Name: La suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende a suplementar ácidos grasos poliinsaturados en Caenorhabditis elegans mediante dieta modificada. Este método permite estudiar funciones lipídicas, regulación metabólica y efectos fisiológicos en nematodos.

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Damos las gracias a Chris Webster para la realización de los experimentos preliminares muestran en la Figura 3 de los resultados representativos y Jason Watts y Chris Webster útil para los comentarios sobre el manuscrito. Los fondos para este estudio fue proporcionado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (Estados Unidos) (R01DK074114) a JLW. Algunas cepas de nematodos utilizadas en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por la Oficina de NIH de los programas de infraestructuras de investigación (OD010440 P40).

Los ácidos grasos poliinsaturados son sensibles al calor, la luz y el oxígeno. Por lo tanto, se debe tener cuidado en la preparación de platos de suplementos de ácidos grasos tales que los ácidos grasos no están expuestos a un exceso de calor y luz. Medios NGM que contienen 0,1% de Tergitol (NP-40) se trata en autoclave y se enfría parcialmente, después de lo cual las sales de sodio de ácidos grasos se añaden con agitación constante. Las placas se dejaron secar en la oscuridad. La absorción de los ácidos grasos por C. elegans cultivadas en estas placas a continuación pueden ser monitoreados mediante cromatografía de gases. 1. Preparación de ácido graso medio suplementado <ol><li> Medir los componentes del medio en un matraz de tamaño adecuado. Por 1 L, añadir 17 g de Bacto-agar, 2,5 g de triptona, 3 g de NaCl, 1 ml de colesterol 5 mg / ml disuelto en etanol, y 10 ml de 10% de Tergitol disuelto en agua. </li><li> Añadir 80% del volumen final deseado de agua Millipore y se esterilice en autoclave a lo largo de los medios de comunicación con las botellas de vidrio vacía (igual al número de diferentesconcentraciones de ácidos grasos a ensayar), así como apropiado cilindros graduados. </li><li> Medios de enfriar en un baño de agua a 55 ° C. Mientras que los medios de comunicación se está enfriando preparar la solución madre de trabajo de la sal sódica del ácido graso rompiendo abierto el vial de vidrio, utilizando las medidas de seguridad y la garantía de las partículas de vidrio no se mezclan con los ácidos grasos. Pesar ácido graso suficiente para hacer una reserva de trabajo 100 mM. </li><li> Se lleva la solución de ácido graso a una concentración final de 100 mM con agua purificada. Disolver completamente la sal sódica del ácido graso suele tardar unos 20-30 min. Se purga la solución de trabajo de ácido graso con argón o nitrógeno, porque el contacto con un gas inerte impide la oxidación. Se tapa el vial y almacenar el inventario de trabajo en la oscuridad hasta que los medios de comunicación se ha enfriado. </li><li> (Opcional) Si se desea medios RNAi, medir la ampicilina y isopropileos β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) soluciones aquí. </li><li> Cuando el agar se ha enfriado a 55 ° C por 1 L de añadir: 1ml de 1 M MgSO4, 1 ml de 1 M de CaCl 2, y 25 ml de tampón de fosfato (108,3 g de KH 2 PO 4 y 35,6 g de K 2 HPO 4 por 1 L de autoclave). Agregue la ampicilina esterilizada filtro y soluciones IPTG si hacer las placas de RNAi. Para todos los tipos de placas, añadir agua estéril para llevar el volumen final a los medios de comunicación 1 L. </li><li> Cerca de una llama, transferir multimedia a un autoclave y de tamaño apropiado cilindro graduado y luego añadir agua estéril caliente al volumen deseado. Traslado de regreso a los medios de comunicación frasco inicial y mezclar por agitación. </li><li> Cerca de una llama, la transferencia de los medios de comunicación en un número de botellas igual al número de concentraciones a ensayar midiendo con un autoclave y de tamaño apropiado cilindro graduado. Mantener las alícuotas de medios como líquido usando un baño de agua hasta que la solución de trabajo de ácidos grasos ha disuelto completamente. </li><li> Coloque una botella sobre una placa de agitación y revuelo hasta que los medios de comunicación es caliente al tacto, pero no caliente. Asegúrese de dejar lo suficientetiempo para agitar en la solución madre de ácido graso y verter en las placas antes de los medios de comunicación comienza a solidificarse. Si placa de agitación tiene control de temperatura, ajústelo a 55 ° C. </li><li> Diluir la solución de trabajo de ácido graso 100 mM en los medios de comunicación para la concentración final deseada. Medios Revuelva hasta que el precipitado blanco se encuentra en solución (aproximadamente 1 minuto). Medios todavía pueden ser ligeramente turbia después. </li><li> (Opcional) Si los medios de comunicación de RNAi se