Name: Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Aprende a funcionalizar poli(etilenglicol) y péptidos mediante energía de microondas para sintetizar hidrogeles. Este método rápido y ecológico facilita aplicaciones en liberación de fármacos e ingeniería de tejidos.

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Este trabajo fue financiado en parte por una beca Howard Hughes Med-en-Grad (AVH), con fondos iniciales proporcionados a la Dra. Danielle Benoit de la Universidad de Rochester y la Fundación de Investigación y Educación Ortopédica / Trasplantes Musculoesqueléticos Foundation (OREF / MTF). Los autores desean agradecer al Dr. James L. McGrath para el uso de su equipo.

1. Síntesis asistida por microondas de PEGDM <ol><li> Para evitar la contaminación con agua, presecar el material de vidrio se utiliza en un horno (&gt; 60 º C) durante 1 hora. Nota: la cristalería requerida incluye: dos vasos de precipitados de 100 ml, un vaso de 250 ml, 3 espátulas, un frasco de 250 ml Büchner, un embudo Büchner de 7 cm, un vidrio de reloj de 10 cm. </li><li> Pre enfriamiento 100-150 ml de éter dietílico anhidro (74,12 g / mol) para la precipitación posteriormente realizado en el paso 1.6 vertiéndola en un vaso de precipitados, que cubre el vaso de precipitados con un vidrio de reloj, y colocando el vaso de precipitados en una placa de recristalización lleno de hielo. Mueva microondas y vórtice en una campana química. Nota: éter de dietilo también puede preenfriar colocando el vaso de precipitados en un congelador química. La temperatura éter dietílico inferior logrado por enfriamiento en un congelador aumentará la tasa y eficiencia de precipitación. </li><li> En un pequeño barco pesar, pesar 5 g de poli (etilenglicol) (PEG) de la molecular el peso de su elección (1.000-100.000 Da). <ol><li> Si está presente, retire la pieza de plástico de la tapa del vial de centelleo. Tarar el vial, y dispensar 10 exceso molar de anhídrido metacrílico en el vial (MA, 154,16 g / mol) por la ecuación 1 en la campana. Añadir PEG al vial de centelleo. <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="200px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.jpg" width="250px" /> (1) donde <img alt="Ecuación 1.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.1.jpg" width="30px" /> es la masa de PEG en g, <img alt="Ecuación 1.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.2.jpg" width="40px" /> es el peso molecular de PEG en g / mol, <img alt="Ecuación 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="40px" /> es el número de grupos OH terminales en el PEG, y <img alt="Ecuación 1.4" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.4.jpg" width="40px" /> es el molecular el peso de MA en g / mol. </li></ol></li><li> Sin apretar girar la tapa en el vial de centelleo. Ajuste el horno de microondas para 5 min en la máxima potencia. El uso de guantes resistentes al calor, retire el vial del microondas cada 30 segundos. <ol><li> Apriete completamente la tapa y agitar durante 30 segundos. Repita hasta que la solución ha sido calentados para el total de 5 min. La tapa puede necesitar ser reemplazado durante el procedimiento debido a la fisuración. </li></ol></li><li> Con la tapa aflojada, deje que el PEGDM enfriar a temperatura ambiente. Disolver el PEGDM en una pequeña cantidad (10-15 ml) de diclorometano (DCM, 84,93 g / mol). Nota: Se recomienda que el PEGDM se dejó enfriar de manera significativa (~ 5 minutos) antes de la adición de DCM, para evitar la ebullición de la DCM (un carcinógeno sospechoso) debido al calor residual. El PEGDM puede romperse en pequeños trozos utilizando una espátula y se agitó en vórtex para ayudar a la disolución. </li><li> Precipitar el PEGDM en 10 veces el exceso de éter dietílico enfriado en hielo durante 20 min. Nota: Puede ser necesario scRatch el lado vaso de precipitados con una espátula para iniciar la formación de cristales para precipitar los PEG de bajo peso molecular (2.500 Da), sin embargo, el PEG con un peso molecular por debajo de 1000 Da no precipitará a pesar de rascado. </li><li> El uso de un embudo Buchner y un matraz, recoger el PEGDM por filtración al vacío. No filtrar hasta desecación completa, ya que esto promoverá la adsorción de agua a la PEGDM. Nota: Si es necesario para el sistema de vacío específico en uso, una trampa de vacío se puede colocar entre la configuración de la filtración y la fuente de vacío para proteger la bomba de vacío del daño causado por los vapores de disolvente. </li><li> Transferir el PEGDM filtrada a un tubo cónico de 50 ml con una aguja de calibre grande perforado a través de la tapa para la ventilación. Almacenar durante la noche en una cámara de vacío para secar. </li><li> Se vuelve a disolver en DCM y PEGDM precipitara de nuevo (como en los pasos 1.5 a 1.7) como una etapa final para eliminar MA sin reaccionar. Secar de nuevo como en el paso 1.8. </li></ol> 2. Caracterización de PEGDM Funcionalización <ol><li> Utilizando cloroformo deuterado (120,38 g / mol) como disolvente, para preparar muestras 1 H-RMN. Colocar una pequeña muestra de la PEGDM (≈ 10 mg) en un vial de centelleo con una pequeña cantidad de disolvente (≈ 1,0 ml). La concentración objetivo es 10 mg / ml. <ol><li> Una vez que se disolvió la muestra, transferirlo a un tubo de RMN limpio. La muestra debe llenar la parte inferior de 4-5 cm del tubo de RMN. </li></ol></li><li> Recoger los espectros de RMN de protón. Nuestros datos se recogieron usando un espectrómetro de 400 MHz. Ejecutar las muestras a temperatura ambiente durante al menos 64 exploraciones para obtener suficiente resolución de datos. </li><li> Si el análisis de RMN (Figura 4) indica PEGDM funcionalización es menos de 90%, el procedimiento de metacrilación se debe repetir. Ajuste de la masa de MA usa para dar cuenta de la cantidad reducida de PEG no funcionalizado. </li></ol> Nota: El por ciento de PEG funcionalizado en PEGDM puede calcularse a partir de la observada: relación teórica de metacrilato terminal deprotones ylate (a, byc) a centrales protones PEG (d) (Figura 4). Para el PEG lineal, el número teórico de centrales protones de PEG se calcula por la ecuación 2: <img alt="Ecuación 2" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.jpg" width="200px" /> (2) donde <img alt="Ecuación 2.1" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.1.jpg" width="40px" /> es el peso molecular del PEG en g / mol y <img alt="Ecuación 2.2" fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.2.jpg" width="70px" /> es el peso molecular de una única repetición de PEG (44 g / mol). Para no lineal de PEG, esta ecuación debe ser modificado para reflejar la estructura de ramificación específica (Figura 1). El porcentaje de funcionalización se puede calcular utilizando la ecuación 3: <img alt="Ecuación 3" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.jpg" width="300px" /> (3) donde <img alt="Ecuación 3.1" fo:content-width="30px" src = &quot;/ files/ftp_upload/50890/50890eq3.1.jpg&quot; width = &quot;40px&quot; /&gt; es el área observada bajo el pico d (δ = 6,63 ppm), <img alt="Ecuación 3.2" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.2.jpg" width="40px" /> es el área observada bajo los picos de protones metacrilato (A, δ = 1,94 ppm, b y c, δ = 5,57 y 6,12 ppm), y <img alt="Ecuación 3.