In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y analizar la migración de Neuroblast a lo largo de la corriente migratoria rostral en el cerebro de ratón postnatal. Esto se logra electroporando, un plásmido de ADN ENC que recubre la proteína fluorescente verde en el ventrículo lateral de los estallidos de ratón. El segundo paso es preparar trozos de cerebro de los ratones electroporados.

A continuación, se seleccionan los cortes con la mejor señal GFP para el cultivo. El paso final es la obtención de imágenes en time-lapse de los trozos de cerebro que contienen el neuroblasto migratorio marcado con GFP utilizando un microscopio confocal de disco giratorio. En última instancia, las películas de lapso de tiempo se utilizan para el seguimiento celular y el análisis cuantitativo de la migración de neuroblastos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis, como la forma en que se guía y regula el movimiento del neuroblasto derivado de células madre en el cerebro postnatal. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la administración de vectores virales, es que es más fácil, más barata y requiere menos tiempo. Además, permite un marcaje disperso de los neuroblastos, lo que permite un análisis detallado de su dinámica de migración.

Comience este procedimiento ajustando el voltaje del electroporado a cinco pulsos cuadrados, 50 milisegundos por pulso a 100 voltios con intervalos de 850 milisegundos. A continuación, cargue una aguja capilar con uno o dos microlitros de ADN utilizando un tubo aspirador conectado al capilar. A continuación, retire de la jaula a un cachorro de ratón posnatal del segundo día y anestesiarlo mediante la inhalación de flúor.

Después de eso, sostenga la cabeza del cachorro entre el pulgar y el dedo índice de su mano menos dominante. Tire ligeramente de la piel de la cabeza hacia atrás para ayudar a identificar el punto de inyección correcto. Considere una línea virtual entre el ojo y el punto de referencia craneométrico Lambda.

A continuación, inserte la aguja capilar a aproximadamente un tercio de la longitud de esta línea desde la Lambda hasta unos dos milímetros de profundidad y luego inyecte el plásmido soplando lentamente por la boca. Durante este procedimiento, asegúrese de que sus dedos no ejerzan demasiada presión sobre el cerebro. Detenga la inyección cuando quede una cantidad mínima de solución de ADN en el capilar.

A continuación, cubra ambos electrodos con gel y colóquelos con el lado positivo en el lado lateral del hemisferio donde se inyectó el ADN. Para la incorporación del ADN en el Rostral SVZ, coloque los electrodos ligeramente rostral hasta el punto de inyección. A continuación, inicie la transferencia de corriente presionando el pedal del interruptor de pie de pulso.

Luego, limpie el gel de la cabeza del cachorro, reanime al cachorro con oxígeno en una almohadilla térmica durante unos minutos. Posteriormente, devuélvelo a la jaula y colócalo lejos de la madre. Asegúrate de que la madre recupere al cachorro y lo reúna con el resto de la camada.

En este procedimiento, coloque los insertos de milicélulas en una placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 milímetros que contenga un mililitro de medio de película. Luego coloque la placa de cultivo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono. Después de decapitar al cachorro de ratón, retire el cuero cabelludo con un bisturí.

A continuación, corte el cráneo a lo largo de la sutura sagital media desde el cerebelo hasta el bulbo olfatorio. Haga algunos cortes transversales adicionales en el cráneo y retire suavemente los colgajos craneales con pinzas. Asegúrese de que todo el cerebro esté expuesto y diseccione cuidadosamente con una espátula, teniendo especial cuidado de no dañar el tejido.

Después de eso, los hemis diseccionan el cerebro con una cuchilla de afeitar y desechan el hemisferio no inyectado. Posteriormente se colocó un pequeño trozo de cinta adhesiva en el soporte de vibram. Use la cantidad mínima de pegamento necesario para unir el hemisferio cerebral en él.

Comience a cortar el hemisferio cerebral en rodajas de 300 micras. A continuación, recoge las rodajas con un pincel pequeño o un asa de inoculación suave. Posteriormente, revise ambos lados de las rodajas bajo un microscopio fluorescente estándar para detectar la señal de GFP y elija las que muestren fluorescencia brillante a lo largo de la mayor parte de la corriente migratoria rostral.

En una capucha de autocultivo, corte el tercio más mimado de la rebanada de cerebro y elimine cualquier rastro de pegamento. A continuación, aspire la rebanada con una pipeta de plástico y colóquela en el centro de un inserto de milipilas precalentado. Retire el exceso de solución de disección en la parte superior del inserto con una pipeta gilson.

