Name: In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprende a visualizar la migración de neuroblastos en cerebro postnatal de ratón mediante electroporación in vivo y time-lapse. Este método permite analizar dinámicas celulares en neurogénesis.

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MS y YZ son apoyados por KCL y KCL-China becas de doctorado. MO fue financiado por una beca de doctorado de Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Damos las gracias a Masaru Okabe y Jun-ichi Miyazaki para el plásmido PCX-EGFP y Alain Chedotal y Atenea Ypsilanti para consejos valiosos sobre la electroporación.

Este procedimiento es conforme a los reglamentos del RU Home Office (Ley de Procedimientos Científicos Animal, 1986). Los científicos deben seguir las directrices establecidas y aprobadas por sus órganos reguladores animales institucionales y nacionales. 1. Postnatal electroporación 1.1. Preparación de vidrio capilares, solución de ADN y Electroporador <ol><li> Preparar capilares de vidrio tirados (OD: 1.5 mm, ID: 0,86 mm) para la inyección de ADN. (Ajustes indicativos de un capilar extractor Sutter P-97 son: Heat 283; Tire 50; Velocity 90, Hora 50). Haga una marca en el capilar que corresponde a un volumen de aproximadamente 2 l. </li><li> Ajuste la tensión del electroporador a 5 pulsos cuadrados, 50 mseg / pulso a 100 V, con 850 intervalos ms (100 V, impulso ON 50 ms, pulso OFF 850 ​​ms, pulso 5). </li><li> Diluir de alta pureza (OD 260/280&gt; 1,80) plásmido de ADN libre de endotoxina a una concentración final de 1-2 mg / lcon endotoxina liberar tampón Tris-EDTA o PBS. Se recomienda añadir 0,1% Verde rápido a la solución de ADN (el colorante debe extenderse en el ventrículo cuando se inyecta con éxito). </li><li> Prepare los electrodos de 5-7 mm, el gel de electrodos y calentar la almohadilla térmica. </li></ol> 1.2. La electroporación <ol><li> Quitar un postnatal día 2 crías de ratones de la jaula y anestesiar por inhalación de isoflurano (con un flujo de ~ 0,6 L / min). </li><li> Después de aproximadamente 1 min, determinar el estado de anestesia usando la respuesta de presión del pie. Si no se produce ningún movimiento, proceder a la inyección intraventricular. </li><li> Carga de la aguja capilar con 1-2 l de ADN usando un tubo aspirador conectado al capilar. </li><li> En virtud de una fuente de luz fría, mantenga la cabeza de la cría entre el pulgar y el dedo índice de su mano menos dominante. Tire ligeramente de la piel de la espalda en la cabeza para ayudar a identificar el punto de inyección derecha. </li><li> Considere la posibilidad de una línea virtual entre el ojo y tél craneométricos lambda hito (Figura 1A). Insertar la aguja capilar en alrededor de un tercio de la longitud de esta línea de la lambda (alrededor de 1 mm desde el punto medio de línea) 15. Introduzca el capilar de unos 2 mm de profundidad, asegurándose de evitar la penetración profunda en el cerebro. </li><li> Inyectar plásmido soplando lentamente a través de la boca (una jeringa conectada al capilar también se puede utilizar). Durante este procedimiento, asegúrese de que sus dedos no están aplicando demasiada presión en el cerebro, ya que esto puede evitar la inyección de plásmido éxito. </li><li> Deje de inyección cuando se deja una cantidad mínima de solución de ADN en el capilar. Es aconsejable inyectar menos de 1 l para evitar un aumento perjudicial de la presión intracraneal. </li><li> Cubra ambos electrodos con gel y los colocan con el lado positivo en el lado lateral del hemisferio donde se inyectó el ADN (Figura 1A). Para la incorporación de ADN en el rostral SVZ, colocar electrodos ligeramente rostral a lapunto de inyección. Variando la posición del electrodo puede lograr especificidad regional de la electroporación en diferentes áreas de la SVZ 22,25. </li><li> Inicie la transferencia actual presionando el pedal del interruptor de pie del pulso. Cuando la electroporación es completa, verifique el voltaje en la pantalla electroporador (valores de tensión no deben estar por debajo de 90 V, ya que los valores de tensión más baja se correlaciona con la baja eficiencia de la electroporación). </li><li> Reanimar el cachorro bajo de oxígeno en la almohadilla caliente durante unos minutos y devolverlo a la jaula, colocándola lejos de la madre. Asegúrese de que la madre recupera el cachorro y se reúne con el resto de la camada. Después de la electroporación, deje cachorros con su madre durante 4-7 días antes de la siguiente etapa. </li></ol> 2. Preparación de las Culturas aguda de cortes de cerebro 2.1. Preparación de las soluciones y herramientas <ol><li> Las siguientes soluciones se requieren (también es posible utilizar DMEM de alta glucosa para la disección y de formación de imágenes17): Disección Medio (500 ml) Balanced medios de Gey - 500ml 45% de glucosa - 5ml Película Medio (10 ml) 45% de glucosa - 0.110 ml