desea añadir ampicilina a 0,1 mg / ml e IPTG a 2 mM de concentración final. </li><li> Vierta multimedia mediante una ayuda de la pipeta automática y una pipeta estéril ml 25, la adición de 8 ml de medio por placa de 60 mm o 25 ml de medio por placa de 100 mm. Repita adición de ácido graso y la placa de vertido pasos para las botellas restantes. </li><li> Después de que el agar se haya solidificado, cubrir las placas de ácidos grasos-complementado con una caja o almacenar a temperatura ambiente en un cajón bien ventilado para protegerlo de la oxidación de la luz. </li><li> Semilla E. OP50 coli sobre placas de dos días después de placas se han secado.Para placas de 60 mm, de pipeta 300 l de un cultivo durante la noche OP50 (crecido a 37 ° C). Si se vertieron placas de RNAi, semilla con 300 l de bacterias RNAi después las placas se han secado durante cuatro días. Puede ser necesario ajustar debido a las diferencias en la humedad en diversos entornos de laboratorio Placa tiempo de secado. </li><li> Incubar las placas en un ambiente oscuro, a temperatura ambiente, mientras que el césped bacteriano se está secando. </li></ol> 2. Inducir Germ destrucción celular por suplementación de DGLA <ol><li> C. elegans cultivadas en placas que contienen mM DGLA 0,3 (20:03 n-6) se vuelven estériles debido a la destrucción de las células germinales en ambos nematodos adultos y de larvas de etapa. <ol><li> Preparar una población sincronizada de larvas L1 mediante el tratamiento de los hermafroditas grávidas con solución de hipoclorito alcalina (para una solución de 10 ml: 0,5 ml de NaOH 5 M, 2,5 ml de lejía doméstica, y 7 ml de H2O). Mueva suavemente los hermafroditas grávidas en esta solución hasta que el gusano adultos se disuelven. Los huevos se conservan y se pueden sedimentaron por centrifugación a baja velocidad. </li><li> Lavar la preparación de huevo 3 veces en tampón M9 (3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml de 1 M MgSO4, H 2 O a 1 L. Añadir MgSO4 después de la esterilización en autoclave). Para proporcionar el oxígeno suficiente, volver a suspender los huevos en un tubo de plástico de 15 ml a un volumen final de 5 ml de tampón M9 y el rock en un agitador durante la noche. </li><li> Larvas L1 debe ser añadido a las placas suplementadas dos días después de la siembra con OP50, o un día después en placas de las bacterias de RNAi. Incubar gusanos a 20 ° C durante tres días o hasta que alcanzan el estado adulto. </li></ol></li><li> Los gusanos adultos se pueden calificar de esterilidad usando un microscopio de disección con suficiente alto aumento para visualizar los embriones en desarrollo en el útero. El éxito de la pérdida de células germinales aparecerá como un claro vacío útero de huevos. </li><li> Los gusanos también pueden ser marcados mediante la fijación y la tinción con la nucleico unacid colorante diamindinophenylindole (DAPI), lo que facilita la visualización de los núcleos en las células germinales y embriones en desarrollo. Una mancha DAPI rápida se consigue recogiendo los gusanos en una gota de tampón M9 en un vidrio de reloj 9. <ol><li> Flood vidrio de reloj con 1 ml de una 0,2 ng / m. DAPI en solución de etanol al 95%, deje reposar durante aproximadamente 5 min. </li><li> Elige gusanos en una gota de VectaShield en una diapositiva, y luego cubra con un cubreobjetos. </li><li> Cubreobjetos Seal y almacenar a 4 ° C en la noche oscura para la tinción óptima, sin embargo diapositivas también se pueden ver inmediatamente. Puntuación para la presencia o ausencia de núcleos de células germinales utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una lámpara UV y filtro. </li></ol></li></ol> 3. Confirmación de ácidos grasos captación por cromatografía de gases Composición de ácido graso total de C. elegans se pueden determinar mediante la producción de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), que después se separan y cuantifican usando CHR de gasomatography 4. <ol><li> Recoger 500-1.000 gusanos adultos lavándolas fuera de las placas con agua y transferir a un 13 mm x 100 mm tubo de tapón de rosca de vidrio silanizado. </li><li> Deje que los gusanos se depositan por gravedad, y luego eliminar la mayor cantidad de agua posible con una pipeta Pasteur de vidrio. </li><li> Lavar los gusanos una vez con agua, y luego otra vez eliminar la mayor cantidad de agua posible. </li><li> FAME se forman mediante la adición de 1 ml de 2,5% de H 2 SO 4 en metanol, y después de calentar a 70 ° C durante 1 hora en un baño de agua. </li><li> Retire los tubos del baño de agua y enfriar durante 1 min. </li><li> Extraer FAME mediante la adición de 1,5 ml de agua y 0,25 ml de hexano. </li><li> Crónica tubos y agitar vigorosamente. </li><li> Tubos centrífuga en una centrífuga clínica de sobremesa durante 1 min a velocidad máxima para