Name: Fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a caracterizar circuitos del prosencéfalo mediante fotoestimulación láser de barrido y optogenética en preparaciones de rodajas cerebrales in vitro. Este método permite evaluar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de circuitos neuronales específicos.

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Este trabajo fue financiado por la subvención R03 DC 011361 de los NIH/NIDCD, la subvención LAV3202 de SVM CORP, la subvención EPSCoR de NSF-LA PFUND86 y una subvención de publicación de Leica Microsystems (CCL) y la subvención R01 DC 008794 (SMS) de los NIH/NIDCD.

1. Cirugía e inyecciones
<ol>
	<li>Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal (se recomienda una aguja de 22-25 g) de ketamina (100-120 mg/kg) y xilacina (7,5-16 mg/kg).
	<ol>
		<li>Evalúe la sedación con pinzamientos fuertes en los dedos de los pies hasta que no se obtengan respuestas. Para todos los procedimientos con animales descritos, modifíquelos para seguir las pautas locales de IACUC según sea necesario.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque los ratones sedados en un dispositivo estereotáxico asegurando la cabeza y las orejas en sus respectivos soportes.
	<ol>
		<li>Lubrique los ojos antes de colocar al animal en el dispositivo estereotáxico con una pomada oftálmica estéril.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Afeita el cuero cabelludo con una navaja de afeitar y esteriliza la zona con hisopos Betadine.</li>
	<li>Con un bisturí, haga una incisión en la línea media y refleje la piel y los músculos subyacentes por encima del área que se va a inyectar.</li>
	<li>Gire la hoja de un bisturí como una trépano para realizar una craneotomía por encima de la región que se va a exponer. También puedes utilizar una pequeña broca acoplada a una Dremel para realizar la craneotomía.
	<ol>
		<li>Para realizar la craneotomía, coloque la hoja de bisturí o la broca en la superficie del cráneo y gírela lentamente hasta que se haya excavado suficiente hueso para revelar la piamadre que se encuentra debajo.</li>
		<li>Una vez realizada la excavación inicial, agranda la craneotomía con pinzas finas para extraer cuidadosamente el hueso de los bordes.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Llene una jeringa de 1 μl con la solución viral que se va a inyectar (UNC Vector Core).
	<ol>
		<li>Para mejorar la eficacia de la transfección, prepare una solución viral con 4 μg/ml de polibreno.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Baje la aguja en el área que se va a inyectar e infunda a presión 200 nl de solución que contenga virus con una bomba de jeringa.
	<ol>
		<li>Deje reposar la jeringa durante 10 minutos antes de retirar la aguja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sutura la piel con nylon monofilamento no absorbible y cubre la incisión con ungüento antibiótico.
	<ol>
		<li>Las suturas deben retirarse después de 7-10 días.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inyectar buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) para la analgesia postoperatoria.</li>
	<li>Permitir que los animales se recuperen postoperatoriamente durante 14-21 días para permitir una expresión adecuada del canal rodopsina.</li>
</ol>
2. Preparación de rebanadas
<ol>
	<li>Después del período de recuperación, anestesiar profundamente al animal con anestesia con isoflurano, como se verifica por la ausencia de reflejo de retirada cuando la pata trasera y/o los dedos del pie trasero están firmemente apretados.</li>
	<li>Diseccionar el cerebro por decapitación seguida de cortes frontales y de línea media en el cráneo.</li>
	<li>Separa el cráneo de la línea media para exponer el cerebro.</li>
	<li>Extraiga con cuidado el cerebro con una espátula fina para separar los nervios craneales de la base del cerebro.</li>
	<li>Coloque rápidamente el cerebro disecado en un vaso pequeño de 100 ml que contenga líquido cefalorraquídeo artificial frío y frío (ACSF; en mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 glucosa).</li>
	<li>Extraiga el cerebro del ACSF y colóquelo en un portaobjetos de microscopio cubierto con papel de filtro prehumedecido con ACSF.</li>
	<li>Haz un corte de bloqueo del cerebro en la orientación deseada con una cuchilla de afeitar limpia.</li>
	<li>Fije la superficie bloqueada del cerebro a la etapa de corte con pegamento adhesivo instantáneo.</li>
	<li>Transfiera la etapa a una cámara de corte de vibratomo (se mantiene en el congelador hasta que esté lista para cortar).</li>
	<li>Vierta ACSF frío en la cámara de corte.</li>
	<li>Corta secciones de cerebro a 400-500 μm con un cortador de tejido vibratorio.</li>
	<li>Transfiera los trozos de cerebro a una cámara de retención que contenga ACSF oxigenado e incube a 30 °C durante al menos 1 hora antes del experimento.</li>