HEPES 1 M - 0.100 ml Pen / Strep - 0.100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 ml Glutamina - 0.200 ml Dulbecco Modificado Medio Eagle (libre de rojo fenol) - 8,89 ml </li><li> Mediano película Calentar a 37 ° C. </li><li> Coloque Millicell inserta en un plato de cultivo de fondo 35 mm de vidrio que contiene 1 ml de medio de películas y colóquelo en un incubador humidificado a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Preparar vibratome accesorios (destornillador, cámara, hojas de afeitar, pegamento). </li><li> Preparar herramientas de disección: tijeras, pequeña espátula, pinzas rectas. </li><li> Preparar las herramientas para el manejo de rebanadas: pincel pequeño o un asa de inoculación suave (tamaño: 10 l), pipetas Pasteur de plástico, una caja de hielo y varios platos de plástico de 6 cm. </li><li> PreCool el medio de diseccióna 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Preparación del cerebro Slices <ol><li> Llene un recipiente de 6 cm con medio disección previamente enfriada y colocarlo en hielo (para mantener rodajas recién cortadas). </li><li> Después de la dislocación cervical, use tijeras para decapitar al cachorro ratón. Retire el cuero cabelludo con un bisturí, cortar el cráneo largo de la sutura sagital medial del OB en el cerebelo y retire suavemente las aletas craneales utilizando fórceps. Asegúrese de que todo el cerebro está expuesto y cuidadosamente diseccionar a cabo utilizando una espátula, teniendo especial cuidado de no dañar el tejido. La disección se tiene que hacer con cuidado, pero al mismo tiempo muy rápidamente (menos de un minuto si es posible). La dislocación cervical es nuestro método preferido porque la anestesia terminal con anestésicos drogas / gas pueden influir sobre las propiedades migratorias de los neuroblastos y la prosperidad de los cultivos de cortes de cerebro, que necesitan para ser fotografiado con relativa rapidez después del sacrificio de los animales. </li><li> Hemisect el cerebro con una razo cuchilla (Figura 2). Deseche hemisferio no inyectada o el uso para otros experimentos. </li><li> Coloque un pequeño trozo de cinta adhesiva en el titular vibratome y utilizar la cantidad mínima necesaria de pegamento para unir el hemisferio cerebral en la parte superior del mismo (Figura 2). Esto evita dañar la superficie de soporte debido a las aplicaciones repetidas de pegamento. </li><li> Deje que el pegamento se seque durante unos segundos. </li><li> Coloque en la bandeja del sostenedor vibratome lleno de solución disección previamente enfriada. Apuntar el bulbo olfatorio hacia la cuchilla (Figura 2). </li><li> Empiece a cortar el hemisferio cerebral usando los ajustes apropiados. Se recomiendan los siguientes parámetros: grosor de corte de 300 m; velocidad de ~ 3-5; frecuencia ~ 9. De alta frecuencia y baja velocidad se recomiendan para evitar daños en la división. </li><li> Recoger rebanadas utilizando un pincel pequeño o un asa de inoculación suave. Sólo mantener las rebanadas con OB visible (generalmente 2-3 rebanadas / cerebro). Típicamente, la porción que contiene la mayor parte de los RMS can se encuentra en ~ 300 micras desde la superficie inferior. </li><li> Compruebe las rebanadas con un microscopio fluorescente estándar para la señal de las buenas prácticas agrarias (asegurándose de darle la vuelta para comprobar la fluorescencia en ambos lados), y elegir los que muestran fluorescencia brillante a lo largo de la mayor parte de los RMS. </li></ol> 2.3. El cultivo de cerebro Slices <ol><li> En una campana de cultivo de células, cortar el tercio más caudal de la rebanada de cerebro y eliminar los restos de pegamento utilizando pinzas rectas finas o un bisturí microdisección. </li><li> Delicadamente aspirar el sector mediante una pipeta Pasteur de plástico (corte la punta de la pipeta para crear una abertura más grande, esto evitará dañar la rebanada) y colocarlo en el centro de un Millicell precalentado inserción. </li><li> Asegúrese de que el lado con la señal fluorescente brillante se coloca en contacto con el Millicell insertar (para formación de imágenes con un microscopio invertido). </li><li> Eliminar el exceso de solución de disección en la parte superior de la pieza de inserción con una pipeta. </li><li> Deja cultivos de corte aestablecerse en un C / 5% de CO 2 incubadora a 37 ° por lo menos durante 1 hora antes de exponer. </li></ol> 3. Time-lapse de imágenes de Neuroblast Migración <ol><li> Por lo menos 2 horas antes de la imagen, encienda el sistema Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocal spinning, invertida microscopio Nikon Ti-E, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) enfriado cámara CCD digital, y el sistema de calefacción (Solent Scientific) fijado en la constante temperatura de 37 ° C. </li><li> Abra el módulo de adquisición de software Volocity y haga clic en el botón &quot;Viz&quot; y