separar hexano de disolvente acuoso. </li><li> Traslado hexano (capa superior) para una inserción GC vial dentro de un vial GC, teniendo cuidado de no transferir ninguno de la fase acuosa. Para GC unnálisis, 1-2 l de FAME en hexano se inyectó en una columna de cromatografía de gas capilar polar adecuado para el análisis FAME. El Agilent 7890 GC inyector se fijó en 250 ° C, con una velocidad de flujo de 1,4 ml / min, y el horno del GC se programa para una temperatura inicial de 130 ° C, que se mantuvo durante 1 min. Posteriormente, se aumenta la temperatura 10 ° C / min hasta 190 ° C, y luego en rampa de nuevo a 5 º C / min hasta 210 ° C y se mantuvo durante 1 min. </li><li> Para asegurarse de que se ha producido la absorción de DGLA, analizar FAME por ionización de llama de detección (FID) o espectrometría de masas (MS) de detección, usando patrones auténticos para la identificación de la C. elegans ácidos grasos. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí se describe un método para la suplementación de C. elegans con ácidos grasos insaturados. Como se mencionó anteriormente, se debe tener cuidado en la preparación de platos PUFA complementados porque la naturaleza reactiva de los dobles enlaces en PUFAs hace que estos ácidos grasos para ser sensibles a la oxidación a través del calor y de la luz 11. Para evitar la oxidación, es importante agregar el PUFA al medio de agar líquido después de los medios de comunicación se ha enfriado a 55 ° C y las ...

Los ácidos grasos son componentes estructurales esenciales de las membranas, así como moléculas de almacenamiento de energía eficiente. Adicionalmente, los ácidos grasos pueden ser escindidos a partir de membranas celulares por las lipasas y pueden modificar enzimáticamente para producir efectores de señalización 1. De origen natural los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) contienen dos o más enlaces dobles cis. Los ácidos grasos omega-3 y los ácidos grasos omega-6 se distinguen unos de otros sobre la base de las posiciones de los dobles enlaces con respecto al extremo metilo del ácido graso. Las dietas saludables requieren tanto de omega-6 y ácidos grasos omega-3. Sin embargo, las dietas occidentales son especialmente ricos en ácidos grasos omega-6 y pobres en ácidos grasos omega-3. Un alto contenido de omega-6 proporción de ácidos grasos omega-3 que se asocia con un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares e inflamatorias, sin embargo, las funciones beneficiosas y perjudiciales precisas de ácidos grasos específicos no se conocen bien 2. Las lombrices intestinales Elega Caenorhabditisns es útil en el estudio de la función de ácido graso, ya que sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 grasos, incluyendo una desaturasa omega-3, una actividad que está ausente en la mayoría de los animales 3,4. Los mutantes que carecen de las enzimas ácido graso desaturasa fallan para producir PUFA específicos, dando lugar a una serie de defectos en el desarrollo y neurológicos 4-6. Para estudiar los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un ensayo bioquímico compatible con el análisis genético utilizando tanto técnicas de derribo de RNAi mutante y en C. elegans. La suplementación con PUFA específicos se logra mediante la adición de una solución de sal de sodio de ácido graso para el medio de agar antes de verter. Esto resulta en la absorción de ácidos grasos poliinsaturados por el E. fuente de alimento coli, donde se acumula en las membranas bacterianas. C. elegans ingieren las bacterias que contienen PUFA, y esto los suplementos dietéticos es suficiente para rescatar el defectuosoct de mutantes deficientes en ácidos grasos poliinsaturados. La suplementación de la mayoría de los ácidos grasos no tiene efectos perjudiciales sobre los animales de tipo salvaje, sin embargo, los ácidos grasos específicos de omega-6, especialmente el ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA, 20:03 n-6) causar una destrucción permanente de C. células germinales elegans 7,8. La cromatografía de gases se utiliza para controlar la absorción del ácido graso complementado en la fuente de alimento bacteriana (ya sea OP50 o HT115), así como en los nematodos. La adición de la Tergitol detergente (NP-40) en los medios de comunicación permite una distribución uniforme de los ácidos grasos a través de la placa entera y la absorción más eficiente de los ácidos grasos por la E. coli y los nematodos. Hemos encontrado que los ácidos grasos insaturados son fácilmente absorbidos por las bacterias y C. elegans, pero la absorción de ácidos grasos saturados es mucho menos eficiente. Este artículo describirá paso a paso cómo complementar los medios de agar con ácidos grasos, así como la forma de controlar la absorción de ácidos grasos en the nematodo mediante cromatografía de gases.