</ol>
3. Registro fisiológico
<ol>
	<li>Después del período de incubación, transfiera una rebanada a una cámara de registro en una platina de microscopio modificada.</li>
	<li>Asegure la rebanada en el baño durante el experimento usando algunos hilos de filamentos de nailon unidos a un soporte de rebanada de alambre de platino.</li>
	<li>Perfunda la rebanada con ACSF constantemente.</li>
	<li>Tire de las pipetas de registro hasta una resistencia de la punta de 3-6 MΩ cuando se llenen con una solución intracelular que contenga lo siguiente (en mM): 127 K-gluconato, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. La solución intracelular debe tener un pH de 7,3, ajustado con KOH o ácido glucónico y una osmolalidad de 280-290 mOsm.</li>
	<li>Utilizando una configuración de grabación de célula completa visualizada estándar, coloque la pipeta de grabación cerca de la neurona que se va a registrar mientras aplica presión positiva22,23.</li>
	<li>Libere la presión positiva mientras aplica la succión para formar un sello de Gigaohm.</li>
	<li>Aplique una succión breve para romper la membrana y formar un registro de la configuración de la célula completa.</li>
	<li>Registre las respuestas de las neuronas en voltaje o pinza amperimétrica.</li>
</ol>
4. Fotoestimulación con escaneo láser
<ol>
	<li>Iniciar el software y hardware de adquisición de datos, descrito en los informes anteriores23-29. 
	Nota: Hemos utilizado los programas de adquisición Tidelwave25 y, más recientemente, Ephus26, escritos en Matlab y desarrollados por el laboratorio de Karel Svboda en Janelia Farms30. Para una descripción completa de la fotoestimulación con escaneo láser en Ephus, consulte Suter et al.26 y la guía paso a paso30. 
	Nota: La configuración descrita en este artículo se deriva de la descrita por Shepherd (2012)23. El rayo láser es guiado a través de un sistema de espejos de haz abierto hasta el puerto superior del microscopio a través de la lente del objetivo en el corte (Figura 2).</li>
	<li>Desvíe una pequeña porción del láser a un fotodiodo con un cubreobjetos de microscopio colocado en la trayectoria del láser y use la salida de corriente de este fotodiodo para monitorear la intensidad del láser durante los experimentos.
	<ol>
		<li>Calibre la salida de corriente del fotodiodo registrada en el software a la potencia láser medida en el plano focal posterior del objetivo utilizando un medidor de potencia durante la configuración del equipo23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Controle la potencia del láser girando una rueda de densidad neutra variable. La potencia del láser utilizada varió entre 25 y 70 mW (en el plano focal posterior) en nuestros experimentos.</li>
	<li>Establezca la duración y el tiempo de la estimulación láser modificando los parámetros de pulso para el láser y el obturador. La estimulación láser suele durar 2 mseg.</li>
	<li>Capture la imagen de la región a estimular mediante la función 'Grab Video'.</li>
	<li>Seleccione la rejilla de estimulación de acuerdo con las dimensiones deseadas. Por lo general, utilizamos una matriz de estimulación de 16 x 16 con un espaciado de 80 μm entre filas y columnas adyacentes.</li>
	<li>Superponga la cuadrícula de mapeo con la imagen adquirida y ajuste el desplazamiento x, y y de grado a la ubicación y orientación deseadas.</li>
	<li>Active la función 'Mapa' para iniciar la estimulación y la adquisición de datos.</li>
	<li>Después de la adquisición de las respuestas evocadas por la fotoestimulación, lleve a cabo el análisis de los datos mapeados utilizando el programa de análisis de mapas fuera de línea en Tidelwave25 o el programa 'MapAnalysis' en Ephus26.</li>
</ol>
5. Imágenes de corte fijo
<ol>
	<li>Después de los registros, transfiera el corte de cerebro al 4% de paraformaldehído (PFA) en 0,01 M PBS (pH7,4) durante la noche a 4 ºC.</li>
	<li>Transfiera la rodaja en sacarosa al 30% en PFA al 4%/0,01 M PBS durante la noche a 4 ºC.</li>
	<li>Corte secciones de 50 μm con un criostato y recoja en PBS de 0,01 M.</li>
	<li>Enjuague las secciones en 0.01 M PBS dos veces a temperatura ambiente.</li>
	<li>Monte las secciones y el cubreobjetos en un medio antidecoloración adecuado.</li>
	<li>Transfiera las secciones al microscopio confocal.</li>
	<li>Concéntrese en el retorno de la inversión utilizando luz blanca.</li>
	<li>Elija la longitud de onda, el tamaño de la imagen y la repetición para la adquisición de imágenes. Para YFP, usamos 514 nm (Ex)/527 nm (Em).</li>
</ol>

<ol><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
El autor (CCL) recibió una beca de publicación de Leica Microsystems, que produce un instrumento utilizado en esta filmación de este protocolo.