seleccione el láser (s) para la obtención de imágenes. </li><li> Dentro de 2 horas de preparación de cortes de cerebro, coloque el plato de fondo de vidrio que contiene el corte de cerebro en la cámara de imágenes en la platina del microscopio. </li><li> Utilice un objetivo Nikon CFI Súper Plan de Fluor ELWD 20X/0.45 bajo la luz fluorescente adecuado seleccionar y centrar el área de la rebanada que será fotografiada (por ejemplo, la primera parte descendente del RMS justo después de la zona de la inyección o la elbow región del RMS, o justo después del codo antes de neuroblastos entran en el OB). </li><li> Configure el time-lapse con las siguientes acciones: <ol><li> En el microscopio, haga clic en el botón L100 para permitir el escaneado láser de la muestra. </li><li> En Volocity, abra el láser cambiador ULTRAVIEW seleccionando el láser adecuado (por ejemplo, 488 nm láser para GFP). </li><li> Ajuste el tiempo de exposición (por lo general entre 100-500 mseg) y la intensidad del láser (generalmente 20-30%) en función de la intensidad de la señal fluorescente. </li><li> Ajuste la ganancia digital de imagen para mejorar la visualización de la célula. </li><li> Seleccione el intervalo z-stack de imagen dentro de la sección de cerebro (por lo general más de un intervalo de 100 a 120 m). Elija un intervalo con un número adecuado de células aisladas para evitar posibles solapamientos tanto como sea posible (esto facilitará el análisis de seguimiento posterior). </li><li> Seleccionar el espacio entre cada imagen Z-pila (normalmente 2-4 m). </li><li> Elija el momento intErval entre cada captura z-stack (por ejemplo, 3 min) y la duración total de imágenes (por ejemplo, 3 h). </li><li> Haga clic en el icono &quot;Guardar&quot; para guardar los cambios en los parámetros de la imagen. </li><li> Pulse el botón de grabación para comenzar a imágenes. </li></ol></li><li> Imágenes Alterno de muestras de control y experimentales (para / tratamiento farmacológico ejemplo vehículo o diferentes plásmidos por electroporación) en todo el mismo día. </li></ol> 4. Analizando las Migraciones Neuroblast <ol><li> En el módulo Volocity cuantificación, abra la biblioteca deseada creado después de completar un experimento de time-lapse. Seleccione &quot;Enfoque ampliado&quot; en el cuadro de la parte superior izquierda (Figura 4 A, paso 1). </li><li> Haga clic en la pestaña &quot;Medidas&quot; para mostrar la ventana de medición (Figura 4, paso 2). </li><li> Una lista de tareas es visible en la parte inferior izquierda de la pantalla. Drag &quot;Track&quot; (presente en la sección &quot;Miscelánea&quot; la partida en la parte inferior dela lista) en el espacio de arriba. Esto hará que la apertura de una nueva ventana llamada &quot;Track&quot; en la parte superior izquierda de la pantalla (Figura 4 A, paso 3). </li><li> Seleccione &quot;Puntos&quot; de la pestaña &quot;Input&quot; en la ventana Track (Figura 4A, paso 4). </li><li> Haga clic en la herramienta Punto (Figura 4A, el paso 5). </li><li> Iniciar el seguimiento de la migración de los neuroblastos haciendo clic con el ratón sobre la zona central del cuerpo celular y mantener el seguimiento del movimiento de la célula hasta el último punto del tiempo-lapso de tiempo que se alcance (por ejemplo, el punto número 61 para una película-hr larga 3) . </li><li> Para obtener datos eligen &quot;Make Pieza Medida&quot; en el Menú Medidas (Figura 4B, pasos 6-7). Aparecerá una ventana en el centro de la pantalla. </li><li> En esta ventana, seleccione &quot;Un nuevo elemento de medida llamada:&quot; y escriba un nombre (Figura 4C, el paso 8). Recuerde que debe seleccionar la opción &quot;Todos los puntos de tiempo&quot; antes de presser OK (Figura 4C, el paso 9). Un archivo de elemento de medición aparecerá en el archivo de lapso de tiempo y contendrá los parámetros para el análisis cuantitativo (por ejemplo, la distancia de migración, velocidad, desplazamiento y velocidad de desplazamiento). </li><li> Haga doble clic en el archivo de elemento de medición para abrir como una ventana (Figura 4D, el paso 10). </li><li> Para visualizar las pistas individuales de células analizadas, elegir la opción &quot;Punto de cadenas&quot; de las &quot;de pantalla&quot; Opciones (Figura 4D, paso 11). </li><li> Haga clic derecho sobre el archivo de artículos Medición y exportarlo como un archivo de texto, que luego pueden ser importados en programas como Excel para analizar los parámetros de migración. </li><li> Para medir los movimientos entre tramas consecutivas y pausas realizadas por cada célula durante el período de rodaje, en el archivo de artículos de Medidas Seleccione entre las opciones &quot;Display&quot; &quot;Point&quot; o &quot;poblaciones&quot; y haga clic en el identificador (cada pista tiene un ID único). Exportar el archivo resultante de procederción, como se explica en el paso 4.10. </li></ol>

