Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

El objetivo general de este procedimiento es funcionalizar el polietilenglicol y los péptidos con grupos metacrilato para las posteriores polimerizaciones en cadena y síntesis de hidrogel. Esto se logra combinando primero metanfetamina, anhídrido acrílico y el precursor funcionalizado de la ONU en un frasco de centelleo. El segundo paso es utilizar la energía de microondas para funcionalizar la clavija o péptido.

A continuación, el PEG DM se disuelve en clorometano, o el péptido se separa de la resina. Y todos los grupos protectores de la cadena lateral se eliminan en un cóctel a base de ácido. El paso final es precipitar el péptido funcionalizado PEG DM o metacrilamida en éter.

En última instancia, la RMN de protones o la espectrometría de masas de tiempo de vuelo de Maldi se utilizan para mostrar la funcionalización exitosa de la macro de péptidos o peg. Hola, mi nombre es Amy Van Hove. Soy estudiante de doctorado en el departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Rochester.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la reacción de PEG con fluoruro acrílico de metanfetamina, es que la reacción es significativamente más rápida y más respetuosa con el medio ambiente. Hola, mi nombre es Brandon Wilson. Soy estudiante de ingeniería química en la Universidad de Rochester.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los biomateriales, como la forma en que los hidrogeles producidos con peg dimetilo se pueden emplear para controlar la entrega de células terapéuticas en moléculas. Hola, soy Danielle Benoit, profesora asistente en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Rochester. Las implicaciones de esta técnica son para el desarrollo de terapias para una variedad de enfermedades, ya que los compuestos sintetizados se pueden utilizar para aplicaciones de administración de células y fármacos.

Antes de comenzar este procedimiento, pred secó la cristalería requerida en un horno durante una hora para evitar la contaminación con agua en un bote grande de suero. Salen cinco gramos de clavija con un peso molecular entre 1000 y 100.000 daltons. Si está presente, retire la pieza de plástico de la tapa de un frasco de centelleo en la campana química.

Dispense 10 molares de exceso de anhídrido acrílico de metanfetamina en un frasco de centelleo desgarrado. A continuación, añada PEG al vial. A continuación, gire sin apretar la tapa sobre el vial y coloque el vial en el microondas.

Configure el microondas a cinco minutos a máxima potencia con guantes resistentes al calor. Retire el vial del microondas cada 30 segundos. A continuación, apriete completamente la tapa y agite la muestra durante 30 segundos.

Afloje la tapa antes de devolver el vial al microondas. Repita estos pasos hasta que la solución se haya calentado en el microondas durante los cinco minutos completos. Después de sacar el vial del microondas, afloje la tapa y deje que el PEG DM se enfríe a temperatura ambiente.

A continuación, disuelva el PEG DM en 10 a 15 mililitros de diclorometano. Precipitar el PEG DM en 10 veces más de éter predathyl durante 20 minutos. Utilizando un embudo Buckner de siete centímetros y un matraz de 500 mililitros.

Recoja el PEG DM por filtración al vacío. A continuación, transfiera el PEG DM filtrado a un tubo cónico de 50 mililitros con una aguja de calibre grande perforada a través de la tapa para la ventilación. Coloque el tubo en una cámara de vacío y seque el PEG DM durante la noche.

Después de quitar el tubo de la cámara de vacío, disuelva el PEG DM en precipitado de clorometano DI con éter datílico helado. Para eliminar el anhídrido acrílico metanfetamina no reactivo después de la filtración y la recolección, seque el PEG DM en una cámara de vacío de la misma manera que antes. Para el análisis de RMN de protones, coloque aproximadamente 10 miligramos de PEG DM en un vial de centelleo y agregue aproximadamente un mililitro de cloroformo deuterado.

Una vez que la muestra se haya disuelto, transfiérala a un tubo de RMN limpio. A continuación, recoja los espectros de RMN de protones y ejecute las muestras a temperatura ambiente durante al menos 64 escaneos para obtener una resolución de datos suficiente. Después de sintetizar el péptido de interés mediante síntesis en fase sólida, guárdelo en la resina en DMF a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para su uso.