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.3.jpg" width="40px" /> es el número teórico de protones de metacrilato (A = 3 * <img alt="Ecuación 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> , B = 1 * <img alt="Ecuación 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> y c = 1 * <img alt="Ecuación 1.3" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" /> - 6, 2 y 2, respectivamente, para PEG lineal). El cálculo de funcionalización por ciento se debe realizar utilizando picos a, b y c por separado, y luego averaged para obtener un ciento funcionalización en general. Nota: PEGDM suficientemente funcionalizado puede entonces ser dializó (en agua, contra el agua) y se recogió por liofilización para eliminar el anhídrido metacrílico residual y ácido metacrílico. El producto final debe ser mezclado con una pequeña cantidad (0,01% en peso) de inhibidor, tal como ácido cítrico o vitamina C y se almacenó con desecante a -20 ° C hasta su uso. El producto PEGDM final puede ser utilizado para producir hidrogeles, como se detalla en el artículo JoVe por Khetan y Burdick 22. 3. Funcionalización asistida por microondas de los péptidos sobre resina- Nota: Nuestros péptidos se sintetizaron usando resina Fmoc-Gly-Wang, utilizando un sintetizador de péptidos automatizado con control UV, y soluciones 0,2 M de aminoácidos en N-metilpirrolidona (NMP, 99,1 g / mol). 5% piperazina (86,1 g / mol) en dimetilformamida (DMF, 73,1 g / mol) se utiliza para la desprotección, 0,5 M de O-benzotriazol-N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametil-uronio-hexafluoro-fosfato (HBTU, 379,3 g / mol) en DMF se utiliza como el activador, y 2 M de diisopropiletilamina (DIEA, 129,3 g / mol) en NMP se utiliza como la base del activador. Los péptidos también se pueden obtener de un proveedor comercial péptido. Al utilizar fuentes comerciales es crítico que los péptidos se efectúen en-resina con la cadena lateral de grupos protectores de aminoácidos intactos en lugar de completamente escindido, como es estándar. Nota: Es importante que cualquiera de los aminoácidos con cadenas laterales reactivas están protegidos para asegurar que funcionalización metacrilamida sólo se produce en la amina primaria de la N-terminal de la secuencia. Ver la Tabla 1 para los aminoácidos con grupos laterales reactivos, y grupos protectores típicos. Los aminoácidos con grupos protectores se incorporan en la secuencia durante la síntesis de péptido de la misma manera como los aminoácidos no protegidos, y a menudo están disponibles a partir de los mismos proveedores de aminoácidos. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502"&gt; <colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Aminoácido </td><td style="width:163px;"> Grupo reactivo </td><td style="width:196px;"> Grupo protector </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Lisina </td><td style="width:163px;"> Amina primaria </td><td style="width:196px;"> terc-butiloxicarbonilo (Boc) </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Serina </td><td style="width:163px;"> Alcohol primario </td><td style="width:196px;"> terc-butilo (tBu) </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Treonina </td><td style="width:163px;"> Alcohol secundario </td><td style="width:196px;"> tBu </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:144px;"> Tirosina </td><td style="width:163px;"> Fenol</td><td style="width:196px;"> tBu </td></tr></tbody></table> Tabla 1: aminoácidos reactivos y grupos protectores típicos. <ol><li> Sintetizar péptidos usando síntesis de péptidos en fase sólida estándar, y almacenar en la resina a 4 ° C en DMF hasta que esté listo para su uso. </li><li> Usando un embudo Büchner 7 cm con papel de filtro y matraz de 250 ml, recoger la resina de péptido de la DMF a través de filtración. </li><li> Si está presente quitar la pieza de plástico de la tapa del vial de centelleo. Transferir la resina para el vial de centelleo. Utilizando una pipeta desechable, añadir suficiente MA para cubrir la resina en el vial de centelleo. </li><li> Sin apretar colocar la tapa en el vial de centelleo. Ajuste el microondas a 3 minutos a máxima potencia. El uso de guantes resistentes al calor, retire el vial del microondas cada 15-20 segundos. <ol><li> Apriete completamente la tapa y agitar durante 15 segundos. Repita hasta que la solución ha sido calentados para el full 3 min. </li></ol></li><li> Con la tapa aflojada, deje que la solución de péptido se enfríe a temperatura ambiente. El uso de una pequeña cantidad de DMF y un embudo Buchner con papel de filtro y el frasco, recoger la resina de péptido del vial. </li><li> Transferir la resina péptido a un vial de centelleo fresco y escindir y desproteger el péptido. <ol><li> Por 0,25 mmol de resina, se utiliza una reacción a temperatura ambiente 2 horas con rotación, usando un cóctel de escisión de 18,5 ml de ácido trifluoroacético (TFA, 114,02 g / mol) con 0,5 ml de cada uno de triisopropilsilano (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanoditiol (Dodt, 182,30 g / mol) y agua desionizada (18,02 g / mol). Nota: Este cóctel es suficiente para la mayoría de los péptidos, pero no desproteger 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofurano-5-sulfonil aminoácidos (Pbf)-protegidas (comúnmente usados ​​para proteger las cadenas laterales de arginina). Si la secuencia contiene grupos protegidos-Pbf, deben reemplazarse 0,5 ml de TFA con 0,5 ml de tioanisol (124.20 g / mol) y la escisión tiempo aumentó a 4 horas. Nota: Si un nublado, forma una sustancia cristalina en el cóctel de escisión, el péptido es probable que el juego fuera de la solución y el volumen del cóctel de escisión debe ser del doble. </li></ol></li><li> Chill 400 ml de éter dietílico anhidro en el hielo en un vaso de precipitados cubierto con vidrio de reloj. </li><li> Precipitar el péptido en 10 veces el exceso de éter dietílico, y dividir la solución de manera uniforme entre los cuatro tubos de 50 ml cónicos. Se centrifuga a 3200 × g durante 10 min para recoger el péptido. <ol><li> Decantar el éter, y resuspender el péptido en 100 ml de éter dietílico fresco dividido entre dos tubos cónicos de 50 m. Repetir el proceso de centrifugación, resuspensión en 50 ml de éter fresco dos veces para un total de 4 lavados de éter. Nota: Esto elimina los productos químicos utilizados en el cóctel de escisión y se escinde los grupos protectores del péptido sólido. </li></ol></li><li> Después de la última etapa de centrifugación, se decanta el et de residuosella y secar el péptido durante la noche bajo vacío. </li></ol> 4. Caracterización del péptido Funcionalización <ol><li> Utilice 50:50 H2O: acetonitrilo (41.05 g / mol) + 0,1% de TFA como disolvente para el análisis MALDI-TOF de muestras de péptidos. Colocar una pequeña muestra (1 - 2 mg) del péptido en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y disolver la muestra en 1 ml de disolvente de MALDI. </li><li> Preparar la solución de matriz. Una matriz de ácido empleado comúnmente se α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA, 189,2 g / mol) como la matriz. Disolver 10 matriz mg / ml en MALDI disolvente, formando una solución matriz de valores. Nota: La solución de la matriz se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de una semana para análisis adicionales. </li><li> Combinar el péptido y solución de matriz en una relación de 01:01. Spot Esta solución combinada en tres lugares separados en la placa de muestra de MALDI, la adición de 1 l / spot. <ol><li> Secar las manchas, ya sea por secado al aire o con una pistola de calor. Puntos por resistencia y seca cadamuestra. Nota: Respotting produce una muestra más uniforme péptido / matriz, y ayuda a obtener una señal clara. Una mezcla de péptidos