El protocolo descrito detalla un enfoque para la evaluación in vitro de la topografía funcional y la fisiología de los circuitos neuronales, que no se limita a la investigación de los circuitos del prosencéfalo, es decir , los del tálamo y la corteza. Se han puesto a disposición de la comunidad científica varias construcciones virales para la transfección optogenética y se pueden obtener fácilmente del UNC Vector Core. Para obtener una descripción de las construcciones virales fácilmente disponibles, consulte el UNC Vector Core31, la página de recursos de optogenética en el Laboratorio Deisseroth de la Universidad de Stanford32 y el laboratorio de neurobiología sintética Boyden en MIT33. Estos laboratorios han desarrollado variantes de estas opsinas y permiten una amplia gama de modos para controlar la excitabilidad neuronal1,2. La obtención de estos vectores del núcleo de vectores de UNC requiere un Acuerdo de transferencia de material de los laboratorios de origen. En este protocolo, observamos que la adición de polibeno mejora la eficacia de la transfección. Además, otra variable que influye en la expresión es el período de recuperación posquirúrgica, en el que observamos que un período de al menos 14 días es suficiente para obtener una expresión robusta en las vías del prosencéfalo de los ratones.
Para la transfección dirigida de grupos neuronales específicos, se han desarrollado varias líneas de ratones transgénicos Cre, que se pueden utilizar en combinación con construcciones virales de marco de lectura abierto inverso 'floxed' que se han desarrollado11. Varias cepas pertinentes a la investigación en neurociencia están disponibles a través de los Centros Regionales de Recursos de Ratones Mutantes34. Los atlas de los patrones de expresión de Cre-recombinasa en estas líneas transgénicas se ofrecen a través de la base de datos GENSAT35. Además, Jackson Labs ofrece varias cepas Cre-transgénicas, así como otras que expresan constitutivamente opsinas en grupos neuronales específicos. Un paso crítico para utilizar estas líneas de ratones es tener en cuenta el tiempo necesario para obtener y establecer una colonia de reproducción, que puede variar según la cepa particular de interés.
Para la fotoestimulación, hemos utilizado y adaptado la configuración desarrollada por el Shepherd Lab de la Universidad Northwestern, descrita en un protocolo reciente29. Aunque está optimizado para el desbloqueo de glutamato, esta configuración también es susceptible de fotoestimulación de canalrodopsina sin modificaciones. Esta configuración permite un control espacial preciso y el posicionamiento de los loci de fotoestimulación, lo que permite una evaluación de la topografía funcional de la inervación de canalrodopsina de las neuronas registradas. Aunque el control espacial se mejora con este método de fotoestimulación, es más costoso que los métodos que utilizan iluminación de campo basada en LED20. Además, la falta de uniformidad del tejido cerebral es una limitación de la optogenética o de cualquier técnica que implique la manipulación de la luz. Sin embargo, en la práctica, rara vez es un factor, ya que los resultados se interpretan principalmente de manera cualitativa. En caso de que se necesite una comparación más cuantitativa entre las regiones del cerebro, siempre se puede usar la máxima intensidad de luz para lograr respuestas "saturadas".