A continuación, recoge la resina peptídica por filtración utilizando un embudo buckner de siete centímetros con papel de filtro y un matraz de 250 mililitros. Retire la pieza de plástico de la tapa de un vial de centelleo y transfiera la resina al vial. Con una pipeta desechable, agregue suficiente anhídrido acrílico de metanfetamina para cubrir la resina Después de girar sin apretar la tapa sobre el vial, colóquelo en el microondas y configure el temporizador en tres minutos.

A máxima potencia, con guantes resistentes al calor, retire el vial del microondas cada 15 a 20 segundos. Después de apretar completamente la tapa, agite la muestra durante 15 segundos. Afloje la tapa antes de devolver el vial al microondas.

Repita estos hasta que la solución se haya calentado en el microondas durante los tres minutos completos. Con la tapa del vial aflojada, deje que la solución peptídica se enfríe a temperatura ambiente usando una pequeña cantidad de DMF y un embudo de siete centímetros. Con papel de filtro y un matraz de 250 mililitros.

Recoja la resina peptídica del vial para obtener un escote y una protección profunda. Transfiera la resina peptídica a un vial de centelleo nuevo para obtener 0,25 milimoles de péptido que contenga arginina. Agregue 0.25 mililitros de propileno tri ISO, tres seis dióxido de carbono, uno de ocho octanos, diol tiol, agua desionizada y 18.0 mililitros de TFA.

A continuación, gire la mezcla de reacción en un rotador de terremotos de laboratorio durante cuatro horas a temperatura ambiente. Cuando termine, precipite el péptido en 10 veces más de éter etílico preenfriado. Divida la solución uniformemente entre cuatro tubos cónicos de 50 mililitros, centrifugue las cuatro muestras a 3.200 G durante 10 minutos para recoger el péptido después de la centrifugación, decante el éter y vuelva a suspender el péptido en 100 mililitros de éter etílico fresco dividido en dos tubos cónicos de 50 mililitros.

Repita el proceso de centrifugación. Repus, suspendiendo el péptido en 50 mililitros de éter fresco dos veces durante un total de cuatro lavados con éter, después de la última etapa de centrifugación, decanta el éter residual y seca el péptido durante la noche al vacío. Para preparar la muestra para el análisis del tiempo de vuelo de Maldi, coloque uno o dos miligramos del péptido en un tubo de einor de 1,5 mililitros y disuelva la muestra en un mililitro de disolvente Maldi.

A continuación, prepare una solución de matriz de 10 miligramos por mililitro de ácido alfa cuatro hidroxicerámico en el disolvente multis. Combine las soluciones de péptidos y matrices en una proporción de uno a uno, coloque un microlitro de la solución combinada en tres ubicaciones separadas en la placa de muestra MALDI. Seca las manchas con una pistola de calor.

A continuación, vuelva a localizar y secar cada muestra. Finalmente, recoja los datos de tiempo de vuelo de MALDI y confirme un aumento de 68 gramos por mol en el peso molecular debido a la adición del grupo metacrilamida al extremo final del péptido. Aquí se muestra el espectro de RMN de un PEG DM lineal de dos kilodalton funcionalizado utilizando el método asistido por microondas para esta reacción.

El análisis de RMN de protones se puede utilizar para calcular el porcentaje de funcionalización desde la relación observada hasta la teórica de los protones de metacrilato terminal y los protones PEG centrales. El porcentaje total de funcionalización es del 91% y este PEG DM está adecuadamente funcionalizado para su uso en la síntesis de hidrogel. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre el cálculo del porcentaje de funcionalización debido a la multitud de picos de protones que surgen en el análisis de RMN de protones de péptidos pep.