estándar también se debe combinar con la solución de matriz en una relación de 01:01 y manchado (sólo una vez) en la placa de MALDI. </li></ol></li><li> Recoge los datos de MALDI-TOF. Debido a la adición del grupo de metacrilamida a la N-terminal del péptido, no debería haber un incremento de 68 g / mol en peso molecular por encima de que el peso molecular del péptido solo. Nota: A diferencia de la síntesis PEGDM, péptidos no pueden ser refunctionalized, como tras la escisión se eliminan los grupos protectores en los aminoácidos con cadenas laterales reactivas, y la funcionalización selectiva de los extremos N ya no pueden garantizarse. <ol><li> Si el análisis de MALDI (Figura 5) indica el péptido se funcionaliza correctamente y todos los grupos protectores escinde apropiadamente, el péptido se puede dializó (en agua, contra el agua) y se recogió mediante liofilización para Remove contaminantes residuales (cóctel de escisión, éter, escinden los grupos protectores, etc.) El péptido sólido debe ser transferido a un pequeño tubo Eppendorf y se almacenó a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El poli (etilenglicol) (PEG) hidrogeles son biomateriales comunes utilizados en la medicina regenerativa y la administración de fármacos 1-3 aplicaciones. Estos hidrogeles ofrecen ventajas significativas sobre otros biomateriales. Los hidrogeles de PEG son sintéticos, que ofrece un alto grado de control sobre las propiedades de ingeniería tales como el módulo de elasticidad y la velocidad de degradación en comparación con sus homólogos de biomateriales naturales 1. A medida que se derivan sintéticamente, PEG tiene significativamente menos variabilidad lote a lote frente a los materiales de origen natural-4. Debido a la composición química de PEG, estos hidrogeles son altamente hidrófilos, resistentes a la adsorción de proteínas, y biocompatible 3. Esta resistencia a la absorción de proteínas permite hidrogeles de PEG para actuar como un &quot;pizarra en blanco&quot;, que permite a los investigadores a interrogar y estudiar los factores biológicos o químicos específicos (medicamentos, biomoléculas, péptidos de adhesión celular, etc) y los roles específicos estos factoRS juegan en el control de la célula y / o comportamiento de los tejidos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig1.jpg" width="600px" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . Figura 1: Ejemplos de poli (etilenglicol) (PEG) arquitecturas A) PEG lineal B) de PEG de 4 brazos con un núcleo de pentaeritritol C) de PEG de 8 brazos con un núcleo de hexaglicerol D) de 8 brazos de PEG con un.... tripentaeritritol núcleo. n es el número de PEG repite en cada brazo. Cada repetición tiene un peso molecular de 44 g / mol, por lo tanto, n se puede calcular a partir del peso molecular total y la estructura / brazo #. Precursores de PEG están disponibles con una variedad de arquitecturas y pesos moleculares (Figura 1<html> ). La variación de la arquitectura (brazo #) y repeticiones de glicol de etileno (n) de PEG puede ser utilizado para controlar las propiedades de las redes de hidrogel formadas a partir de estos macrómeros. Sin modificar PEG contiene grupos hidroxilo terminales que deben reponerse con una funcionalidad alternativa para facilitar la reticulación covalente mediante polimerizaciones, la estrategia de reticulación más comúnmente empleado para los hidrogeles de PEG, antes de la formación de las redes de hidrogel. Hay una variedad de grupos químicos que se pueden incorporar en macrómeros de PEG para facilitar la polimerización y la reticulación de la red (acrilato, metacrilato, vinil éter, norborneno, etc). A pesar de la variedad de funcionalidades terminales disponibles para facilitar la reticulación, sólo hay dos mecanismos por los que puede ocurrir la polimerización:-y paso de crecimiento en cadena (o una mezcla de los dos, de modo mixto). g2.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . Figura 2:.. Teórica esquemática red hidrogel A) de la cadena de crecimiento tradicionales resultados de la polimerización en redes heterogéneas que contienen poli denso (metacrilato) regiones y el aumento no idealidades de red, tales como bucles, precursores sin reaccionar, y los enredos permanentes reticulación B) por crecimiento en etapas polimerización da como resultado estructuras de red significativamente más homogéneas (no a escala). Funcionalidades que se reticulan a través de la polimerización de crecimiento en cadena no requieren la presencia de un agente de reticulación adicional. Sin embargo, los hidrogeles cadena polimerizada producen estructuras de redes heterogéneas que contienen regiones de reticulación densos (Figura 2A) 1. En contraste, por crecimiento en etapas de polimerización Requires el uso de un agente de reticulación o co-monómero que es reactivo con los grupos funcionales terminales de los macrómeros de PEG. Como los grupos funcionales terminales en el PEG sólo pueden reaccionar con el agente de reticulación y el agente de reticulación sólo pueden reaccionar con los grupos funcionales terminales en la clavija, esto resulta en una mayor estructura de la red homogeneidad (Figura 2B) 1. Polimerizaciones por crecimiento en etapas también típicamente conducen a una mayor conversión de los grupos funcionales, disminuyendo la cantidad de precursores sin reaccionar y el potencial para las respuestas inmunes / inflamatorias debido a solubles, macrómeros no incorporadas 1. Métodos de polimerización de modo mixto también se han desarrollado que combinan tanto la polimerización paso-y de crecimiento en cadena a través del uso de macrómeros que pueden tanto auto-reaccionar (de crecimiento en cadena) y reaccionar con un agente de reticulación (por crecimiento en etapas). Esto produce hidrogeles con características de cada mecanismo de polimerización, y se puede utilizar para producir, diversas estructuras de red más complejas que cualquierapaso o redes de cadena de crecimiento solamente 1. Mientras que hay una gran cantidad de grupos funcionales que se pueden usar para funcionalizar PEG y facilitar la formación del hidrogel, metacrilatos y norbornenos son algunos de los restos más comunes de polimerización en cadena y por crecimiento en etapas, respectivamente. Ambas funcionalidades ofrecen un excelente control espacio-temporal durante la polimerización de la red, y cuando se usan para encapsular las células, estas redes de apoyo de alta capacidad de supervivencia global de la célula 5-7. Dimetacrilato de PEG funcionalizado (PEGDM) de reticulación a través de la polimerización de la cadena y permite la incorporación de biomoléculas u otros factores través de la co-polimerización con acrilato-, biomoléculas de metacrilato-, o de manera similar funcionalizados-5,6. Hidrogeles PEGDM tienen ventajas significativas sobre los sistemas de polimerización en cadena-alternos de crecimiento tales como acrilato de PEG funcionalizado (PEGDA). El uso de métodos tradicionales, PEGDA puede sintetizarse más rápidamente que PEGDM; hoWever, usando la síntesis asistida por microondas, la síntesis de PEGDM es aún más eficiente. PEGDA a menudo se sintetiza en 8 durante la noche o 24-hr 9 reacciones, pero también se puede sintetizar en cuatro horas a temperaturas elevadas 10. PEGDM también es tradicionalmente sintetizó por reacción de 11 durante toda la noche o durante 24 horas 5, con algunos de los métodos que se extiende el tiempo de reacción 4 días a 12. Utilizando el método asistida por microondas se ha demostrado aquí, PEGDM puede ser producido en una