Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

El objetivo general del siguiente experimento es generar cultivos de células madre neurales a partir de diferentes áreas del cerebro de un roedor adulto. Esto se logra mediante la recolección de tejido de una región de interés para examinar la presencia y el potencial de las células madre neurales. Como segundo paso, procese el tejido en una suspensión celular para la siembra como un cultivo monocapa.

A continuación, utilice condiciones de cultivo definidas para propagar selectivamente las células madre neurales, validando su potencial de autorrenovación. Se obtienen resultados in vitro que muestran que las células madre neurales son multipotentes en función de su potencial de diferenciación, y cómo diversos factores pueden influir en su autorrenovación y destino. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la neurociencia y la medicina regenerativa, como dónde residen las células madre neuronómicas endógenas y cómo manipularlas.

La primera vez que pensamos en esta técnica fue cuando descubrimos las vías de reducción de señales. Eso nos permitió identificar las células madre neuros endógenas putativas, así como regular su número. Así que aplicamos este conocimiento para establecer cultivos robustos de estas células de diferentes áreas del cerebro.

Estudia sus propiedades y pregúntate, ¿son realmente células madre? La preparación adecuada de la placa de cultivo es fundamental dos días antes de la disección programada, cubra las placas con poli L ornitina a 75 microgramos por mililitro. A continuación, incubar las placas durante la noche del día siguiente, aspirar la poli L ornitina y lavar cada pocillo dos veces con tres mililitros de PBS durante cinco minutos por lavado.

Luego, las placas se pueden almacenar en una incubadora hasta por tres semanas Después de eliminar el lavado final, agregue fibra diluida de una a 250 en PBS mediante un pipeteo suave. Tenga cuidado de no agitar demasiado la solución. A continuación, incubar las placas durante la noche el día de la disección.

Aspirar la fibronectina y lavar los platos dos veces con PBS. Regrese las placas con el lavado final de PBS a la incubadora y espere a que el tejido se disocie. Las placas sin usar se pueden almacenar en la incubadora hasta por una semana, pero no deje que se sequen y no las agite.

La demostración de este protocolo se escala a tres ratas adultas. Primero, asegúrese de enfriar el bloque de sección del cerebro en hielo antes de sacrificar a la primera rata. A continuación, prepare un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo con cinco mililitros de N, dos FGF medios y básicos.

Después de extraer el cerebro de una rata sacrificada, coloque el cerebro en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga PBS helado. A continuación, transfiera el cerebro a una segunda placa de PBS sin ningún residuo de pelo o sangre. Ahora coloque el cerebro en el bloque de sección enfriado e inserte una nueva hoja de afeitar limpia en el bloque cerca de la región de interés a partir de la cual se generarán las células.

A continuación, inserte una segunda hoja de afeitar limpia. Tres milímetros miman la primera hoja de afeitar. Levante con cuidado las cuchillas del bloque, llevándose consigo la sección de interés.

Haga flotar la sección de la cuchilla sumergiéndola en PBS. Ahora cosecha el área de interés usando las pinzas del número cinco. En este ejemplo, la sección contiene la comisura anterior. Seguro.

Recoja la sección en el tubo cónico de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de medio N dos con FGF básico. Luego reduzca el volumen de la solución a uno o dos mililitros. A continuación, en una campana de cultivo celular, sumerja la punta de una pipeta de un mililitro en el fondo del cónico y utilice unos 20 flujos de solución para disociar mecánicamente el tejido.

Detenga la tación cuando la solución se vuelva homogénea y déjela reposar durante unos minutos para que los tejidos no asociados más grandes se asienten en el fondo. Ahora transfiera el sobrenadante homogéneo sin trozos de tejido a un tubo cónico que contenga 8,5 mililitros de suplementado y dos medios. Mezcle el contenido del tubo y tenga listo un seis preparado.

Plato de pozo. Retire el PBS de los pocillos y luego agregue tres mililitros de mezcla celular por pocillo en tres pocillos durante los próximos 10 a 14 días de cultivo. Reemplace el medio con N dos fresco suplementado cada dos días, comenzando 24 horas después de la colocación en placas cada dos días, agregue un volumen fresco de suplementos en N dos.

Medio al medio que ya está en las células. La atención a las condiciones del medio es esencial para mantener las células indiferenciadas y permitir su expansión. Después del primer cambio de medio, una gran cantidad de desechos celulares permanecieron junto con los vasos sanguíneos.

Sin embargo, en los días siguientes, se hicieron visibles colonias de distintas células madre proliferantes. También estaban presentes poblaciones de células más alargadas en forma de huso. Estas no son células madre neurales y finalmente fueron superadas a medida que las células madre neurales proliferaron.

En el transcurso de las siguientes dos semanas, las células madre neurales crecieron más densamente hasta que alcanzaron la confluencia. Estos cultivos dieron positivo para una serie de marcadores de células madre, incluidos SOX two, hesi y nest. De este modo, se garantiza la confianza de que las poblaciones celulares que se han seleccionado y ampliado son, de hecho, células madre neurales.

La confirmación adicional llegó después de retirar el FGF del medio, lo que permitió que las células se diferenciaran durante 10 días en neuronas, astrocitos y todos los citos de cendra. Para inducir la diferenciación. Reemplace el medio N dos suplementado con N dos no suplementado y cultive las células de esta manera durante 10 días, reemplazando el N dos cada 48 horas después de 10 días, aspire el medio y fije las células con dos mililitros de formaldehído al 4% por pocillo durante 20 minutos.

Lave el fijador con tres mililitros de PBS dos veces durante cinco minutos por lavado. Después de aspirar el segundo lavado, agregue dos mililitros de PBS que contengan 5% de suero de burro normal y 0.1% de tritton X 100 para permear y bloquear las células mientras las células se incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos. Prepare la mezcla primaria de anticuerpos en PBS que contenga 5%NDS.

En este ejemplo, se aplica un anticuerpo anti T UJ para identificar neuronas, mientras que los anticuerpos GFAP y CPA se utilizan para visualizar astrocitos y oligodendrocitos respectivamente. Después de 20 minutos, aspire la solución de bloqueo y agregue 1,5 mililitros de la mezcla de anticuerpos primarios a cada uno. Incubar bien las células.

Agregue temperatura ambiente durante 90 minutos después de 90 minutos, lave las celdas con dos baños de PBS, seguido de una aplicación de PBS que contenga 5%NDS, use tres mililitros de solución y baños de cinco minutos. Después de retirar el lavado final, aplique 1,5 mililitros de anticuerpos secundarios en PBS que contengan 5% de NDS a cada uno. Bueno, luego ponga el plato en la oscuridad, agregue la temperatura ambiente y espere 40 minutos.

Después de 40 minutos, reemplace el secundario con dos mililitros de una mancha de DPI recién preparada y espere tres minutos. Después de aspirar la solución DPI, lave las celdas tres veces con tres mililitros de PBS durante cinco minutos por lavado. A continuación, las células están listas para la microscopía siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como los Western blots, se pueden realizar para observar los cambios en la expresión y fosforilación de proteínas que resultan de tratamientos farmacológicos o en el curso de la diferenciación celular. Después del desarrollo de esta técnica, en realidad allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia probaran nuevos métodos que implementaron en la investigación en varias especies diferentes, incluidos ratones, ratas e incluso primates.