La funcionalización de péptidos se investiga más fácilmente utilizando la espectrometría de masas de tiempo de vuelo maldi. Esto se demuestra aquí donde el péptido G-K-R-G-D-S-G se sintetizó y se sometió a la funcionalización de la metacrilamida, una pequeña fracción del péptido se escindió para la evaluación del peso molecular previa a la funcionalización, que mostró el pico de peso molecular observado que ocurría a 676 gramos por mol, el peso molecular esperado del péptido, el resto del péptido se sometió a la funcionalización de la acrilamida de metanfetamina antes de la escisión después de la funcionalización de la acrilamida de metanfetamina. El pico de peso molecular observado se produce a los 744 gramos por mol, el peso esperado del péptido funcionalizado con acrilamida metanfetamina.

Para demostrar la funcionalidad tanto del PEG DM como de los péptidos funcionalizados con acrilamida metanfetamina, se produjeron hidrogeles PEG con y sin metanfetamina de 0,5 milimolares. La acrilamida funcionalizada GK R-G-D-S-G que se muestra aquí es representativo de contraste de fase e imágenes fluorescentes muertas vivas de MSC en geles peg solos y en geles peg que contienen el péptido funcionalizado con metanfetamina. Las MSC no pudieron adherirse a los hidrogeles peg funcionalizados por la ONU, pero tras la inclusión del péptido de adhesión celular RGD, pudieron adherirse y propagarse en la superficie del hidrogel.

Las imágenes de muertos vivos no representan la viabilidad de la población de MSC sembrada. Más bien, las imágenes fluorescentes están destinadas a demarcar entre las células de adherencia y las pequeñas variaciones en la topología del hidrogel, lo que puede ser difícil solo con el contraste de fase. Curiosamente, las células no esparcidas sembradas en el PEG solo se tiñen positivamente tanto para el calcio AM como para el homodímero AUM, lo que indica que las células estaban muriendo en el momento de la toma de imágenes.

Una de las muchas ventajas de los hidrogeles PEG es su naturaleza altamente sintonizable que modifica la composición específica de la clavija. El hidrogel ofrece a los investigadores un alto grado de control sobre propiedades como el módulo de elasticidad, como se ilustra aquí. Se sabe que tanto el peso molecular como el porcentaje de peso de PEG controlan el tamaño de la malla de hidrogel, el hidrogel resultante, la rigidez y la tasa de liberación de los fármacos encapsulados.

Esto se demostró mediante la producción de hidrogeles con peso molecular variable, PEG dm, e investigando el módulo de hidrogel resultante y el tamaño de malla según la hipótesis, aumentando el peso molecular de la clavija. Macer provocó un aumento en el tamaño de la malla de hidrogel y una disminución en la rigidez del hidrogel, el tamaño de la malla de hidrogel y la rigidez de gel resultante también se pueden controlar alterando el peso. El porcentaje de hidrogeles PEG se produjo con peso variable.

Se determinó el porcentaje de DM y la rigidez del hidrogel y el tamaño de la malla de PEG lineal de 10 kilodaltons, como se ilustra aquí, el aumento del porcentaje de peso de PEG provoca una disminución significativa en el tamaño de la malla y un aumento en la rigidez del hidrogel. Los hidrogeles que contenían albúmina sérica bovina encapsulada se formaron utilizando clavijas de peso molecular variable, como se muestra aquí. La liberación de albúmina sérica bovina se produce más rápidamente a partir de hidrogeles formados con PEG DM de mayor peso molecular como resultado del mayor tamaño de malla dentro del hidrogel.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar el elogio PEG DME utilizando el método asistido por microondas y cómo evaluar la funcionalización usando RMN de protones. Una vez que se domina este procedimiento, también se puede utilizar la apertura del anillo de los grupos hidrolíticos degradables para responder a preguntas adicionales sobre cómo la degradación del hidrogel afecta a la función celular. También debe tener una buena comprensión de cómo se puede utilizar esta técnica para incorporar selectivamente las funcionalidades de la acrilamida de metanfetamina en las secuencias de péptidos del extremo final y cómo evaluar esta funcionalización utilizando espectrometría de masas de tiempo de vuelo múltiple.

Gracias por mirar.