reacción de 5 min. Mientras PEGDM tiene una cinética de reacción más lentas que PEGDA 13, la reacción de reticulación para PEGDM sigue siendo rápida, que ocurre en minutos, y consigue una mayor conversión de macrómero de PEGDA como el aumento de la hidrofobicidad del grupo de metacrilato aumenta la agregación de grupo funcional en solución, lo que aumenta la probabilidad de la transferencia y la conversión radical metacrilato 14. Hidrogeles PEGDM también se asocian con el aumento de la viabilidad celular y el crecimiento comoen comparación con hidrogeles PEGDA, probablemente debido a la disminución de la velocidad de reacción en un momento dado, lo que reduce la concentración de radical y macrómeros sin reaccionar presentes 14. Polimerizaciones-tiol-eno como los que emplean PEG (PEGN) forman hidrogeles norborneno funcionalizado mediante polimerización por crecimiento en etapas, y requieren el uso de PEGN y un agente de reticulación que contiene un promedio de más de dos grupos funcionales. Desde tiilo radicales reaccionan con uniones norborneno carbono-carbono dobles, multi-tiol que contiene agentes de reticulación se utilizan comúnmente para reticular hidrogeles PEGN, lo que permite fácil incorporación de péptidos con aminoácidos cisteína funcionalidades 7. Si bien existen numerosas otras químicas que reaccionan por polimerización por crecimiento en etapas (reacciones de adición de Michael como tiol-acrilato 15 y sulfona tiol vinilo 16 &quot;clic&quot; reacciones como alquino-azida 17, etc), los hidrogeles tiol norborneno son muy común, como la cepa deel anillo de norborneno aumenta significativamente la velocidad de reacción y disminuye la probabilidad de la polimerización de doble cadena que experimenta enlace norborneno 7. La decisión entre el metacrilato, norborneno, o funcionalización alternativo para facilitar la formación de hidrogel se basa en gran medida en el enfoque. Por ejemplo, la cadena-de crecimiento redes PEGDM polimerizado se han demostrado como muy adecuado para controlar la localización de células en el desarrollo de una ingeniería de tejidos periostio 18,19. Por crecimiento en etapas polimerizado redes de PEG son más adecuados para la incorporación de secuencias de péptidos para facilitar la degradación de hidrogel enzimáticamente-sensible, debido a la facilidad de incorporación de las secuencias de sustrato de la enzima utilizando tiol (cisteína) que contiene péptidos y norborneno macrómeros funcionalizados 20. Si la pregunta de investigación se aborda mejor mediante el uso de hidrogeles paso de crecimiento, Fairbanks et al. Proporciona una descripción detallada de la norborestrategia de funcionalización nene para PEG 7. Este detalle voluntad de papel cómo PEG y secuencias de péptidos se pueden funcionalizar (con un metacrilato de PEG, y una metacrilamida de péptidos) para reacciones de polimerización en cadena. Tradicionalmente, PEGDM se produce haciendo reaccionar PEG con cloruro de metacriloilo y trietilamina en diclorometano. La reacción se deja avanzar durante la noche a temperatura ambiente 11 durante 24 horas o 5, con algunos de los métodos que se extienden tiempo de reacción 4 días a 12 antes de la filtración, la precipitación en éter dietílico, y la recolección. Aunque existen muchas variaciones de este enfoque, todos son mucho tiempo, requieren una amplia gama de equipos de síntesis química, y no son el medio ambiente, ya que implican el uso de cantidades relativamente grandes de reactivos de alta pureza y solvente. Para sortear estas limitaciones, Lin-Gibson et al. Desarrollaron un método libre de solventes asistida por microondas para funcionalizar PEG con te<html> grupos metacrilato rminal (Figura 3A) 12. En esta reacción, los grupos alcohol terminales del PEG reaccionan con uno de los átomos de carbonilo del anhídrido metacrílico para formar un carboxilo. Esto genera el producto PEGDM, con ácido metacrílico como producto secundario. Esta síntesis tiene muchas de las ventajas características de la síntesis de microondas, incluida la reducción del tiempo de reacción y métodos de síntesis sin disolventes 21. La síntesis de microondas es preferible a los métodos discutidos anteriormente, ya que es significativamente más rápido, requiere un equipo menos extensa de síntesis (por ejemplo, material de vidrio, placas de reacción), y utiliza menos reactivo global y cantidades de disolventes como disolventes sólo son necesarios para la purificación del producto / colección y no para síntesis, lo que es más económica y respetuosa con el medio ambiente. 0px &quot;/&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . Figura 3:. Esquemas de funcionalización A) de poli (etilenglicol) se hace reaccionar con un exceso molar de 10 veces de anhídrido metacrílico para producir poli (etilenglicol) metacrilato B) Este mismo método se puede usar para funcionalizar el extremo N-terminal de las secuencias de péptidos, formando una. metacrilamida péptido funcionalizado. Mediante la realización de este procedimiento antes de escindir el péptido de la resina, la funcionalización selectiva de la N-terminal se puede realizar como grupos laterales de aminoácidos permanecen protegidos. n: número de PEG repite en el macrómero (n = 45,5, 227 y 455, respectivamente, para el 2, 10, y 20 kDa PEG lineal se utiliza). R1 a RN: cadenas laterales de aminoácidos. PG1 a PGN: protectores de cadena lateral grupos. TFA: ácido trifluoroacético. Consejos: triisopropilsilano. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octaneditHiol. H 2 O: agua. El método de metacrilación asistida por microondas se ha adaptado recientemente por nuestro grupo para funcionalizar el extremo N-terminal de péptidos con grupos de metacrilamida (Figura 3B) para facilitar la incorporación del péptido en una variedad de polímeros y redes poliméricas. En esta reacción, la amina primaria de la N-terminal del péptido reacciona con el átomo de carbonilo en el anhídrido metacrílico para formar una amida. Esto genera el péptido funcionalizado metacrilamida, con ácido metacrílico producido como un producto secundario. Cuando se utiliza este procedimiento para funcionalizar el extremo N-terminal de las secuencias de péptidos, es importante que los aminoácidos que contienen cadenas laterales reactivas (aminas primarios (lisina), alcoholes (serina, treonina), y fenoles (tirosina)) están protegidos durante la funcionalización, y grupos protectores sólo se escinden después de la incorporación metacrilamida. Este artículo demostrará ambos microondmétodos de ave con ayuda de sintetizar PEGDM y funcionalizar secuencias de péptidos sobre resina, destacando las dificultades comunes y sugiriendo métodos de solución de problemas. En este artículo, los métodos para la realización de técnicas químicas analíticas empleadas comúnmente para evaluar la funcionalización de productos se detallarán, y se les dará sugerencias y recursos para realizar modificaciones más avanzadas. Los resultados típicos se demostraron, que incluyen el uso de la PEGDM sintetizada para formar redes de hidrogel, la explotación de los hidrogeles formados para controlar la liberación de un fármaco modelo, y el empleo de péptidos funcionalizados para facilitar las interacciones célula-hidrogel. Se prestará especial atención a la caracterización de hidrogel de tamaño de malla y discutir cómo la composición de hidrogel se puede ajustar para afectar a esta propiedad física subyacente, que a su vez controla las propiedades del material a granel, tales como la rigidez y el perfil de liberación del fármaco.

