres. Coloque las placas preparadas en los escáneres con las plántulas orientadas horizontalmente y coloque temporalmente el lado de fieltro del fondo contra las placas para garantizar la estabilidad en el escáner. Si realiza este protocolo con un compañero, haga que una persona gire las placas 90 grados e inmediatamente sienta el fondo vidente, la otra persona presiona el botón de escaneo y ambos aseguran el fondo al escáner con una cuerda elástica.
Repite este proceso para los escáneres dos y tres. Cada imagen debería tardar entre dos y tres minutos en escanearse por completo. Las imágenes finales aparecerán como se muestra. Es una buena idea comprobar las carpetas en las que se guardan las imágenes para asegurarse de que todas se guardan correctamente.
Lo ideal es mantener los escáneres en un área que esté libre de perturbaciones durante el tiempo de escaneo designado. También es prudente tener en cuenta las condiciones ambientales en el área de escaneo para garantizar respuestas fenotípicas ideales. Las siguientes imágenes son ejemplos de las recopiladas mediante el método descrito en este vídeo.
Los paneles A y B y C y D son las primeras y últimas imágenes de un solo período de escaneo. A y B muestran el área escaneada completa. Si bien C y D son una región recortada del área escaneada que muestra una sola placa, se pueden observar varias inconsistencias.
La Figura A muestra la variación en la germinación y en la trayectoria de crecimiento. La imagen B muestra que las placas pueden acumular condensación, mientras que las imágenes C y D se consideran buenos resultados debido al crecimiento robusto de las plántulas y la calidad de la imagen durante toda la tirada. El procedimiento descrito en este artículo encaja en su propio nicho en el mundo de la obtención de imágenes de raíz, ya que es de alto rendimiento y alta resolución, a la vez que es relativamente asequible.
Un beneficio adicional de este enfoque es que se puede personalizar fácilmente para adaptarse a las necesidades de imágenes de un grupo de investigación en particular. El método también se está personalizando para la obtención de imágenes de otros.
Descripción general
Este protocolo describe un método para capturar imágenes de alta resolución de plántulas de Arabidopsis en respuesta a la gravedad utilizando escáneres de mesa. El enfoque es rentable y permite la obtención de un gran volumen de imágenes adecuadas para análisis posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vegetal
- Análisis de imágenes
- Respuesta tropica vegetal
Antecedentes
- Arabidopsis sirve como organismo modelo en la investigación vegetal.
- Comprender las respuestas de las raíces a la gravedad es fundamental para los estudios del desarrollo vegetal.
- Las técnicas de imagen de alta resolución mejoran la recopilación de datos para el análisis fenotípico.
- Los escáneres de mesa proporcionan una solución económica para la obtención de imágenes de alto rendimiento.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método basado en escáner para capturar las respuestas tropicas de las raíces.
- Facilitar la recopilación de imágenes para su posterior análisis.
- Proporcionar un protocolo de adquisición de imágenes personalizable para grupos de investigación.
Métodos Utilizados
- Las semillas germinan en medios transparentes en placas de Petri.
- Las placas se escanean utilizando escáneres planos orientados verticalmente.
- Varios escáneres pueden conectarse a un mismo ordenador para mayor eficiencia.
- Los ajustes de adquisición de imágenes se modifican para obtener resultados óptimos.
Resultados principales
- Las imágenes capturadas muestran variaciones en las trayectorias de germinación y crecimiento.
- Se observaron problemas de condensación en las placas, lo que afectó la calidad de las imágenes.
- Se obtuvieron imágenes de alta calidad, que demuestran un crecimiento vigoroso de las plántulas.
- El método permite un análisis de imágenes de alto rendimiento y personalizable.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un medio eficaz para obtener imágenes de las respuestas de las raíces.
- Es adaptable a diversas necesidades de imagen en entornos de investigación.
- El enfoque equilibra el costo y la eficiencia en la recolección de datos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen fenotípica de alta resolución de la respuesta gravitrópica de las raíces permite reducir riesgos mecanicistas en la validación temprana de objetivos para el descubrimiento de terapias basadas en plantas. Este enfoque de imágenes de bajo costo y alto rendimiento respalda la confianza predictiva en estudios de función génica al generar datos cuantitativos con intervalos de tiempo adecuados para tuberías de análisis de imágenes posteriores. El método aborda los desafíos de escalabilidad en la biología del descubrimiento, manteniendo al mismo tiempo la integridad de los datos para una continuidad traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición cuantitativa de las trayectorias de crecimiento radicular como lectura fenotípica de la función génica.
