Name: Single-plantas, Microcosmos estériles para nodulación y el crecimiento de la planta de la legumbre Medicago truncatula Con el Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 1 s
Description: Aprende a cultivar Medicago truncatula en microcosmos estériles individuales con Sinorhizobium meliloti para estudiar la simbiosis leguminosa-rizobia. Este método permite cuantificar fenotipos simbióticos sin riesgo de contaminación cruzada.

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Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de USDA para la Agricultura y la Alimentación, la Agricultura y la Iniciativa de Investigación de Alimentos de subvención 2010-65.108 - 20.582 a KMJ Agradecemos Brian K. Washburn para la revisión crítica del manuscrito.

Realizar los pasos se recomienda 1, 2, 4, y 6 en una campana de flujo laminar estéril. 1. Preparación de M. truncatula A17 plántulas Nota: M. truncatula A17 semillas utilizadas en estos estudios se producen bajo condiciones de invernadero se enfría a ~ 22 ° C, o en una sala de crecimiento de la planta se mantiene a 22-26 ° C con ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 luz. <ol><li> Vierta placas de germinación de semillas: Utilice 100 mm placas cuadradas (15 mm de profundidad) y se vierte en autoclave 1.1 a 1.2% w / v purificado agar 10 a una profundidad de 3-5 mm. Cada placa se utiliza para germinar ~ 0.25-0.5 g de semillas (equivalente a 63-125 semillas / placa). Nota: Es importante utilizar células de cultivo probados, agar purificado planta para todos los platos descritos en este protocolo. El proveedor y la información del número de catálogo para el agar se listan en la Tabla de Reactivos y equipos específicos. </li><li> Escarifique / esterilizar el M. truncatula A17 semillas: Pesar las semillas suficientes para el número deseado de plántulas. (M. truncatula A17 semillas son ~ 4 mg cada uno) Coloque las semillas en frascos estériles de 125 ml con cubiertas de papel de aluminio estériles (0,25-0,5 g de semillas / matraz, lo que es de ~ 63-125 semillas) y la pipeta 20 ml de concentrado (96%) H 2 SO 4 a lo largo de los lados del matraz. Nota: escarificación ácida esteriliza las semillas. También, pipeteando el ácido a lo largo de los lados del matraz, que se vuelva a esterilizar el interior del matraz de que haya entrado en contacto con las semillas no esterilizadas. </li><li> Romper los grumos de semilla con una pipeta de vidrio estéril. Agitar cada matraz con frecuencia para 10-12 min. Las pequeñas, hoyos marrones se harán visibles en las semillas. Estos son pequeños agujeros en la capa de 11 semillas. Nota: Use protección para los ojos y guantes cuando se trabaja con H 2 SO 4 concentrado. </li><li> Retire H 2 SO 4 y enjuagar las semillas: Cuando al menos el 10% de las semillas tienen pequeños hoyos marrones, o 12 minutos han pasado, el que seaes lo primero, eliminar todo el ácido de los frascos con una pipeta de vidrio estéril. (Lugar ácido residual en un vaso de precipitados de 1-2 l que contiene al menos 300 ml de agua del grifo. Esto diluir el ácido y evitar el sobrecalentamiento.) Incline el matraz para recoger el ácido que queda en la curva del matraz y el uso de una pequeña pipeta de vidrio a eliminar todo el ácido restante. Si el ácido residual permanece, es el que reacciona con el agua de enjuague, calentar las semillas y los matará. <ol><li> Enjuague semillas vertiendo rápidamente 100 ml de agua ultrapura estéril en cada matraz. El exceso de volumen de agua va a diluir el ácido y evitar daños sobrecalentamiento y la semilla durante la reacción del ácido con el agua. Verter el agua y la llama-esterilizar el labio del matraz. </li><li> Enjuague semillas 8-10x con 50 ml de agua ultrapura estéril. Agitar el matraz durante cada enjuague. El matraz se debe considerar estéril en este punto y el labio del matraz se debe flameado antes de cada enjuague. </li></ol></li><li> Deje que las semillas se empapan durante la noche: Después de laúltimo aclarado, verter 50 ml de agua ultrapura estéril en cada frasco, vuelva a colocar la cubierta de aluminio estéril en cada frasco y a 4 ° C en la oscuridad durante la noche. </li><li> Coloque las semillas en un plato de germinación: Después de dejar que las semillas se empapan durante la noche, verter el agua, lavar 2 veces con ~ 25 ml de agua ultrapura, a continuación, añadir 20 ml de agua ultrapura estéril, remolino para volver a suspender las semillas y las vierte sobre una placa de agar germinación 1.1 a 