<table><tbody><tr><td>3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol</td><td>Tokyo Chemical Industry Co, Ltd</td><td>D2649</td><td>CAS 14970-87-7</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1648</td><td>CAS 75-05-8</td></tr><tr><td>Aminoácidos</td><td>AAPPTech</td><td>Glicina: AFG101</td><td>CAS 29022-11-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Arginina: AFR105</td><td>CAS 154445-77-9</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Asparagina: AFD105</td><td>CAS 71989-14-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Serina: AFS105 CAS</td><td>71989-33-8</td></tr><tr><td>Éter dietílico anhidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN1155</td><td>CAS 60-29-7</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1857</td><td>CAS 77-92-9</td></tr><tr><td>Cloroformo deuterado</td><td>Cambridge Isotope Laboratories Inc.</td><td>DLM-7-100</td><td>CAS 865-49-6</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN1593</td><td>CAS 75-09-2</td></tr><tr><td>Diisopropiletilamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1181</td><td>CAS 7087-68-5</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119-4</td><td>CAS 68-12-2</td></tr><tr><td>Resina Fmoc-Gly-Wang</td><td>Péptidos internacionales</td><td>RGF-1301-PI</td><td>100-200 tamaño de malla</td></tr><tr><td>Metacrílico anhídrido</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14357</td><td>CAS 760-93-0</td></tr><tr><td>N-metilpirrolidona</td><td>VWR</td><td>BDH1141-4LG</td><td>CAS 872-80-4</td></tr><tr><td>Péptidos en resina</td><td>Sintetizados internamente</td><td></td> Los <td>péptidos en resina también se pueden comprar en Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.</td></tr><tr><td>O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametil-uronio-hexafluorofosfato</td><td>AnaSpec Inc</td><td>510/791-9560</td><td>CAS 94790-37-1</td></tr><tr><td>Calibración de péptidos Cuidado estándar 206195</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>piperazina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15019</td><td>CAS 11-85-0</td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol) 2 kDa lineal</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22181</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol) 10 kDa lineal</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol) 20 kDa lineal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81300</td><td>JenKem Technologies USA es un proveedor alternativo de ácido trifluoroacético PEG lineal y multibrazo</td></tr><tr><td></td><td>Alfa Aesar</td><td>L5464</td><td>CAS 100-68-5</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td>CAS 76-05-1</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>Alfa Aesar</td><td>L09585</td><td>CAS 6485-79-6</td></tr><tr><td>&alpha;-Ciano-4-hidroxicinámico</td><td>ácido Tokio Industria química Co, LTD</td><td>C1768</td><td>CAS 28166-41-8</td></tr></tbody></table>

funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y formación de hidrogel

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Uno de los principales beneficios al uso de poli (etilenglicol) (PEG) macrómeros en la formación del hidrogel es versatilidad sintética. La capacidad de extraer de una gran variedad de pesos moleculares de PEG y configuraciones de brazo (número, longitud del brazo, y el patrón de ramificación) proporciona un control estricto sobre los investigadores resultante estructuras de hidrogel y propiedades, incluyendo el módulo de Young y el tamaño de malla. Este video ilustra un método rápido, eficiente, libre de solventes, asistida por microondas de metacrilato precursores de PEG en poli (etilenglicol) dimetacrilato (PEGDM). Este método sintético proporciona materiales de partida muy necesarios para su aplicación en la administración de fármacos y la medicina regenerativa. El método demostrado es superior a los métodos tradicionales metacrilación ya que es significativamente más rápido y sencillo, así como más económico y respetuoso con el medio ambiente, el uso de cantidades más pequeñas de reactivos y disolventes. También vamos a demostrar una adaptación de esta técnica para el metacrilato de resinafuncionalización ilamida de péptidos. Este método en-resina permite que el extremo N-terminal de péptidos a estar funcionalizado con grupos de metacrilamida antes de la desprotección y escisión de la resina. Esto permite la adición selectiva de grupos de metacrilamida a la N-terminales de los péptidos mientras que los aminoácidos con grupos reactivos secundarios (por ejemplo, amina primaria de la lisina, alcohol primario de la serina, treonina de alcoholes secundarios, y fenol de tirosina) permanecen protegidos, la prevención de funcionalización en múltiples sitios. Este artículo detallará métodos analíticos comunes (espectroscopia de resonancia magnética nuclear protónica (, H-RMN) y láser asistida por matriz de desorción ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF)) para evaluar la eficiencia de las funcionalizaciones. Errores comunes y sugiere métodos para solucionar problemas se abordarán, como modificaciones de la técnica que se puede utilizar a una mayor funcionalidad macrómero sintonizar e hidrogel resultante física y químicapropiedades. El uso de productos de síntesis para la formación de hidrogeles para administración de fármacos y estudios de interacción célula-material se demostró, con especial atención a la modificación de la composición de hidrogel para afectar al tamaño de malla, el control de la rigidez de hidrogel y la liberación del fármaco.