A continuación, deje que los cultivos en rodajas se asienten en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante al menos una hora. Antes de la obtención de imágenes dentro de las dos horas posteriores a la preparación del corte de cerebro. Coloque el plato con fondo de vidrio que contiene el corte de cerebro en la cámara de imágenes en la platina del microscopio.

A continuación, utilice un objetivo de 20 x 0,45 bajo la luz fluorescente adecuada para seleccionar y enfocar el área del corte que se va a fotografiar. Para configurar las imágenes de lapso de tiempo en el microscopio, haga clic en el botón L 100 para permitir el escaneo láser de la muestra. A continuación, en velocidad, abra el cambiador de láser ultra view seleccionando el láser adecuado.

Ajuste la ganancia del tiempo de exposición y la intensidad del láser. A continuación, seleccione el intervalo de Zack para obtener una imagen del interior del cerebro. A continuación, seleccione el espaciado entre cada imagen de pila ZS.

Elija el intervalo de tiempo entre cada captura de pila ZS y la duración total de la imagen. A continuación, haga clic en el icono Guardar para guardar los cambios en los parámetros de imagen. Al final, presione el botón de grabación para iniciar la generación de imágenes en el módulo de cuantificación de velocidad.

Abra la biblioteca deseada creada. Después de completar un experimento de lapso de tiempo, seleccione enfoque extendido en el cuadro superior izquierdo. Haga clic en la pestaña de medidas para mostrar la ventana de medición.

Una lista de tareas es visible en la parte inferior izquierda de la pantalla. Arrastre la pista en el espacio de arriba. Esto provocará la apertura de una nueva ventana llamada track.

En la parte superior izquierda de la pantalla, seleccione los puntos de la pestaña de entrada en la ventana de la pista. Haga clic en la herramienta de punto, haga clic en la pestaña de herramientas y seleccione la opción de seguimiento manual de objetos, aparecerá una ventana para permitir que el operador comience a rastrear las celdas. Comience a rastrear el neuroblasto migratorio haciendo clic con el mouse en el área central del cuerpo celular y continúe rastreando el movimiento de la célula hasta que se alcance el último punto de tiempo del lapso de tiempo.

Para obtener datos, seleccione Convertir elemento de medición. Desde el menú de medidas, aparecerá una ventana en el centro de la pantalla. En esta ventana, seleccione un nuevo elemento de medición llamado y escriba un nombre para un elemento de medición.

El archivo que contiene los parámetros para el análisis cuantitativo aparecerá debajo del archivo de lapso de tiempo. Haga doble clic en este archivo de elemento de medición para abrirlo como una ventana para visualizar las pistas individuales de las celdas analizadas. Elija el punto rastreado de las opciones de visualización y seleccione las celdas que deben visualizarse para su ruta migratoria.

Para analizar los parámetros de migración, haga clic con el botón derecho en el archivo del elemento de medición y expórtelo como un archivo de texto, que luego se puede importar en programas como Excel. Estas son las imágenes de lapso de tiempo del disco giratorio de neuroblasto tomadas de un corte de cerebro sagital de ratón. Cinco días después de la electroporación de A GFP que expresa imágenes de plásmidos con una hora de diferencia.

Cada panel es una proyección Zack de 28 imágenes consecutivas separadas por cuatro micras. Las puntas de flecha indican cuatro neuroblastos representativos que migran a lo largo del RMS hacia el bulbo olfatorio. Estas son las rutas migratorias representativas obtenidas a partir de las imágenes de lapso de tiempo de cuatro neuroblastos.

Este gráfico muestra la distancia migrada con el tiempo de dos neuroblastos representativos. Estas células muestran un comportamiento móvil saltatorio típico. Esta película muestra una sección del RMS del mouse con GFP etiquetado como migración.

Neuroblasto obtenido cinco días después de la electroporación del plásmido que expresa GFP A. El bulbo olfativo se encuentra fuera de la vista hacia la esquina inferior derecha. Las pilas Z confocales se capturaron en un disco giratorio confocal.

Con un objetivo de 20x cada tres minutos durante tres horas en un intervalo de 120 micras, la velocidad de reproducción es de 10 fotogramas por segundo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar practicar la electroporación antes de comenzar los experimentos y también preparar cuidadosamente los cultivos agudos de cortes de cerebro en el menor tiempo posible. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar y analizar la migración de neuroblastos en el cerebro de ratón postnatal.