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<li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061(2012).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Eficiente de la migración de células progenitoras neurales a lo largo de los RMS asegura su posterior maduración en neuronas funcionales 10. Corrientes prominentes de progenitores neurales dirigidos hacia el OB son visibles en la infancia humana y es probable que desempeñen un papel importante en el desarrollo del cerebro humano temprano postnatal 27. Por otra parte, estas células son capaces de sitios diana del cerebro afectadas por la lesión y 4,28 neurodegeneración. Ser capaz de contr...

En el cerebro de los mamíferos, la generación de nuevas neuronas (neurogénesis) se produce después del nacimiento principalmente en dos regiones, la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la zona subgranular en el giro dentado del hipocampo 1. Considerable evidencia reunida en los últimos años destaca el papel primordial para la neurogénesis postnatal en funciones de la memoria del hipocampo y el bulbo olfatorio 1-3. Es importante destacar que la neurogénesis postnatal también tiene potencial terapéutico debido a su relación con los trastornos neurológicos degenerativos, y la capacidad de los neuroblastos a migrar a sitios de heridas en el cerebro 4-6. La zona subventricular (SVZ) ha surgido recientemente como un nicho neurogénico crucial. Neuroblastos derivados de SVZ migran hacia el bulbo olfatorio (OB) a través de la corriente migratoria rostral (RMS), haciendo de este el proceso de migración más largo del 1,7,8 cerebro postnatal. El / RMS / sistema OB de mamíferos SVZ se ha convertido en unmodelo útil para estudiar los diferentes pasos en la neurogénesis, como la proliferación, migración y diferenciación de 1,8. Muchos factores de crecimiento y señales extracelulares regulan la neurogénesis ZVS y la migración a lo largo de la RMS, pero los mecanismos moleculares intracelulares están lejos de ser plenamente entendidos 1,9. Migración correcta a lo largo de la RMS es crucial para la posterior maduración de las neuronas recién nacidas 10. Además, algunos estudios han demostrado que los neuroblastos derivados de SVZ pueden migrar fuera de los RMS a los sitios de lesión cerebral 4-6,11-13. Por lo tanto, la investigación de la migración de los neuroblastos mecanismos de señalización de regulación es fundamental no sólo para entender la neurogénesis, sino también para aplicaciones terapéuticas potenciales. Aquí se describe un protocolo detallado para etiquetar progenitores neurales SVZ por electroporación in vivo después del parto y vigilar su migración a lo largo de los RMS en cultivos de cortes cerebrales agudos utilizando time-lapse confocal de disco giratorio microscópicapy. La electroporación es ampliamente utilizado en los estudios de desarrollo de embriones a los estadios adultos de 14-18. Es una poderosa herramienta para orientar y manipular progenitores neurales SVZ y representa una alternativa más barata y mucho más rápida que la inyección estereotáxica de vectores virales o generación de modelos transgénicos 1,15,19,20. Se trata de un procedimiento relativamente simple que no necesita cirugía y tiene altas tasas de supervivencia. Electroporación de shRNA o plásmidos que expresan recombinasa CRE en los modelos genéticos de ratones que emplean el sistema LoxP se puede utilizar para apuntar a genes de interés o para conseguir el etiquetado permanente de progenitores ZVS, lo que representa una herramienta útil para estudios de la neurogénesis adulta 21,22. Imaging RMS neuroblast migración en el cerebro intacto sigue siendo un reto debido a las limitaciones técnicas actuales. Sin embargo, este proceso se puede controlar utilizando el disco confocal hilado time-lapse microscopía de rodajas de cerebro de agudos, que proporcionan una adecuada sistem muy parecidas a las condiciones in vivo también susceptibles a la manipulación farmacológica 23,24. Acoplamiento de electroporación postnatal vivo con time-lapse facilitará la comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la motilidad neuroblastos y contribuir al desarrollo de nuevos enfoques para promover la reparación del cerebro.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore</td><td></td><td>Millicell PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Plato de cultivo con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gey's Balanced media</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa, 45%</td><td>Sigma</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Sigma</td><td></td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo/ Estreptococo</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (sin rojo de fenol)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio para inyección</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>Tubo aspirador</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 Tirador capilar Sutter</td><td>Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Electroporador de onda cuadrada</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Platino Tpinezertrodes 7 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Interruptor de pedal modelo 1250F</td><td>Aparato Harvard</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Gel para electrodos</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de discos giratorios UltraViEW VoX</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Configuración personalizada (se pueden utilizar múltiples fuentes láser) equipado con cámara CCD Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B</td></tr><tr><td>Software Volocity</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Módulos de Adquisición, Cuantificación, Visualización</td></tr><tr><td>Cámara ambiental para microscopía</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Ti-E</td> hecho a medida <td>Nikon</td><td></td><td>Se recomienda el objetivo CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA para la aplicación descrita en este documento</td></tr></tbody></table>