Resonancia magnética nuclear de protones es una de las técnicas analíticas más comunes para evaluar la eficiencia de una reacción química, como el área bajo cada pico de espectros es proporcional a los niveles relativos de que de protones en la muestra, lo que permite la determinación de las proporciones de producto y reactante en la muestra. Para esta reacción, el análisis por 1H-RMN (Figura 4) se puede utilizar para calcular la funcionalización% de lo observado: relación teórica de protones de metacrilato de terminales (A, B y C) para centrales protones de PEG (d). El PEGDM se muestra en la Figura 4 era 2000 Da antes de la funcionalización, por lo tanto n = 2000 Da / (44 Da / PEG de repetición) = 45.5, por lo que d = 4 * (n-1) = 178, por lo que el protón: proporción de la unidad de RMN 178 / 102,16 = 1,74. En este caso, el pico A no se puede utilizar en la evaluación de% de funcionalización, como la presencia de agua en la muestra aumenta artificialmente el área bajo el pico. Usando pico b, la funcionalización% es 1.00 * 1.74 / 2 * 100% = 87,1%; using pico c, la funcionalización% es de 1,08 * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Por lo tanto, la funcionalización% global es 91% y esto PEGDM está funcionalizado adecuadamente para su uso en la síntesis de hidrogel. Típicamente, aproximadamente el 90% de funcionalización se consigue después de una sola ronda de metacrilación. Debido a la gran cantidad de picos de protones que se plantean en el análisis de 1H-RMN de péptidos, funcionalización péptido se investigó con mayor facilidad utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas. Esto se demuestra en la Figura 5, donde se sintetizó el péptido GKRGDSG y se sometió a metacrilamida funcionalización. Una pequeña fracción del péptido se escindió para prefunctionalization evaluación peso molecular (Figura 5A), que mostró el pico observado de peso molecular que se encuentra en 676 g / mol, el peso molecular esperado del péptido, indicando correcta síntesis de la secuencia del péptido. El resto del péptido se sometió a metacrilamida funcionalción antes de la escisión. Como este péptido contiene Pbf aminoácidos protegidos R, la escisión se llevó a cabo en un cóctel que contiene tioanisol durante 4 horas. Después de funcionalización metacrilamida, el pico observado de peso molecular se produce a 744 g / mol (Figura 5B), el peso esperado de la metacrilamida funcionalizado péptido (676 68 g / mol) y no en el peso molecular esperado del péptido sin funcionalizar, lo que indica correcta funcionalización. Para demostrar la funcionalidad tanto de la PEG y el péptido metacrilamida funcionalizado, hidrogeles PEGDM fueron producidos con y sin 0,5 mM metacrilamida funcionalizado GKRGDSG (Figura 6). Los hidrogeles fueron producidos con 10% en peso lineal de 10 kDa PEGDM en PBS, con 0,05% en peso de litio fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) como fotoiniciador. La solución de precursor de hidrogel se inyecta entre dos portaobjetos de vidrio separados por un espaciador portaobjetos de vidrio y se mantienen unidas con clips de la carpeta. Entonces disolución precursora se expone a la luz UV 365 nm a 2 mW / cm 2 durante 10 minutos para inducir la reticulación, después de lo cual los geles de 8 mm de diámetro se recogieron utilizando un punzón cilíndrico. Los geles se lavaron en PBS y se dejaron hinchar durante 2 días para asegurar las condiciones de equilibrio de hinchamiento se lograron 16,20. MSC humanas (paso 3) se hicieron crecer hasta 80% de confluencia y se sembraron en hidrogeles a 15.000 células / cm 2. Las células se dejaron adherir durante 48 horas antes de ser transferidos a medio fresco que contenía 0,5 l / ml de calceína AM y 2 l / ml de homodímero de etidio (kit de Viabilidad vivas / muertas de Invitrogen) y fotografiado bajo contraste de fase y fluorescencia a un aumento de 10X utilizando una Nikon Eclipse Ti 2000. MSC fueron incapaces de adherirse a los hidrogeles de PEG no funcionalizados (Figura 6A), sino sobre la inclusión de péptido RGD de adhesión de células que eran capaces de adherirse a y se extendió sobre la superficie del hidrogel (Figura 6B). Las imágenes vivas / muertaspresentado no representan la viabilidad de la población sin semillas MSC, como MSC son células de adhesión dependiente que se desprenden de la superficie del gel después de la muerte y que se eliminan durante el proceso de transferencia de los medios de comunicación, lo que resulta en la inflación artificial de la viabilidad celular se sembró. Más bien, las imágenes fluorescentes están destinados a delimitar entre las células adherentes y las pequeñas variaciones en la topología de hidrogel, que puede ser difícil bajo contraste de fase solo. Curiosamente, las células nonspread sembraron en el PEG-sólo geles de tinción positiva tanto para el AM de calceína y homodímero de etidio, lo que indica que las células estaban muriendo en el momento de formación de imágenes. Una de las muchas ventajas de hidrogeles de PEG es su naturaleza altamente sintonizable. Modificación de la composición específica del hidrogel de PEG proporciona a los investigadores un alto grado de control sobre propiedades tales como el módulo de elasticidad. Como se ilustra en la Figura 7, tanto el peso molecular de PEG (Figura 7A) y porcentaje en peso ( <strong&gt; Figura 7B) son conocidos para controlar el tamaño de malla de hidrogel (ξ) y rigidez hidrogel resultante y la tasa de fármacos encapsulados en libertad. Esto se demostró mediante la producción de hidrogeles con diferentes PEGDM peso molecular, e investigar el módulo de hidrogel resultante y el tamaño de malla (Figura 8). Todos los hidrogeles fueron producidos con 10% en peso PEGDM lineal en PBS, con 0,05% en peso LAP como fotoiniciador. 40 l de solución de precursor de hidrogel fue de 1 ml en jeringas con las puntas cortadas, y se expusieron a 365 nm de luz UV a 2 mW / cm 2 durante 10 min para formar hidrogeles, la producción de geometrías cilíndricas de aproximadamente 5 mm de diámetro y 2 mm de altura . Los geles se dejaron hinchar en PBS durante 2 días antes de la prueba mecánica. Módulo de hidrogel se determinó utilizando un MTS QT / 5 con una célula de carga de 5 N mientras la compresión de entre 5 y 10% de la altura inicial de hidrogel a una velocidad de 0,1 mm / seg. Después de que se completó el ensayo mecánico, tamaño de malla se determinó mediante la medición de hidrogel Mass antes de la (s M) y post-(M D) 24 horas de liofilización a través de la ecuación de Flory-Rehner como se detalla en la sección de discusión, con los cálculos realizados en MATLAB. Como hipótesis, aumentar el peso molecular del PEG macrómero provocó un aumento de tamaño de malla de hidrogel (Figura 8A) y una disminución en la rigidez de hidrogel (Figura 8B). Hidrogel tamaño de malla y la rigidez del gel resultante también se pueden controlar mediante la alteración de porcentaje en peso de PEG. Los hidrogeles fueron producidos con diferentes% en peso de lineal de 10 kDa PEGDM, y la rigidez de hidrogel y el tamaño de malla se determinaron como se ha descrito anteriormente (Figura 9). Como se ilustra en la Figura 7B, el aumento de% en peso de PEG causa una disminución significativa en el tamaño de malla (Figura 9A) y aumento en la rigidez de hidrogel (Figura 9B). Los hidrogeles que contienen albúmina de suero bovino encapsulado (BSA) se forman usando diferentes moleculaR PEG de peso (2, 10, y 20 kDa). Todos los hidrogeles fueron producidos con 10% en peso PEGDM en PBS que contenía 50 mg / ml de BSA, tal como se describe para la Figura 6. Los geles se incubaron en 1 ml de PBS a 37 º C, y se transfirieron a PBS fresca en cada punto de tiempo. BSA liberado se cuantificó usando el ensayo de Bradford de Thermo Scientific. Hidrogel tamaño de la malla se determinó como se describe para la Figura 8. Como se ilustra en la Figura 7A, la liberación de BSA se produce más rápidamente a partir de hidrogeles formados usando PEGDM mayor peso molecular, como un resultado del tamaño de malla más grande en el hidrogel (Figura 10). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. Representante 1 H-RMN de 2 kDa lineal PEGDM funcionalizado usando el método asistida por microondas. Funcionalización por ciento puede ser CAlculated basado en la observación:. relación teórica de protones metacrilato terminales (a, byc) a centrales protones PEG (d) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig5.jpg" width="500px" /> Figura 5. Representante de MALDI-TOF de GKRGDSG péptido (a) antes y (b) después de funcionalización usando el método asistida por microondas. Tenga en cuenta que el pico de peso molecular observada después de la funcionalización se produce a 744 g / mol, el peso esperado del péptido metacrilamida funcionalizado (676 68 g / mol) y no en el peso molecular esperado del péptido anti-funcionalizado (676 g / mol). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . Figura 6. Contraste de fase Representante (izquierda) y vivas / muertas (verde / rojo) imágenes fluorescentes (derecha) de las MSC cultivadas en geles A) PEG solos y B) geles de PEG que contienen 0,5 mM metacrilamida GKRGDSG funcionalizado. MSCs son capaces de adherirse y difundir el los geles PEGDA solos, pero después de la incorporación del péptido RGD de adhesión celular, son capaces de adherirse a y se extendió sobre la superficie del hidrogel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig7.jpg" width="500px" /> Figura 7. A) PEG de peso molecular y B) PEG porcentaje de peso utilizada para formar redes de hidrogel afecta hidrogel tamaño de malla (_8 ;) y la rigidez de hidrogel resultante y la tasa de fármacos encapsulados liberar. A) Aumento de peso molecular de PEG (de izquierda a derecha) en porcentaje en peso constante aumenta el tamaño de malla del hidrogel, la disminución de la rigidez de hidrogel y el aumento de la tasa de liberación del fármaco. B) disminuyendo el peso porcentaje de PEG (izquierda a derecha) que se utiliza para formar hidrogeles aumenta el tamaño de malla de hidrogel, de manera similar disminuir la rigidez de hidrogel y el aumento de la tasa de liberación del fármaco (no a escala). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig8.jpg" width="500px" /> Figura 8. A) y B aumenta de tamaño de malla) rigidez hidrogel disminuye al aumentar el peso molecular del macrómero PEG. N = 10, las barras de error = SEM, *** p &amp;# 60; 0,001 por ANOVA de una vía con la prueba post-hoc de Tukey HSD. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig8highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig9.jpg" width="500px" /> La Figura 9. A) Malla disminuye y B de tamaño) rigidez aumenta con el aumento de hidrogel% en peso de PEG. N = 9-10, barras de error = SEM, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001 por ANOVA de una vía con HSD de Tukey post- hoc test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig9highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 10" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig10.jpg" width="500px" /> Figura 10. La liberación de encamodelo psulated bovina drogas albúmina de suero (BSA) a partir de hidrogeles formados usando 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa de peso molecular de PEG. liberación de BSA se produce más rápidamente a partir de hidrogeles formados usando mayor peso molecular PEGDM, como un resultado del tamaño de malla más grande en el hidrogel . n = 6, las barras de error = SEM. La BSA% liberado es significativamente diferente (p &lt;0,0001) entre los tres grupos en cada punto de tiempo, excepto t = 1 y 2,5 horas cuando la liberación de los geles 2 y 10 kDa son equivalentes, por dos vías de repetición-medidas ANOVA con Bonferroni post-hoc test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig10highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