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td> <td>(5 mg/mL en etanol)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>Linolenato de dihomogamma sodio</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>Agua</td> <td>Millipore tibia y estéril</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua estéril para la recolección de lombrices</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas para solución madre de DGLA</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml en agua (para placas de ARNi)</td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>1 M en agua (para placas de ARNi)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>diamindinofenilindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de vidrio</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de vidrio esterilizables en autoclave con barras agitadoras</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduado de vidrio esterilizable en autoclave</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>Placa de agitación</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua a 55+ & grados; C</td><td>Precisión Científica Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de rosca Vial de vidrio marrón</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr>Tanque <td></td><td></td><td></td>de<td>gas argón</td></tr><tr><td>Automatizado Ayuda para pipetas</td><td>Pipete-Aid</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles (25 ml)</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td></td><td></td>TLB3000</tr><tr><td>Tubo de vidrio silanizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>para derivación de</td></tr><tr><td>FAME Tapones de rosca de PTFE</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa clínica</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Vial de crimpado</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC Inserto de vial</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC Tapón de vial</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>Cromatógrafo de gases</td><td>Agilent</td><td>7890A Detector de</td><td></td></tr><tr><td>espectrometría de masas</td><td>Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>Columna para cromatografía de gases</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>Columna capilar de sílice fundida de 30 m x 0,25 mm</td></tr></tbody></table>

la suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Los ácidos grasos son esenciales para muchas funciones celulares. Sirven moléculas de almacenamiento de energía en forma eficiente, constituyen el núcleo hidrofóbico de las membranas, y participar en las diversas vías de señalización. Caenorhabditis elegans sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 los ácidos grasos. Esto, combinado con la simple anatomía y la gama de herramientas genéticas disponibles, lo convierten en un modelo atractivo para estudiar la función del ácido graso. Con el fin de investigar las vías genéticas que median en los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un método para complementar la C. elegans dieta con ácidos grasos insaturados. La suplementación es un medio eficaz para alterar la composición de ácidos grasos de gusanos y también se puede utilizar para rescatar los defectos en los mutantes deficientes en ácido grasos. Nuestro método utiliza el crecimiento medio de agar nematodo (NGM) suplementado con sales de acidsodium graso. Los ácidos grasos en las placas suplementadas se convierten en incorporaciónTed en las membranas de la fuente de alimento bacteriana, que luego es absorbido por la C. elegans que se alimentan de las bacterias suplementadas. También se describe un protocolo de cromatografía de gases para monitorear los cambios en la composición de ácidos grasos que se producen en los gusanos suplementados. Esta es una manera eficaz para complementar las dietas de las poblaciones grandes y pequeñas de C. elegans, lo que permite una gama de aplicaciones para este método.

La suplementación de la C. dieta elegans está limitada por la capacidad de la fuente de alimento de las bacterias a la absorción e incorporar los ácidos grasos en la membrana bacteriana. Para determinar la capacidad de E. OP50 coli para asimilar diversos ácidos grasos en sus membranas, OP50 se cultivó en placas sobre medios con ningún suplemento, 0,1 mM y concentraciones de 0,3 mM de ácido esteárico (18:0), oleato de sodio (18:1 n-9), y el DGLA de sodio (20 : 3n-6). Las placas se seca...

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; es un modelo útil para explorar las funciones de los ácidos grasos poliinsaturados en el desarrollo y la fisiología. Este protocolo describe un método eficiente de complementar la &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; la dieta con ácidos grasos poliinsaturados.

La suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar medios dietéticos para alterar la composición de ácidos grasos de la elegancia marina con el fin de estudiar la función y regulación de los ácidos grasos. Esto se logra mediante el cultivo de la fuente de alimento del nematodo en presencia de ácidos grasos insaturados. A continuación, la elegancia del mar se alimenta de las bacterias suplementadas, lo que permite la absorción del ácido graso y su incorporación al gusano.Los lípidos cambian entonces en la elegancia del mar. La composición de los ácidos grasos se confirma mediante cromatografía de gases, análisis de espectrometría de masas. Finalmente, después de alimentarse de ácidos grasos insaturados, los gusanos se puntúan para determinar su esterilidad.Se obtienen resultados que muestran los efectos fisiológicos de la composición alterada de ácidos grasos a través del comportamiento de desarrollo y cambios en la expresión génica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la elegancia, el desarrollo y la fisiología del mar, ya que podemos utilizar tanto la manipulación genética como las contribuciones dietéticas para alterar la composición de ácidos grasos y controlar las consecuencias. En general, las personas nuevas en este método deben tener cuidado y cautela porque es difícil obtener resultados consistentes debido a la sensibilidad de los ácidos grasos insaturados al oxígeno y las altas temperaturas.Para preparar un litro de medio suplementado con ácidos grasos, mida los siguientes componentes en un matraz. Agregue agua miliporosa hasta 800 mililitros y autoclave el medio junto con una botella de vidrio vacía para cada concentración de ácido graso que se vaya a analizar, así como cilindros graduados apropiados mientras el medio se enfría a 55 grados centígrados. Prepare la solución madre de trabajo de la sal sódica de ácidos grasos rompiendo con cuidado el vial de vidrio para que no entren partículas de vidrio en el polvo y pesando lo suficiente como para hacer una solución madre de 100 milimolares, agregue la cantidad necesaria de agua purificada.A continuación, utilizando argón o nitrógeno gaseoso, purgue la solución para evitar la oxidación de los ácidos grasos. Luego tape el vial y guarde el vial en la oscuridad mientras el ácido graso, la sal de sodio, se disuelve. Cuando el agricultor se haya enfriado a 55 grados centígrados a continuación, luego cerca de una llama, transfiera la solución a un cilindro graduado estéril.Antes de agregar agua estéril de hasta un litro, transfiera el medio nuevamente al matraz y continúe mezclando. Utilice un cilindro graduado estéril para transferir una alícuota de medio a un frasco esterilizado en autoclave para cada concentración de ácidos grasos que se vaya a analizar. Luego, mantenga las botellas calientes en una placa para revolver.Agregue la concentración adecuada de solución madre de ácidos grasos antes de usar una pipeta estéril de 25 mililitros para verter las placas después de que las placas se hayan solidificado, cúbrala y guárdela a temperatura ambiente en un área bien examinada en la oscuridad. Dos días después, use e. coli OP 50 para sembrar las placas, luego incube las placas en un ambiente oscuro a temperatura ambiente mientras se seca el césped bacteriano. Prepare una población sincronizada de larvas L one mediante el tratamiento de Hermaphrodites Ravi con una solución alcalina de hipoclorito.Mece suavemente a los hermafroditas GR en esta solución hasta que los gusanos adultos se disuelvan. A continuación, centrifugar a baja velocidad para pelletizar los huevos. Use el tampón M nine para lavar los huevos tres veces.Luego, en un tubo de 15 mililitros, vuelva a suspenderlos en cinco mililitros de tampón M nine y robe durante la noche. Añadir las larvas L one a las placas con semillas OP 50 que hayan sido suplementadas con ácido di homo gammalin o DGLA de 0,3 milimolares e incubarlas a 20 grados centígrados durante tres días o hasta que las larvas alcancen la etapa adulta. Use un microscopio de disección para determinar la esterilidad de los gusanos adultos.La pérdida exitosa de gérmenes aparecerá como un útero claro y desprovisto de óvulos. Alternativamente, marque gusanos seleccionándolos en una gota de búfer M nine en el vidrio de un reloj. A continuación, utilice un mililitro de 0,2 nanogramos por mililitro de solución dappy para inundar el cristal del reloj e incubar durante unos cinco minutos.Después de la incubación, recoja las lombrices en una gota de medio de montaje en un portaobjetos antes de cubrirlas con un cubreobjetos, selle el cubreobjetos y guárdelo a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante la noche o mírelo inmediatamente bajo un microscopio fluorescente para producir