in vivo postnatal electroporación y time-lapse de neuroblast migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

La zona subventricular (SVZ) es uno de los principales nichos neurogénicos en el cerebro postnatal. Aquí, progenitores neurales proliferan y dan lugar a neuroblastos capaces de moverse a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) hacia el bulbo olfatorio (OB). Se requiere esta migración de larga distancia para la posterior maduración de las neuronas recién nacidas en el OB, pero los mecanismos moleculares que regulan este proceso aún no están claros. La investigación de las vías de señalización que controlan la motilidad neuroblastos no sólo puede ayudar a entender un paso fundamental en la neurogénesis, pero también tienen el potencial de regeneración terapéutica, dada la capacidad de estos neuroblastos en los sitios diana del cerebro afectadas por una lesión, accidente cerebrovascular, o degeneración. En este manuscrito se describe un protocolo detallado para la electroporación in vivo postnatal y la posterior time-lapse de la migración de los neuroblastos en el RMS ratón. Electroporación postnatal puede transfectar eficazmente SVZ progenitorcélulas, que a su vez generan neuroblastos migran a lo largo de la RMS. El uso de disco giratorio confocal time-lapse microscopía en cultivos de cortes cerebrales agudos, la migración de los neuroblastos se puede controlar en un ambiente muy parecido al estado in vivo. Por otra parte, la movilidad de los neuroblastos pueden ser rastreados y analizados cuantitativamente. A modo de ejemplo, se describe cómo utilizar la electroporación in vivo después del parto de un plásmido GFP-expresando etiquetar y visualizar los neuroblastos migran a lo largo de la RMS. La electroporación de plásmidos que expresan recombinasa CRE shRNA o en ratones knock-out condicionales que emplean el sistema LoxP también se puede utilizar para apuntar a los genes de interés. La manipulación farmacológica de cultivos de cortes cerebrales agudos se puede realizar para investigar el papel de las diferentes moléculas de señalización en la migración de los neuroblastos. Mediante el acoplamiento de la electroporación in vivo con time-lapse, esperamos comprender los mecanismos moleculares que controlan la motilidad de los neuroblastos y contribuir al desarrollo deción de nuevos enfoques para promover la reparación del cerebro.

Etiquetado de neuroblastos migratorias derivadas de SVZ se puede observar a lo largo de los RMS, generalmente 4-8 días después de una electroporación con éxito (Figura 1B). Puntos de tiempo más largos también pueden ser elegidos, pero menos de células se encuentran en el RMS ya que la mayoría de ellos se han entrado en el OB. Los neuroblastos comienzan a adquirir una morfología típica y las características de las células granulares maduras en el OB de alrededor de 2-3 semanas después de la electroporaci...

