Fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos

El objetivo general de este procedimiento es aplicar técnicas optogenéticas modernas para fotoestimular vías neuronales específicas en preparaciones de cortes en vitro. Esto se logra primero expresando el canal rodopsina Dossin en las líneas celulares neuronales de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar preparaciones agudas de cortes de las estructuras cerebrales relevantes que se van a estudiar.

El siguiente paso consiste en registrar las respuestas de las neuronas en el preparado de corte frente a la estimulación fotónica de las fibras que expresan el canal rodopsina Dossin. El paso final es obtener imágenes de la distribución de neuronas y fibras que expresan la opsina del canal. En última instancia, este enfoque permite evaluar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de los circuitos neuronales mediante la estimulación fotónica con escaneo láser de componentes neuronales dirigidos de forma optogenética.

Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos tradicionales de estimulación eléctrica son la capacidad de dirigirse específicamente y estimular tipos celulares neuronales particulares, y examinar sus proyecciones de largo alcance in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia de sistemas, como la organización funcional de complejos enchufes de guerra. Prepare una jeringa y una aguja para inyectar la solución viral, que contiene cuatro microgramos por mililitro de poli para mejorar la transfección.

A continuación, inyecte por presión 200 nanolitros de la solución utilizando la bomba de jeringa; dos o tres semanas después, habrá una expresión adecuada del canal rod Dossin en el corte. La preparación debe realizarse lo más rápidamente posible. Después de extraer el cerebro inyectado, realice un bloque del cerebro en la orientación deseada usando una hoja de afeitar limpia. A continuación, fije la superficie bloqueada del cerebro al soporte de corte utilizando pegamento adhesivo instantáneo.

Luego, transfiera la platina a una cámara de corte vibrante refrigerada y vierta A CSF frío con hielo en la cámara de corte. Corte las secciones cerebrales utilizando un viome en secciones de cuatro a 500 micrones de grosor. Transfiera las secciones cerebrales a una cámara de almacenamiento oxigenada y permita que incuben a 30 grados Celsius durante al menos una hora antes de continuar con el experimento.

Cuando esté listo para comenzar el experimento, transfiera la sección de cerebro a la platina del equipo de registro electrofisiológico. Registre una neurona utilizando técnicas estándar de parche en célula completa. Posicione brevemente la pipeta de registro junto a la neurona mientras aplica presión positiva a la pipeta.

Después de establecer el contacto con la célula, libere la presión y aplique succión para formar el sello gigohmio. Luego, aplique succión breve para romper la membrana y obtener la configuración de célula completa, y realice las grabaciones en modo de voltaje o de corriente constante. Opere el escáner láser con el software de adquisición de datos tidal wave o EFAs.

El software debe calibrarse con el fotodiodo antes de su uso para controlar la potencia del láser. Se coloca una rueda variable de densidad neutra en su trayectoria. Girar la rueda ajusta la potencia del láser mediante mediciones en el plano focal posterior.

La potencia se establece normalmente entre 25 y D milivatios. El parámetro de pulso del obturador controla la duración y el momento de la estimulación en el software. Se puede obtener una imagen de la región que se va a estimular mediante la función de video instantáneo.

A continuación, configure la cuadrícula de estimulación, por ejemplo, una cuadrícula de 16 por 16 con un espaciado de 80 micrones. Luego superponga la cuadrícula sobre la imagen adquirida y ajuste las coordenadas XY y el grado de desplazamiento para optimizar la orientación antes de iniciar la estimulación. Active la función de mapa.

Los datos se conservan y pueden analizarse utilizando el programa de análisis fuera de línea en tidal wave, o pueden analizarse utilizando el programa de análisis de mapas en el software EFAs. Después de completar las grabaciones fisiológicas en el corte, se puede documentar el patrón de expresión del opsin del canal marcado con YFP. Primero, fije el corte durante la noche en PFA al 4 % en PBS 0,01 molar a cuatro grados Celsius.

Al día siguiente, transfiera la sección a una solución de sacarosa al 30% y PFA al 4% para la crioprotección nocturna. Al día siguiente, corte secciones de 50 micrones de la muestra en un criostato. Enjuague las secciones en PBS y móntelas para su observación con un medio antidesvanecimiento en el microscopio confocal.

Después de localizar la región de interés en luz blanca, utilice una longitud de onda excitadora de 514 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 527 nanómetros. Para imaginar el constructo viral YFPA que induce la expresión del canal rod Dobson, EYFP. En neuronas glutamatérgicas excitadoras se inyectó en la corteza visual primaria de un ratón BSY.

Se encontró expresión viral en trayectos entre las cortezas visual primaria y secundaria, y en las fibras corticotalámicas del LGN. El registro de pinza de célula íntegra desde una neurona en la corteza visual secundaria marcada por la estrella reveló PSCe. Tras la estimulación fotónica por barrido láser del canal, las fibras que expresan canal rodopsina Dossin en las capas inferiores de V2, proyecciones corticotalámicas desde la capa seis de la corteza somatosensorial primaria hacia el núcleo ventral posterior, fueron estudiadas mediante un enfoque CRE LAX para expresar canal rodopsina Dossin en neuronas corticotalámicas de la capa seis y en sus proyecciones. Como se esperaba, la transfección mediante un constructo fLEx aAV en un ratón transgénico CRE dio como resultado la expresión de canal rodopsina Dossin en las neuronas diana de la capa seis y en sus fibras que se extienden hacia la capa cuatro.

En el canal rod Dobson, también se observó expresión de EYFP en fibras que proyectan hacia el VP, a partir de grabaciones fisiológicas de una neurona del VP. Mediante el empleo de registro con parche en todo el célula, se reveló que los PSCs podían ser evocados tras la fotoestimulación cerca de la neurona registrada, la cual está marcada con la estrella. El análisis posterior muestra la amplitud media de la respuesta a la fotoestimulación en el VP. En cortes reseccionados de 50 micrones de neuronas corticotalámicas de la capa seis que expresan channel Rodin EYFP, se reveló un patrón fino de fibras marcadas que atraviesan desde la capa seis hasta la capa cuatro, donde terminan y se arborizan extensamente.

Además, se observaron fibras corticotalámicas que entraban en la sustancia blanca y se extendían hacia el tálamo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar técnicas optogenéticas modernas para fotoestimular vías neuronales específicas en preparaciones de cortes in vitro. No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso durante los pasos de calibración asociados con este procedimiento.

Use gafas de protección.