Además, hemos utilizado los programas de software Tidelwave y Ephus escritos en Matlab para controlar la fotoestimulación de escaneo láser y la adquisición de datos25,26. Sin embargo, se recomienda que aquellos que configuren un sistema similar empleen el software Ephus26 más nuevo, que tiene soporte disponible a través del sitio de desarrollo de Janelia Farms30. Un paso clave es elegir cuál de estos paquetes de software utilizar, ya que sus requisitos de hardware difieren ligeramente. Además, los programas de análisis de mapas se adaptan a sus respectivos programas de adquisición de datos.
Varios de estos pasos se pueden modificar para adaptarse a la configuración particular del profesional. Las inyecciones de soluciones virales se pueden realizar con mecanismos de administración además de una jeringa, por ejemplo , las pipetas de vidrio capilares extraídas a diámetros de punta de ~40 μm también funcionan bien. Para las cirugías, se puede sustituir por un soporte de cabeza no estereotáxico si tales coordenadas no son necesarias para guiar las inyecciones. Además, las composiciones de ACSF y soluciones intracelulares pueden modificarse en función de los requisitos experimentales particulares, por ejemplo , sustituyendo una solución intracelular de cesio o cloruro para aislar las corrientes inhibitorias. Además, una alternativa a la obtención de imágenes de patrones de expresión en cortes fijos también se puede realizar en el corte vivo en un equipo de imágenes adecuado con un sistema de perfusión por baño.
En resumen, este protocolo permitirá al médico caracterizar la topografía funcional y la fisiología sináptica de las proyecciones in vitro, lo que puede no ser posible utilizando métodos estándar, p. ej. caracterización de proyecciones de largo alcance que no se pueden conservar en un corte. El protocolo de transfección descrito se puede aplicar a experimentos optogenéticos in vivo 1-3,12,14, ya que el mecanismo de administración es el mismo. Finalmente, aunque este protocolo describe la transfección de ratones, muchos de los vectores virales disponibles se pueden usar para transfectar y expresar teóricamente estas opsinas en una amplia gama de especies de mamíferos, lo que permite una gran cantidad de estudios comparativos y específicos de especies1-3.

Los elaborados circuitos del prosencéfalo de los mamíferos plantean un desafío experimental para diseccionar los roles funcionales de sus componentes entrelazados. El desarrollo de métodos optogenéticos para excitar e inhibir específicamente las poblaciones neuronales y sus proyecciones1-3 ha ayudado a desenredar estas relaciones. Estos enfoques hacen uso de la expresión genéticamente controlada de canales de membrana que responden a la luz4-6. Cabe destacar que la canalrodopsina, un canal iónico activado por luz, despolariza las membranas neuronales después de la estimulación óptica, lo que conduce a la excitación de la neurona expresora y sus proyecciones4,7. Por el contrario, la halorrodopina, una bomba de cloruro depuerta la luz, hiperpolariza la membrana, inhibiendo así la proyección dirigida6,8,9. Se han diseñado varias variantes de estas opsinas, se han producido múltiples vectores para su transfección y expresión en poblaciones neuronales de interés, y se han diseñado líneas de ratones transgénicos que expresan constitutivamente estas opsinas o que permiten el control de su expresión mediado por cre-lox1,2,10,11.
La utilidad de estos métodos y materiales optogenéticos ha revolucionado la neurociencia experimental moderna, permitiendo la disección del papel de circuitos neuronales específicos en la fisiología y el comportamiento del organismo12-15. En particular, estos métodos pueden aplicarse poderosamente a la disección funcional de los circuitos cerebrales utilizando preparaciones de corte in vitro 16-20. En este contexto, una de las principales ventajas de este método es la capacidad de caracterizar la fisiología de proyecciones de largo alcance que son difíciles, si no imposibles, de preservar en un corte grueso, como las conexiones comisurales entre los hemisferios corticales cerebrales16. Además, esta tecnología permite manipulaciones que no son posibles con otros métodos, como la inhibición selectiva de proyecciones con precisión temporal fina utilizando halorrodopsina6,8,9. Además, la expresión específica del tipo celular de estas opsinas permite estimular o inhibir selectivamente componentes aislados en un circuito neuronal1,2,11,15,21. Como tal, estas novedosas herramientas optogenéticas permiten el análisis sin precedentes de las contribuciones neuronales a la fisiología y el comportamiento.
