Fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos

El objetivo general de este procedimiento es aplicar técnicas optogenéticas modernas para fotoestimular vías neuronales específicas en preparaciones de corte in vitro. Esto se logra expresando primero el canal de varilla Dossin en las líneas celulares neuronales de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar preparaciones agudas de las estructuras cerebrales relevantes que se van a estudiar.

El siguiente paso es registrar las respuestas de las neuronas en la preparación del corte en respuesta a la fotoestimulación del canal, la barra de Dossin que expresa fibras. El paso final es obtener imágenes de la distribución de las neuronas y fibras que expresan opsina del canal. En última instancia, este enfoque permite evaluar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de los circuitos neuronales mediante la fotoestimulación de escaneo láser de componentes neuronales optogenéticamente dirigidos.

Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos tradicionales de estimulación eléctrica son la capacidad de dirigirse y estimular específicamente tipos particulares de células neuronales y examinar sus proyecciones de largo alcance in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia de sistemas, como la organización funcional de complejos enchufes de guerra. Prepare una jeringa y una aguja para inyectar la solución viral, que contiene cuatro microgramos por mililitro de polietileno para mejorar la transfección.

A continuación, inyecte a presión 200 nanolitros de la solución utilizando la bomba de jeringa, dos o tres semanas después, habrá una expresión adecuada de la rodaja de Dossin de la varilla del canal. La preparación debe realizarse lo más rápido posible Después de extraer el cerebro inyectado, haga un bloqueo del cerebro en la orientación deseada con una cuchilla de afeitar limpia. A continuación, fije la superficie bloqueada del cerebro a la etapa de corte con pegamento adhesivo instantáneo.

A continuación, transfiera la etapa a una cámara de corte de vibram refrigerada por el congelador y vierta un líquido cefalorraquídeo A frío en la cámara de corte. Corta las secciones del cerebro con un viome en secciones de cuatro a 500 micras de grosor. Transfiera las rodajas de cerebro a una cámara de retención oxigenada y déjelas incubar a 30 grados centígrados durante al menos una hora antes de continuar con el experimento.

Cuando esté listo para comenzar el experimento, transfiera el corte de cerebro a la etapa de la plataforma de registro electrofisiológico. Registre una neurona utilizando técnicas estándar de pinza de parche de célula completa. Coloque brevemente la pipeta de registro junto a la neurona mientras aplica presión positiva a la pipeta.

Después de que se haga contacto con la celda, libere la presión y aplique succión para formar el sello giga. A continuación, aplique una succión breve para romper la membrana para la configuración de toda la célula y tome grabaciones en modos de pinza de voltaje o corriente. Opere el escáner láser con software de adquisición de datos de ondas de marea o EFA.

El software debe calibrarse para el fotodiodo antes de su uso para controlar la potencia del láser. En su trayectoria se coloca una rueda de densidad neutra variable. Al girar la rueda, se ajusta la potencia del láser midiendo en el plano focal posterior.

La potencia suele establecerse entre 25 y D milivatios. El parámetro de pulso del obturador controla la duración y el tiempo de la estimulación en el software. Se puede crear una imagen de la región a estimular a partir de la función de captura de vídeo.

A continuación, establezca la rejilla de estimulación, como una rejilla de 16 por 16 con un espaciado de 80 micras. A continuación, superponga la rejilla sobre la imagen adquirida y ajuste las coordenadas XY y el grado de desplazamiento para optimizar la orientación y comenzar la estimulación. Activa la función de mapa.

Los datos se conservan y se pueden analizar utilizando el programa de análisis fuera de línea en maremoto, o se pueden analizar utilizando el programa de análisis de mapas en el software de EFAs. Después de completar los registros fisiológicos en el corte, se puede documentar el patrón de expresión de la opsina del canal marcado con YFP. Primero, fije el corte durante la noche en 4% de PFA en PBS 0.01 molar a cuatro grados Celsius.

Al día siguiente, transfiera la rebanada a una solución de 30 % de sacarosa y 4 % de PFA para una protección criogénica durante la noche. Al día siguiente, corte secciones de 50 micras de la rebanada en un criostato. Enjuague las rodajas en PBS y móntelas para obtener imágenes con un medio antidecoloración en el microscopio confocal.

Después de encontrar la región de interés en la luz blanca, use una longitud de onda excitatoria de 514 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 527 nanómetros. Para obtener una imagen de la construcción viral de YFPA que impulsa la expresión del canal Dobson, EYFP. En neuronas glutamatérgicas excitadoras se inyectó en la corteza visual primaria de un ratón BSY.

La expresión viral se encontró en las pistas entre las cortezas visuales primarias y secundarias, y en las fibras cortico-talámicas de la célula entera LGN de una neurona en la corteza visual secundaria marcada por la estrella reveló e PSCs. Después de la fotoestimulación de barrido láser del canal, el bastón de Dossin expresa fibras en las capas inferiores de V dos proyecciones cortico-talámicas de la capa seis de la corteza somatosensorial primaria. El núcleo ventral posterior se estudió utilizando un enfoque CRE LAX para expresar la dosina de bastones de canal en las neuronas corticotalámicas de la capa seis, y en sus proyecciones, según lo esperado, la transfección por una construcción flocada a a V en un ratón transgénico CRE dio como resultado la expresión de dosina de bastones de canal en las neuronas de la capa seis objetivo y sus fibras se extendieron a la capa cuatro.

La expresión de EYFP también se observó en las fibras que se proyectan a las grabaciones fisiológicas de VP de una neurona VP. El uso de una pinza de parche de célula completa reveló que las PSC e podrían provocarse después de la fotoestimulación cerca de la neurona registrada, que está marcada por la estrella. El análisis fuera de línea muestra la amplitud de la respuesta media a la fotoestimulación en VP Reseccionado en cortes de 50 micras de la capa seis de neuronas corticotalámicas que expresan el canal Rodin EYFP reveló un patrón fino de fibras marcadas que atraviesan desde la capa seis hasta la capa cuatro, donde terminaban y se arborizaban extensamente.

Además, se observó que las fibras cortico-talámicas entraban en la sustancia blanca y viajaban hacia el tálamo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar técnicas optogenéticas modernas para fotoestimular vías neuronales específicas en preparaciones de cortes in vitro. No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso cuando realiza los pasos de calibración asociados con este procedimiento.

Use gafas protectoras.