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y analizar la migración de Neuroblast a lo largo de la corriente migratoria rostral en el cerebro de ratón postnatal. Esto se logra electroporando, un plásmido de ADN ENC que recubre la proteína fluorescente verde en el ventrículo lateral de los estallidos de ratón. El segundo paso es preparar trozos de cerebro de los ratones electroporados.A continuación, se seleccionan los cortes con la mejor señal GFP para el cultivo. El paso final es la obtención de imágenes en time-lapse de los trozos de cerebro que contienen el neuroblasto migratorio marcado con GFP utilizando un microscopio confocal de disco giratorio. En última instancia, las películas de lapso de tiempo se utilizan para el seguimiento celular y el análisis cuantitativo de la migración de neuroblastos.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis, como la forma en que se guía y regula el movimiento del neuroblasto derivado de células madre en el cerebro postnatal. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la administración de vectores virales, es que es más fácil, más barata y requiere menos tiempo. Además, permite un marcaje disperso de los neuroblastos, lo que permite un análisis detallado de su dinámica de migración.Comience este procedimiento ajustando el voltaje del electroporado a cinco pulsos cuadrados, 50 milisegundos por pulso a 100 voltios con intervalos de 850 milisegundos. A continuación, cargue una aguja capilar con uno o dos microlitros de ADN utilizando un tubo aspirador conectado al capilar. A continuación, retire de la jaula a un cachorro de ratón posnatal del segundo día y anestesiarlo mediante la inhalación de flúor.Después de eso, sostenga la cabeza del cachorro entre el pulgar y el dedo índice de su mano menos dominante. Tire ligeramente de la piel de la cabeza hacia atrás para ayudar a identificar el punto de inyección correcto. Considere una línea virtual entre el ojo y el punto de referencia craneométrico Lambda.A continuación, inserte la aguja capilar a aproximadamente un tercio de la longitud de esta línea desde la Lambda hasta unos dos milímetros de profundidad y luego inyecte el plásmido soplando lentamente por la boca. Durante este procedimiento, asegúrese de que sus dedos no ejerzan demasiada presión sobre el cerebro. Detenga la inyección cuando quede una cantidad mínima de solución de ADN en el capilar.A continuación, cubra ambos electrodos con gel y colóquelos con el lado positivo en el lado lateral del hemisferio donde se inyectó el ADN. Para la incorporación del ADN en el Rostral SVZ, coloque los electrodos ligeramente rostral hasta el punto de inyección. A continuación, inicie la transferencia de corriente presionando el pedal del interruptor de pie de pulso.Luego, limpie el gel de la cabeza del cachorro, reanime al cachorro con oxígeno en una almohadilla térmica durante unos minutos. Posteriormente, devuélvelo a la jaula y colócalo lejos de la madre. Asegúrate de que la madre recupere al cachorro y lo reúna con el resto de la camada.En este procedimiento, coloque los insertos de milicélulas en una placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 milímetros que contenga un mililitro de medio de película. Luego coloque la placa de cultivo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono. Después de decapitar al cachorro de ratón, retire el cuero cabelludo con un bisturí.A continuación, corte el cráneo a lo largo de la sutura sagital media desde el cerebelo hasta el bulbo olfatorio. Haga algunos cortes transversales adicionales en el cráneo y retire suavemente los colgajos craneales con pinzas. Asegúrese de que todo el cerebro esté expuesto y diseccione cuidadosamente con una espátula, teniendo especial cuidado de no dañar el tejido.Después de eso, los hemis diseccionan el cerebro con una cuchilla de afeitar y desechan el hemisferio no inyectado. Posteriormente se colocó un pequeño trozo de cinta adhesiva en el soporte de vibram. Use la cantidad mínima de pegamento necesario para unir el hemisferio cerebral en él.Comience a cortar el hemisferio cerebral en rodajas de 300 micras. A continuación, recoge las rodajas con un pincel pequeño o un asa de inoculación suave. Posteriormente, revise ambos lados de las rodajas bajo un microscopio fluorescente estándar para detectar la señal de GFP y elija las que muestren fluorescencia brillante a lo largo de la mayor parte de la corriente migratoria rostral.En una capucha de autocultivo, corte el tercio más mimado de la rebanada de cerebro y elimine cualquier rastro de pegamento. A continuación, aspire la rebanada con una pipeta de plástico y colóquela en el centro de un inserto de milipilas precalentado. Retire el exceso de solución de disección en la parte