Aquí, describimos un protocolo para expresar canalrodopsina en el cerebro de ratón utilizando vectores virales adenoasociados (AAV)1,2. La transfección específica de las poblaciones neuronales objetivo se puede lograr utilizando este protocolo, con la elección adecuada de construcciones promotoras o ratones transgénicos que expresen Cre-recombinasa en las neuronas objetivo de interés y una construcción viral 'floxada'1,11,15,21 (Figura 1). Como ejemplos aquí, examinamos las proyecciones corticocorticales entre la corteza visual primaria (V1) y la corteza visual secundaria (V2) y también investigamos la proyección corticotalámica de la capa 6 desde la corteza sensorial somadora primaria (S1) hasta el núcleo medial ventroposterior (VPm). Combinamos esta expresión específica con la fotoestimulación de escaneo láser in vitro para evaluar la fisiología sináptica y la topografía funcional. La configuración presentada aquí permite el posicionamiento espacial preciso y el control de los loci de la fotoestimulación. Por último, describimos la visualización de patrones de expresión mediante microscopía confocal.

<table><tbody><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 32%</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>AAV construcciones virales</td><td>UNC Vector Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cabezal estereotáctico</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Inyector Nanocool</td><td>Harvard Aparato</td><td>703040</td><td></td></tr><tr><td>Láser UV: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;</td><td>DPSS Lasers, Inc</td><td>3500</td><td></td></tr><tr><td>Galvonomómetros</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6210</td><td></td></tr><tr><td>espejos</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6m2003S-A</td><td></td></tr><tr><td>montura</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6102103L</td><td></td></tr><tr><td>cable</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6010-19-120</td><td></td></tr><tr><td>controlador/controlador</td><td>Cambridge Scanning</td><td>67121-1</td><td></td></tr><tr><td>Obturador - Recubrimiento ZM (compatible con UV)</td><td>Uniblitz</td><td>L23-ZM2</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de obturador</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de corriente</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>6713 placa</td><td>National Instruments</td><td>777741-01</td><td></td></tr><tr><td>2110 caja de conexiones</td><td>National Instruments</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>PCI-MIO-16E-4</td><td>National Instruments</td><td>777383-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090</td><td>National Instruments</td><td>777270-01</td><td></td></tr><tr><td>Cables</td><td>National Instruments</td><td>184749-01</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

El prosencéfalo sensorial está compuesto por tipos de células intrincadamente conectadas, cuyas propiedades funcionales aún no se han dilucidado completamente. La comprensión de las interacciones de estos circuitos del prosencéfalo se ha visto favorecida recientemente por el desarrollo de métodos optogenéticos para la modulación de la actividad neuronal mediada por la luz. Aquí, describimos un protocolo para examinar la organización funcional de los circuitos del prosencéfalo in vitro utilizando la fotoestimulación de barrido láser de la canalrodopsina, expresada optogenéticamente a través de la transfección mediada por virus. Este enfoque también explota la utilidad de la recombinación de cre-lox en ratones transgénicos para dirigir la expresión en tipos específicos de células neuronales. Después de la transfección, las neuronas se registran fisiológicamente en preparaciones de corte utilizando una pinza de parche de célula completa para medir sus respuestas evocadas a la fotoestimulación de escaneo láser de las fibras que expresan canalrodopsina. Este enfoque permite evaluar la topografía funcional y las propiedades sinápticas. Los correlatos morfológicos se pueden obtener mediante imágenes de la expresión neuroanatómica de las fibras que expresan canalrodopsina utilizando microscopía confocal del corte vivo o del tejido postfijado. Estos métodos permiten investigaciones funcionales de los circuitos del prosencéfalo que amplían los enfoques más convencionales.

La fotostimulación con escaneo láser de las proyecciones entre el área visual primaria (V1) y el área visual secundaria (V2) en el ratón se realizó tras inyecciones de pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP en V1 de un ratón Balb/C (Figura 3). El promotor CaMKIIa en este constructo viral induce la expresión específica de canalrodopsina-EYFP en neuronas glutamatérgicas excitadoras1,15. Tras la preparación de cortes para el registro fisiológico, se observó la expresión de fibras de canalrodopsina-EYFP, es decir, la epifluorescencia del EYFP conjugado, atravesando desde V1 hasta V2 (Figura 3A). Además, también se observaron las fibras corticotalámicas en el núcleo geniculado lateral (LGN) (Figura 3A). Registros de bloqueo con micropipeta en modo de célula íntegra realizados en una neurona de V2 revelaron corrientes postsinápticas excitadoras (EPSC) inducidas tras la fotostimulación con escaneo láser de las fibras que expresaban canalrodopsina-EYFP en las capas inferiores de V2 (Figura 3B).