- Valor operativo: Proporciona una reducción del riesgo biológico mediante la captura de alto rendimiento de 216 respuestas individuales por día con una resolución de 4.800 ppp.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al generar abundantes datos de imágenes de calidad para aplicaciones de análisis de imágenes que aclaran las variaciones en las trayectorias de crecimiento.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados (plántulas de Arabidopsis en medios transparentes) para protocolos estandarizados y reproducibles de cribado de compuestos o genético.
- Valor operativo: Garantiza la disponibilidad del ensayo mediante la adquisición automatizada de imágenes con intervalos temporales cada pocos minutos, utilizando escáneres planos económicos.
- Valor de escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma y su adaptación entre diferentes grupos gracias al diseño personalizable del protocolo y a la conectividad de múltiples escáneres a un mismo ordenador.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor Translacional: Mantiene la continuidad del sistema relevante para la enfermedad desde el descubrimiento hasta la cuantificación fenotípica de la respuesta tropica de la raíz, un mecanismo conservado en organismos modelo.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Reduce la ambigüedad en la validación del objetivo mediante el aislamiento de la variable independiente (desplazamiento del vector gravitacional) y la medición de la variable dependiente (crecimiento correctivo) con alta resolución temporal.
- Confianza Predictiva: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar resultados cuantitativos que permiten el análisis estadístico de las variaciones en la germinación y en las trayectorias de crecimiento.
Integración de la canalización y del flujo de trabajo
Este método se integra en la continuación del descubrimiento, desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, al proporcionar datos fenotípicos cuantitativos estandarizados que orientan las decisiones de continuar o descartar en la validación temprana de dianas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la observación del crecimiento correctivo en raíces de plántulas desplazadas del alineamiento con el vector gravitacional.
- Tamizaje: Aporta estandarización y reproducibilidad al ensayo mediante la preparación controlada de placas (prevención de la condensación mediante Triton X-100 y cinta microporo) y protocolos consistentes para el guardado de imágenes.
- Análisis: Genera conjuntos de datos de imágenes cronológicas con resolución de 4.800 ppp, adecuados para mediciones cuantitativas de trayectorias de crecimiento y consistencia en la germinación.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar lecturas fenotípicas relevantes para enfermedades en un sistema modelo susceptible a perturbaciones genéticas y farmacológicas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad de imagen reutilizable y no como una técnica de un solo uso, gracias a su bajo costo, alto rendimiento y facilidad de personalización entre distintos grupos de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en la fenotipificación de la respuesta gravitrópica.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad logradas mediante protocolos automatizados de escaneo y nomenclatura de carpetas guiada por metadatos para la organización de datos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del proyecto, mayor eficiencia del capital y menor riesgo biológico en fases avanzadas mediante la reducción temprana del riesgo fenotípico utilizando imágenes de alta resolución y gran volumen.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, posibilitadas por abundantes datos de imágenes de calidad que respaldan aplicaciones de análisis de imágenes.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en biología vegetal y protocolos de adquisición de imágenes para el análisis de raíces de Arabidopsis.
- Los equipos necesarios incluyen escáneres planos orientados verticalmente, con capacidad de resolución de 4.800 ppp y conectividad a un solo ordenador para operación con múltiples escáneres.
- La estandarización entre equipos requiere una preparación consistente de las placas (control de condensación mediante Triton X-100 y cinta microporo) y la denominación de carpetas basada en metadatos para un almacenamiento de datos reproducible.
- Las consideraciones para la adaptación en distintos sistemas modelo implican ajustar la orientación del escáner y la preparación de las placas según el tamaño de las plántulas y las condiciones de crecimiento.
- Las limitaciones prácticas incluyen el manejo de la condensación en las placas y el mantenimiento de una orientación estable de las plántulas durante la rotación de 90 grados para inducir la respuesta gravitrópica.