superior del inserto con una pipeta gilson.A continuación, deje que los cultivos en rodajas se asienten en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante al menos una hora. Antes de la obtención de imágenes dentro de las dos horas posteriores a la preparación del corte de cerebro. Coloque el plato con fondo de vidrio que contiene el corte de cerebro en la cámara de imágenes en la platina del microscopio.A continuación, utilice un objetivo de 20 x 0,45 bajo la luz fluorescente adecuada para seleccionar y enfocar el área del corte que se va a fotografiar. Para configurar las imágenes de lapso de tiempo en el microscopio, haga clic en el botón L 100 para permitir el escaneo láser de la muestra. A continuación, en velocidad, abra el cambiador de láser ultra view seleccionando el láser adecuado.Ajuste la ganancia del tiempo de exposición y la intensidad del láser. A continuación, seleccione el intervalo de Zack para obtener una imagen del interior del cerebro. A continuación, seleccione el espaciado entre cada imagen de pila ZS.Elija el intervalo de tiempo entre cada captura de pila ZS y la duración total de la imagen. A continuación, haga clic en el icono Guardar para guardar los cambios en los parámetros de imagen. Al final, presione el botón de grabación para iniciar la generación de imágenes en el módulo de cuantificación de velocidad.Abra la biblioteca deseada creada. Después de completar un experimento de lapso de tiempo, seleccione enfoque extendido en el cuadro superior izquierdo. Haga clic en la pestaña de medidas para mostrar la ventana de medición.Una lista de tareas es visible en la parte inferior izquierda de la pantalla. Arrastre la pista en el espacio de arriba. Esto provocará la apertura de una nueva ventana llamada track.En la parte superior izquierda de la pantalla, seleccione los puntos de la pestaña de entrada en la ventana de la pista. Haga clic en la herramienta de punto, haga clic en la pestaña de herramientas y seleccione la opción de seguimiento manual de objetos, aparecerá una ventana para permitir que el operador comience a rastrear las celdas. Comience a rastrear el neuroblasto migratorio haciendo clic con el mouse en el área central del cuerpo celular y continúe rastreando el movimiento de la célula hasta que se alcance el último punto de tiempo del lapso de tiempo.Para obtener datos, seleccione Convertir elemento de medición. Desde el menú de medidas, aparecerá una ventana en el centro de la pantalla. En esta ventana, seleccione un nuevo elemento de medición llamado y escriba un nombre para un elemento de medición.El archivo que contiene los parámetros para el análisis cuantitativo aparecerá debajo del archivo de lapso de tiempo. Haga doble clic en este archivo de elemento de medición para abrirlo como una ventana para visualizar las pistas individuales de las celdas analizadas. Elija el punto rastreado de las opciones de visualización y seleccione las celdas que deben visualizarse para su ruta migratoria.Para analizar los parámetros de migración, haga clic con el botón derecho en el archivo del elemento de medición y expórtelo como un archivo de texto, que luego se puede importar en programas como Excel. Estas son las imágenes de lapso de tiempo del disco giratorio de neuroblasto tomadas de un corte de cerebro sagital de ratón. Cinco días después de la electroporación de A GFP que expresa imágenes de plásmidos con una hora de diferencia.Cada panel es una proyección Zack de 28 imágenes consecutivas separadas por cuatro micras. Las puntas de flecha indican cuatro neuroblastos representativos que migran a lo largo del RMS hacia el bulbo olfatorio. Estas son las rutas migratorias representativas obtenidas a partir de las imágenes de lapso de tiempo de cuatro neuroblastos.Este gráfico muestra la distancia migrada con el tiempo de dos neuroblastos representativos. Estas células muestran un comportamiento móvil saltatorio típico. Esta película muestra una sección del RMS del mouse con GFP etiquetado como migración.Neuroblasto obtenido cinco días después de la electroporación del plásmido que expresa GFP A. El bulbo olfativo se encuentra fuera de la vista hacia la esquina inferior derecha. Las pilas Z confocales se capturaron en un disco giratorio confocal.Con un objetivo de 20x cada tres minutos durante tres horas en un intervalo de 120 micras, la velocidad de reproducción es de 10 fotogramas por segundo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar practicar la electroporación antes de comenzar los experimentos y también preparar cuidadosamente los cultivos agudos de cortes de cerebro en el menor tiempo posible. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar y analizar la migración de neuroblastos en el cerebro de ratón postnatal.