En otro ejemplo, se logró la fotoestimulación con escaneo láser de las proyecciones corticotalámicas de la capa 6 de la corteza somatosensorial primaria (S1) hacia el núcleo ventroposterior (VP) utilizando este protocolo. Aquí, empleamos un enfoque Cre-Lox para dirigir específicamente la expresión de la canalrodopsina en las neuronas de la capa 6 y en las proyecciones corticotalámicas de interés. Específicamente, inyectamos pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA en la S1 de ratones B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (Figuras 1 y 4). Esta cepa transgénica de ratón expresa la recombinasa Cre específicamente en las neuronas corticotalámicas de la capa 621, lo que resulta en la expresión de ChR-YFP únicamente en esas neuronas tras la transfección con el constructo AAV «floxed». Tras la preparación de los cortes, se observaron fibras de canalrodopsina-EYFP en las neuronas de la capa 6 y en las fibras que proyectan hacia la capa 4 y el VP (Figuras 4A y 4B). El registro fisiológico en una neurona del VPm mediante parche total reveló que se podían inducir corrientes postsinápticas excitadoras (EPSC) tras la fotoestimulación con escaneo láser cerca de la neurona registrada (Figuras 4C y 4D).
La morfología de las fibras marcadas se evaluó más fácilmente tras los registros fisiológicos. Aquí, volvimos a seccionar (50 μm) preparaciones en rodajas con expresión de canalrodopsina-EYFP en neuronas corticotalámicas de la capa 6 (Figura 5). Esto reveló un patrón fino de fibras marcadas que atravesaban desde la capa 6 hasta la capa 4, donde terminaban y se arborizaban extensamente (Figura 5A). Además, se observaron fibras corticotalámicas entrando en la sustancia blanca y dirigiéndose hacia el tálamo (Figuras 5A y 5B).
<img alt="Diagrama de edición genética mediante Cre-loxP para la expresión dirigida de ChR-YFP en un modelo de ratón." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Ilustración esquemática de la expresión dirigida de canalrodopsina mediante un enfoque Cre-Lox. Se inyecta un virus «flanqueado» que codifica una canalrodopsina fusionada a una proteína fluorescente, como la YFP, en ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre en las poblaciones neuronales de interés. Tras la transfección, únicamente las neuronas que expresan la recombinasa Cre producirán canalrodopsina-EYFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen en mayor tamaño</a>.
<img alt="Diagrama de microscopía láser con óptica láser, espejo dicróico, cámara CCD y configuración de escaneo." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Ilustración esquemática de la configuración de fotestimulación. (A) Diagrama de la configuración de fotestimulación con escaneo láser. El haz láser se dirige sucesivamente a través de un sistema de haz abierto hacia un obturador y un filtro de densidad neutra (N.D.). Una cubreobjetos refleja parte del haz hacia un fotodiodo conectado a un amplificador para mediciones de potencia láser. Se utilizan galvanómetros con espejo para posicionar el haz láser a través de una lente de escaneo, que dirige el haz a través de un puerto lateral en la parte superior del microscopio. Luego, el haz se refleja hacia abajo a través del objetivo hacia la preparación del corte mediante un espejo dicróico. Para más detalles, véanse Lam y Sherman23 y Shepherd29. (B) Ejemplo del patrón de cuadrícula de fotestimulación para el experimento representativo mostrado en la Figura 3. La cuadrícula de estimulación de 16 × 16 se superpone a una fotomicrografía de la preparación del corte. Una estrella roja indica la ubicación de una neurona registrada mediante parche en modo célula completa. La posición del haz láser se guía a cada una de las 256 posiciones de la cuadrícula de estimulación mediante el posicionamiento computarizado de los galvanómetros con espejo. En la figura se muestran las posiciones láser de los primeros 5 sitios de estimulación. Las respuestas de la neurona registrada a la fotestimulación en cada uno de los sitios se muestran en la Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen ampliada</a>.