ésteres metílicos de ácidos grasos o fames. Para cuantificar la absorción de ácidos grasos, recoja de 500 a 1000 gusanos adultos usando agua para lavarlos de las placas y transferirlos a siliconados. Tubos de vidrio de 13 por 100 milímetros con tapa de rosca.Deje que los gusanos se asienten por gravedad y luego use una pipeta de vidrio para eliminar la mayor cantidad de agua posible. Agregue un mililitro de ácido sulfúrico al 2,5% en metanol y caliente los tubos en un baño de agua a 70 grados centígrados durante una hora después de enfriar durante un minuto bajo el capó, extraiga los marcos agregando 1,5 mililitros de agua y 0,25 mililitros de hexano. Vuelva a tapar los tubos y agite vigorosamente.A continuación, centrifugar los tubos en una centrífuga clínica de sobremesa durante un minuto para separar el hexano del disolvente acuoso. Transfiera la capa superior de hexano a un inserto de vial de GC o cromatografía dentro de un vial de GC. Para analizar por gc, inyecte uno o dos microlitros de fames en una columna de cromatografía de gases capilar polar adecuada para el análisis de fame.Ajuste el inyector a 250 grados centígrados con un caudal de 1,4 mililitros por minuto. Programe el horno a una temperatura inicial de 130 grados centígrados durante un minuto. A continuación, aumente la temperatura 10 grados centígrados por minuto hasta que alcance los 190 grados centígrados, y luego vuelva a aumentarla a cinco grados centígrados por minuto hasta 210 grados centígrados, y luego manténgala durante un minuto adicional para asegurarse de que se haya producido la absorción de DGLA.Analice los fotogramas mediante detección de ionización de llama o espectrometría de masas o detección de MS utilizando estándares auténticos para la identificación de la elegancia del mar. La suplementación con ácidos grasos de la dieta sea elegance está limitada por la capacidad de la fuente de alimento bacteriana para absorber e incorporar ácidos grasos en la membrana bacteriana para determinar la capacidad de E. coli OP 50 para asimilar varios ácidos grasos en sus membranas. El OP 50 se colocó en medios sin suplemento, con concentraciones de 0,1 milimolares y 0,3 milimolares de ácido estérico, ato de sodio y DGLA de sodio como se ve en esta figura El análisis de fama realizado por GCMS demuestra que los ácidos grasos insaturados, incluidos el oleato y el DGLA, se incorporan al OP 50 en niveles más altos que el ácido estérico de ácidos grasos saturados.Además, la medición de las cantidades de ácidos grasos en gusanos en etapa adulta revela que la suplementación con ácidos grasos saturados no tiene ningún efecto sobre la cantidad relativa de ácidos grasos saturados en los tejidos de los gusanos. Sin embargo, la suplementación con ácidos grasos insaturados aumentó las cantidades relativas de estas grasas juntas. Estos datos indican que la acumulación relativa de ácidos grasos suplementados en la dieta se correlaciona directamente con la acumulación relativa de ácidos grasos en la dieta de E. coli.Como demostramos anteriormente, este gráfico ilustra la respuesta a la dosis de la inducción de esterilidad de DGLA en la elegancia del mar. La concentración de DGLA en los lípidos de los gusanos en los que el 50% de la población será estéril es de aproximadamente el 12% y, curiosamente, la respuesta al DGLA puede verse alterada por mutaciones genéticas en los gusanos. Basado en un hallazgo reciente de que las vías de estrés dependientes del factor de crecimiento de la insulina pueden influir en la destrucción de células germinales inducida por DGLA.Suplementamos la dieta de gusanos que contenían mutaciones deletéreas en el receptor de IGF de insulina DAF dos o en el factor de transcripción DAF 16 FOXO Con DGLA, una puntuación de esterilidad en cada cepa mostró que los dos mutantes de DAF eran fértiles con poca o ninguna pérdida de células germinales inducida en comparación con los gusanos de tipo salvaje en ambas concentraciones de DGLA. Por el contrario, los gusanos suplementados con DGLA con vox O inactivo mostraron un mayor porcentaje de gusanos estériles en comparación con el tipo salvaje cuando se alimentaron en platos que contenían 0,15 milimolares del ácido graso. Siguiendo este procedimiento, los investigadores pueden realizar numerosos ensayos con la elegancia marina suplementada, como estudios de expresión génica, ensayos de comportamiento o análisis de desarrollo o reproductivos.Estos ensayos revelarán el papel de ácidos grasos específicos en estos procesos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar constantemente medios suplementados con ácidos grasos que se pueden usar para alterar la composición de ácidos grasos de la elegancia marina.

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