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

Fuente: Wiegreffe, C., et. al.,  Imágenes confocales de lapso de tiempo de neuronas migratorias en cultivo de corte organotípico de cerebro de ratón embrionario usando En el útero Electroporación. J. Vis. Exp. {{TAG_ 44}} (2017) Este video muestra la microscopía confocal de lapso de tiempo para observar la migración radial de las neuronas corticales desde la zona subventricular a la placa cortical a través de andamios gliales radiales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos.

Imágenes de lapso de tiempo de la migración radial de neuronas corticales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos

La migración de los neuroblastos es un paso crucial en la neurogénesis postnatal. El protocolo se describe aquí se puede utilizar para investigar el papel de los reguladores candidatos de la migración de los neuroblastos mediante el empleo de ADN / ARN de horquilla pequeña (shRNA) nucleofection y un ensayo de migración de neuroblastos 3D con aislados de la corriente migratoria rostral posnatal roedor.

Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast<em&gt; In vitro</em

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

Este protocolo demuestra un método sencillo y robusto para estudiar el crecimiento del axón in situ y la dinámica del cono de crecimiento. Describe cómo preparar cortes cerebrales agudos fisiológicamente relevantes ex vivo y proporciona una tubería de análisis fácil de usar.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Este protocolo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el cerebro postnatal y de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

Aprende a visualizar la migración de neuroblastos en cerebro postnatal de ratón mediante electroporación in vivo y time-lapse. Este método permite analizar dinámicas celulares en neurogénesis.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

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