<img alt="Diagrama de mapa de neuroimagen; análisis del núcleo geniculado lateral, corteza visual V1, V2; estudio de conexiones neuronales." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Fotostimulación con escaneo láser de proyecciones corticocorticales desde la corteza visual primaria (V1) hasta la corteza visual secundaria (V2) en el ratón. (A) Imagen epifluorescente de la preparación del corte que muestra las fibras de canalrodopsina-EYFP desde V1 hasta V2 y en el núcleo geniculado lateral (LGN). La expresión específica de canalrodopsina-EYFP en neuronas glutamatérgicas excitadoras está controlada por un constructo viral que contiene el promotor CaMKIIa. (B) Corrientes postsinápticas excitadoras (EPSC) inducidas en una neurona de V2 tras la fotostimulación con escaneo láser. La estrella roja indica el sitio de registro. Barras de escala: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen ampliada</a>.
<img alt="Diagrama de capas corticales con análisis de la región VP; mapas de actividad microeléctrica; datos de electrofisiología." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Fotostimulación con escaneo láser de las proyecciones corticotalámicas desde la corteza somatosensorial primaria (S1) hasta el núcleo ventroposterior (VP) en el ratón. (A) Imagen epifluorescente de la preparación de corte que muestra las fibras de canalrodopsina-EYFP en S1. (B) Imagen epifluorescente de las fibras marcadas en VP. (C) Corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) inducidas en una neurona de VP tras la fotostimulación con escaneo láser. (D) Gráfico de las EPSCs medias. La estrella roja indica el sitio de registro. Los trazos enmarcados en (C) corresponden con los valores enmarcados en (D). Barras de escala: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen ampliada</a>.
<img alt="Microscopía de fluorescencia que muestra estructuras neuronales, marcadas con marcadores verdes; diagrama comparativo." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Imagen de neuronas de la capa 6 que expresan canalrodopsina-EYFP en la corteza somatosensorial primaria (S1) del ratón. (A-B) Neuronas marcadas en la capa 6 y fibras que proyectan hacia la capa 4 y la sustancia blanca. Barras de escala: (A) 250 µm, (B) 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen ampliada</a>.

Describimos un método para caracterizar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de los circuitos del prosencéfalo utilizando un enfoque optogenético para fotoestimular poblaciones neuronales in vitro.

Fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

El objetivo general de este procedimiento es aplicar técnicas optogenéticas modernas para fotoestimular vías neuronales específicas en preparaciones de cortes en vitro. Esto se logra primero expresando el canal rodopsina Dossin en las líneas celulares neuronales de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar preparaciones agudas de cortes de las estructuras cerebrales relevantes que se van a estudiar.El siguiente paso consiste en registrar las respuestas de las neuronas en el preparado de corte frente a la estimulación fotónica de las fibras que expresan el canal rodopsina Dossin. El paso final es obtener imágenes de la distribución de neuronas y fibras que expresan la opsina del canal. En última instancia, este enfoque permite evaluar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de los circuitos neuronales mediante la estimulación fotónica con escaneo láser de componentes neuronales dirigidos de forma optogenética.Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos tradicionales de estimulación eléctrica son la capacidad de dirigirse específicamente y estimular tipos celulares neuronales particulares, y examinar sus proyecciones de largo alcance in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia de sistemas, como la organización funcional de complejos enchufes de guerra. Prepare una jeringa y una aguja para inyectar la solución viral, que contiene cuatro microgramos por mililitro de poli para mejorar la transfección.A continuación, inyecte por presión 200 nanolitros de la solución utilizando la bomba de jeringa; dos o tres semanas después, habrá una expresión adecuada del canal rod Dossin en el corte. La preparación debe realizarse lo más rápidamente posible. Después de extraer el cerebro inyectado, realice un bloque del cerebro en la orientación deseada usando una hoja de afeitar limpia. A continuación, fije la superficie bloqueada del cerebro al soporte de corte utilizando pegamento adhesivo instantáneo.Luego, transfiera la platina a una cámara de corte vibrante refrigerada y vierta A CSF frío con hielo en la cámara de corte. Corte las secciones cerebrales utilizando un viome en secciones de cuatro a 500 micrones de grosor. Transfiera las secciones cerebrales a una cámara de almacenamiento oxigenada y permita que