Este video ilustrar un método rápido y eficiente de metacrilato de poli (etilenglicol), lo que permite polimerizaciones de cadena y la síntesis de hidrogel. Demostrará cómo introducir de manera similar funcionalidades metacrilamida en péptidos, detalle los métodos analíticos comunes para evaluar la eficiencia de funcionalización, proporcionar sugerencias para la solución de problemas y modificaciones avanzadas y demostrar las técnicas típicas de caracterización de hidrogel.

Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

El objetivo general de este procedimiento es funcionalizar el polietilenglicol y los péptidos con grupos metacrilato para las posteriores polimerizaciones en cadena y síntesis de hidrogel. Esto se logra combinando primero metanfetamina, anhídrido acrílico y el precursor funcionalizado de la ONU en un frasco de centelleo. El segundo paso es utilizar la energía de microondas para funcionalizar la clavija o péptido.A continuación, el PEG DM se disuelve en clorometano, o el péptido se separa de la resina. Y todos los grupos protectores de la cadena lateral se eliminan en un cóctel a base de ácido. El paso final es precipitar el péptido funcionalizado PEG DM o metacrilamida en éter.En última instancia, la RMN de protones o la espectrometría de masas de tiempo de vuelo de Maldi se utilizan para mostrar la funcionalización exitosa de la macro de péptidos o peg. Hola, mi nombre es Amy Van Hove. Soy estudiante de doctorado en el departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Rochester.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la reacción de PEG con fluoruro acrílico de metanfetamina, es que la reacción es significativamente más rápida y más respetuosa con el medio ambiente. Hola, mi nombre es Brandon Wilson. Soy estudiante de ingeniería química en la Universidad de Rochester.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los biomateriales, como la forma en que los hidrogeles producidos con peg dimetilo se pueden emplear para controlar la entrega de células terapéuticas en moléculas. Hola, soy Danielle Benoit, profesora asistente en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Rochester. Las implicaciones de esta técnica son para el desarrollo de terapias para una variedad de enfermedades, ya que los compuestos sintetizados se pueden utilizar para aplicaciones de administración de células y fármacos.Antes de comenzar este procedimiento, pred secó la cristalería requerida en un horno durante una hora para evitar la contaminación con agua en un bote grande de suero. Salen cinco gramos de clavija con un peso molecular entre 1000 y 100.000 daltons. Si está presente, retire la pieza de plástico de la tapa de un frasco de centelleo en la campana química.Dispense 10 molares de exceso de anhídrido acrílico de metanfetamina en un frasco de centelleo desgarrado. A continuación, añada PEG al vial. A continuación, gire sin apretar la tapa sobre el vial y coloque el vial en el microondas.Configure el microondas a cinco minutos a máxima potencia con guantes resistentes al calor. Retire el vial del microondas cada 30 segundos. A continuación, apriete completamente la tapa y agite la muestra durante 30 segundos.Afloje la tapa antes de devolver el vial al microondas. Repita estos pasos hasta que la solución se haya calentado en el microondas durante los cinco minutos completos. Después de sacar el vial del microondas, afloje la tapa y deje que el PEG DM se enfríe a temperatura ambiente.A continuación, disuelva el PEG DM en 10 a 15 mililitros de diclorometano. Precipitar el PEG DM en 10 veces más de éter predathyl durante 20 minutos. Utilizando un embudo Buckner de siete centímetros y un matraz de 500 mililitros.Recoja el PEG DM por filtración al vacío. A continuación, transfiera el PEG DM filtrado a un tubo cónico de 50 mililitros con una aguja de calibre grande perforada a través de la tapa para la ventilación. Coloque el tubo en una cámara de vacío y seque el PEG DM durante la noche.Después de quitar el tubo de la cámara de vacío, disuelva el PEG DM en precipitado de clorometano DI con éter datílico helado. Para eliminar el anhídrido acrílico metanfetamina no reactivo después de la filtración y la recolección, seque el PEG DM en una cámara de vacío de la misma manera que antes. Para el análisis de RMN de protones, coloque aproximadamente 10 miligramos de PEG DM en un vial de centelleo y agregue aproximadamente un mililitro de cloroformo deuterado.Una vez que la muestra se haya disuelto, transfiérala a un tubo de RMN limpio. A continuación, recoja los espectros de RMN de protones y ejecute las muestras a temperatura ambiente durante al menos 64 escaneos para obtener una resolución de datos suficiente. Después de sintetizar el péptido de interés mediante síntesis en fase sólida, guárdelo en la resina en DMF a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para su uso.A continuación, recoge la resina peptídica por filtración utilizando un embudo buckner de siete centímetros con papel de filtro y un matraz de 250 mililitros. Retire la pieza de plástico de la tapa de un vial de centelleo y transfiera la resina al vial. Con una pipeta desechable, agregue suficiente anhídrido acrílico de metanfetamina para cubrir la resina Después de girar sin apretar la tapa sobre el vial, colóquelo en el microondas y configure el temporizador en tres minutos.A máxima potencia, con guantes resistentes al calor, retire el vial del microondas cada 15 a 20 segundos. Después de apretar completamente la tapa, agite la muestra durante 15 segundos. Afloje la tapa antes de devolver el vial al microondas.Repita estos hasta que la solución se haya calentado en el microondas durante los tres minutos completos. Con la tapa del vial aflojada, deje que la solución peptídica se enfríe a temperatura ambiente usando una pequeña cantidad de DMF y un embudo de siete centímetros. Con papel de filtro y un matraz de 250 mililitros.Recoja la resina peptídica del vial para obtener un escote y una protección profunda. Transfiera la resina peptídica a un vial de centelleo nuevo para obtener 0,25 milimoles de péptido que contenga arginina. Agregue 0.25 mililitros de propileno tri ISO, tres seis dióxido de carbono, uno de ocho octanos, diol tiol, agua desionizada y 18.0 mililitros de TFA.A continuación, gire la mezcla de reacción en un rotador de terremotos de laboratorio durante cuatro horas a temperatura ambiente. Cuando termine, precipite el péptido en 10 veces más de éter etílico preenfriado. Divida la solución uniformemente entre cuatro tubos cónicos de 50 mililitros, centrifugue las cuatro muestras a 3.200 G durante 10 minutos para recoger el péptido después de la centrifugación, decante el éter y vuelva a suspender el péptido en 100 mililitros de éter etílico fresco dividido en dos tubos cónicos de 50 mililitros.Repita el proceso de centrifugación. Repus, suspendiendo el péptido en 50 mililitros de éter fresco dos veces durante un total de cuatro lavados con éter, después de la última etapa de centrifugación, decanta el éter residual y seca el péptido durante la noche al vacío. Para preparar la muestra para el análisis del tiempo de vuelo de Maldi, coloque uno o dos miligramos del péptido en un tubo de einor de 1,5 mililitros y disuelva la muestra en un mililitro de disolvente Maldi.A continuación, prepare una solución de matriz de 10 miligramos por mililitro de ácido alfa cuatro hidroxicerámico en el disolvente multis. Combine las soluciones de péptidos y matrices en una proporción de uno a uno, coloque un microlitro de la solución combinada en tres ubicaciones separadas en la placa de muestra MALDI. Seca las manchas con una pistola de calor.A continuación, vuelva a localizar y secar cada muestra. Finalmente, recoja los datos de tiempo de vuelo de MALDI y confirme un aumento de 68 gramos por mol en el peso molecular debido a la adición del grupo metacrilamida al extremo final del péptido. Aquí se muestra el espectro de RMN de un PEG DM lineal de dos kilodalton funcionalizado utilizando el método asistido por microondas para esta reacción.El análisis de RMN de protones se puede utilizar para calcular el porcentaje de funcionalización desde la relación observada hasta la teórica de los protones de metacrilato terminal y los protones PEG centrales. El porcentaje total de funcionalización es del 91% y este PEG DM está adecuadamente funcionalizado para su uso en la síntesis de hidrogel. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre el cálculo del porcentaje de funcionalización debido a la multitud de picos de protones que surgen en el análisis de RMN de protones de péptidos pep.La funcionalización de péptidos se investiga más fácilmente utilizando la espectrometría de masas de tiempo de vuelo maldi. Esto se demuestra aquí donde el péptido G-K-R-G-D-S-G se sintetizó y se sometió a la funcionalización de la metacrilamida, una pequeña fracción del péptido se escindió para la evaluación del peso molecular previa a la funcionalización, que mostró el pico de peso molecular observado que ocurría a 676 gramos por mol, el peso molecular esperado del péptido, el resto del péptido se sometió a la funcionalización de la acrilamida de metanfetamina antes de la escisión después de la funcionalización de la acrilamida de metanfetamina. El pico de peso molecular observado se produce a los 744 gramos por mol, el peso esperado del péptido funcionalizado con acrilamida metanfetamina.Para demostrar la funcionalidad tanto del PEG DM como de los péptidos funcionalizados con acrilamida metanfetamina, se produjeron hidrogeles PEG con y sin metanfetamina de 0,5 milimolares. La acrilamida funcionalizada GK R-G-D-S-G que se muestra aquí es representativo de contraste de fase e imágenes fluorescentes muertas vivas de MSC en geles peg solos y en geles peg que contienen el péptido funcionalizado con metanfetamina. Las MSC no pudieron adherirse a los hidrogeles peg funcionalizados por la ONU, pero tras la inclusión del péptido de adhesión celular RGD, pudieron adherirse y propagarse en la superficie del hidrogel.Las imágenes de muertos vivos no representan la viabilidad de la población de MSC sembrada. Más bien, las imágenes fluorescentes están destinadas a demarcar entre las células de adherencia y las pequeñas variaciones en la topología del hidrogel, lo que puede ser difícil solo con el contraste de fase. Curiosamente, las células no esparcidas sembradas en el PEG solo se tiñen positivamente tanto para el calcio AM como para el homodímero AUM, lo que indica que las células estaban muriendo en el momento de la toma de imágenes.Una de las muchas ventajas de los hidrogeles PEG es su naturaleza altamente sintonizable que modifica la composición específica de la clavija. El hidrogel ofrece a los investigadores un alto grado de control sobre propiedades como el módulo de elasticidad, como se ilustra aquí. Se sabe que tanto el peso molecular como el porcentaje de peso de PEG controlan el tamaño de la malla de hidrogel, el hidrogel resultante, la rigidez y la tasa de liberación de los fármacos encapsulados.Esto se demostró mediante la producción de hidrogeles con peso molecular variable, PEG dm, e investigando el módulo de hidrogel resultante y el tamaño de malla según la hipótesis, aumentando el peso molecular de la clavija. Macer provocó un aumento en el tamaño de la malla de hidrogel y una disminución en la rigidez del hidrogel, el tamaño de la malla de hidrogel y la rigidez de gel resultante también se pueden controlar alterando el peso. El porcentaje de hidrogeles PEG se produjo con peso variable.Se determinó el porcentaje de DM y la rigidez del hidrogel y el tamaño de la malla de PEG lineal de 10 kilodaltons, como se ilustra aquí, el aumento del porcentaje de peso de PEG provoca una disminución significativa en el tamaño de la malla y un aumento en la rigidez del hidrogel. Los hidrogeles que contenían albúmina sérica bovina encapsulada se formaron utilizando clavijas de peso molecular variable, como se muestra aquí. La liberación de albúmina sérica bovina se produce más rápidamente a partir de hidrogeles formados con PEG DM de mayor peso molecular como resultado del mayor tamaño de malla dentro del hidrogel.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar el elogio PEG DME utilizando el método asistido por microondas y cómo evaluar la funcionalización usando RMN de protones. Una vez que se domina este procedimiento, también se puede utilizar la apertura del anillo de los grupos hidrolíticos degradables para responder a preguntas adicionales sobre cómo la degradación del hidrogel afecta a la función celular. También debe tener una buena comprensión de cómo se puede utilizar esta técnica para incorporar selectivamente las funcionalidades de la acrilamida de metanfetamina en las secuencias de péptidos del extremo final y cómo evaluar esta funcionalización utilizando espectrometría de masas de tiempo de vuelo múltiple.Gracias por mirar.

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Se describen los protocolos para la fabricación de hidrogeles degradables interpenetrantes basados en hidrazona Cross-linking de oligómeros poliméricos en la escala de a granel microescala, nanoescala y el último para la preparación de nanopartículas de gel y nanofibras.

Fabricación de hidrogeles degradables de interpenetrantes en múltiples escalas de la longitud mediante extrusión reactiva, microfluídica, uno mismo-Asamblea y Electrospinning

Este protocolo presenta tres métodos de preparación rápidos y sencillos que utilizan las condiciones ambientales para desencadenar el autoensamblaje de péptidos en hidrogeles. Además, se describe la caracterización de los hidrogeles peptídicos, demostrando que se pueden formar hidrogeles peptídicos mecánicamente estables en estas sencillas condiciones.

Preparación de hidrogeles de péptidos autoensamblados mecánicamente estables

Asistida por microondas dehydrogenative intramolecular Diels-Alder (DA) reacciones proporcionan acceso concisa a ciclopenta funcionalizado...

Asistida por microondas intramoleculares Dehydrogenative Diels-Alder para la síntesis de naftalenos funcionalizados / Tintes solvatocrómico

Aprende a funcionalizar poli(etilenglicol) y péptidos mediante energía de microondas para sintetizar hidrogeles. Este método rápido y ecológico facilita aplicaciones en liberación de fármacos e ingeniería de tejidos.

Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel (Video) | JoVE Journal

Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

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