incuben a 30 grados Celsius durante al menos una hora antes de continuar con el experimento.Cuando esté listo para comenzar el experimento, transfiera la sección de cerebro a la platina del equipo de registro electrofisiológico. Registre una neurona utilizando técnicas estándar de parche en célula completa. Posicione brevemente la pipeta de registro junto a la neurona mientras aplica presión positiva a la pipeta.Después de establecer el contacto con la célula, libere la presión y aplique succión para formar el sello gigohmio. Luego, aplique succión breve para romper la membrana y obtener la configuración de célula completa, y realice las grabaciones en modo de voltaje o de corriente constante. Opere el escáner láser con el software de adquisición de datos tidal wave o EFAs.El software debe calibrarse con el fotodiodo antes de su uso para controlar la potencia del láser. Se coloca una rueda variable de densidad neutra en su trayectoria. Girar la rueda ajusta la potencia del láser mediante mediciones en el plano focal posterior.La potencia se establece normalmente entre 25 y D milivatios. El parámetro de pulso del obturador controla la duración y el momento de la estimulación en el software. Se puede obtener una imagen de la región que se va a estimular mediante la función de video instantáneo.A continuación, configure la cuadrícula de estimulación, por ejemplo, una cuadrícula de 16 por 16 con un espaciado de 80 micrones. Luego superponga la cuadrícula sobre la imagen adquirida y ajuste las coordenadas XY y el grado de desplazamiento para optimizar la orientación antes de iniciar la estimulación. Active la función de mapa.Los datos se conservan y pueden analizarse utilizando el programa de análisis fuera de línea en tidal wave, o pueden analizarse utilizando el programa de análisis de mapas en el software EFAs. Después de completar las grabaciones fisiológicas en el corte, se puede documentar el patrón de expresión del opsin del canal marcado con YFP. Primero, fije el corte durante la noche en PFA al 4 % en PBS 0,01 molar a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, transfiera la sección a una solución de sacarosa al 30% y PFA al 4% para la crioprotección nocturna. Al día siguiente, corte secciones de 50 micrones de la muestra en un criostato. Enjuague las secciones en PBS y móntelas para su observación con un medio antidesvanecimiento en el microscopio confocal.Después de localizar la región de interés en luz blanca, utilice una longitud de onda excitadora de 514 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 527 nanómetros. Para imaginar el constructo viral YFPA que induce la expresión del canal rod Dobson, EYFP. En neuronas glutamatérgicas excitadoras se inyectó en la corteza visual primaria de un ratón BSY.Se encontró expresión viral en trayectos entre las cortezas visual primaria y secundaria, y en las fibras corticotalámicas del LGN. El registro de pinza de célula íntegra desde una neurona en la corteza visual secundaria marcada por la estrella reveló PSCe. Tras la estimulación fotónica por barrido láser del canal, las fibras que expresan canal rodopsina Dossin en las capas inferiores de V2, proyecciones corticotalámicas desde la capa seis de la corteza somatosensorial primaria hacia el núcleo ventral posterior, fueron estudiadas mediante un enfoque CRE LAX para expresar canal rodopsina Dossin en neuronas corticotalámicas de la capa seis y en sus proyecciones. Como se esperaba, la transfección mediante un constructo fLEx aAV en un ratón transgénico CRE dio como resultado la expresión de canal rodopsina Dossin en las neuronas diana de la capa seis y en sus fibras que se extienden hacia la capa cuatro.En el canal rod Dobson, también se observó expresión de EYFP en fibras que proyectan hacia el VP, a partir de grabaciones fisiológicas de una neurona del VP. Mediante el empleo de registro con parche en todo el célula, se reveló que los PSCs podían ser evocados tras la fotoestimulación cerca de la neurona registrada, la cual está marcada con la estrella. El análisis posterior muestra la amplitud media de la respuesta a la fotoestimulación en el VP. En cortes reseccionados de 50 micrones de neuronas corticotalámicas de la capa seis que expresan channel Rodin EYFP, se reveló un patrón fino de fibras marcadas que atraviesan desde la capa seis hasta la capa cuatro, donde terminan y se arborizan extensamente.Además, se observaron fibras corticotalámicas que entraban en la sustancia blanca y se extendían hacia el tálamo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar técnicas optogenéticas modernas para fotoestimular vías neuronales específicas en preparaciones de cortes in vitro. No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso durante los pasos de calibración asociados con este procedimiento.Use gafas de protección.

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