1.2% a partir de paso 1.1. Si las semillas se mantienen en el matraz, añadir más agua y se vierte de nuevo. Distribuya las semillas de cada matraz a una placa (63 a 125 semillas / placa). <ol><li> Agite la placa para distribuir las semillas. Las semillas deben ser distribuidos de manera uniforme en una banda de 4-5 cm en un extremo de la placa. Este será el &quot;top&quot; de la placa. El &quot;fondo&quot; de 5-6 cm debe mantenerse libre de las semillas (Figura 2A). </li><li> Extraiga el agua con una pipeta estéril. Inclinar la placa en un ángulo de 45 ° para que la fuga de agua restante a la parte inferior de la placa. Vuelva a colocar la tapa en el tilplaca ted y protegerlo de la luz. Las placas se debe permitir que drene 10-20 min. (Figura 2B). </li></ol></li><li> Configure la germinación: Retire toda el agua que se ha acumulado en la parte inferior de la placa inclinada con una pipeta estéril. <ol><li> Vuelva a colocar la tapa y selle la placa con parafilm. Use guantes y mantenga estéril (Figura 2 C). </li><li> Pila de las placas de germinación y luego girar a todos ellos en un ángulo de 90 °. Las semillas serán tirados en la superficie vertical del agar. Semillas totalmente embebidas deben adherirse fácilmente al agar. Las raíces crecen hacia abajo (Figura 2D). </li><li> Enrolle la pila de placas de germinación en papel de aluminio para bloquear la luz y mantener a 25 º C durante 3 días. </li></ol></li></ol> Nota: Si germinación ingresos por menos de 3 días, las raíces pueden ser demasiado corto para alcanzar el agar en microcosmos. Si la germinación procede más de 4 días antes de la transferencia a las placas de microcosmos, la supervivencia de las plántulas seser pobre. Si M. ecotipos truncatula o mutantes con tasas de germinación más lentas se han de comparar, el ecotipo lentamente-germinación se debe permitir a germinar más de 3 días. 2. Preparación de Microcosmos por placa <ol><li> Preparar medio 12 (véase la Tabla 1 para la composición), permitiendo ~ 70 ml de medio de Jensen para cada microcosmos. Preparar en jarras o frascos que sean convenientes para vertido rápido (no más de 1 a 2 litros por lanzador) y dejar una barra de agitación magnética en la jarra durante la esterilización en autoclave. <ol><li> Después de medio se ha enfriado hasta ~ 55-65 ° C, se han añadido suplementos, y el pH se ha comprobado (ver Tabla 1), se vierte en ronda de diámetro 100 mm, 15 mm platos hondos. Las placas se deben verter ~ 0,9-1 cm de profundidad (~ 70 ml / placa). </li><li> Los componentes del medio de Jensen pueden formar un precipitado turbio, por lo que es importante devolver la jarra a la placa de agitación magnética periódicamente para evitar que los componentes se sedimente. Los precipitados pueden ser vispatible en la placa después de que se solidifican, y no afectan el rendimiento siempre y cuando se distribuyen de manera uniforme entre las placas. </li><li> Pila de placas durante la colada para evitar la formación de condensación en las tapas de placas. </li></ol></li><li> Después de placas de Jensen han solidificado, muescas en ambas placas y tapas con una espátula de pesaje que se ha doblado en forma de U 5 (Figura 3A). Calentar la curvatura de la espátula con un quemador hasta rojos calientes, muesca 5-6 platos y luego calentar de nuevo. Cuando la tapa con muescas se coloca en la placa con muescas, esto creará un portal de ovalada a través del cual el rodaje de la plántula crecerá (Figura 3B). Si las placas con muescas se van a almacenar, envuelva individualmente con una película de parafina .. </li></ol> 3. Preparación de Sinorhizobium meliloti Culturas Dos días antes de la inoculación de las plantas, inicie culturas de todos los S. meliloti cepas para ser inoculados en plántulas. Cultures deben ser cultivadas en LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medio 13 suplementado con 2,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2, y los antibióticos apropiados (medio TY también funciona bien). Tan poco como 2-3 ml de cada cultivo serán suficientes. <ol><li> Crecer a 30 ° C con agitación durante 2 días hasta que las células son densos. </li><li> Para la mayoría de las inoculaciones de plantas, la fase de crecimiento de la S. meliloti no es crítica. Por lo general, a finales de registro o se utilizan células en fase estacionaria temprana. </li></ol> 4. Maquetación de M. truncatula plántulas en Microcosmos individuales <ol><li> Después de 3 días, abra una placa de germinación (preparado en el paso 1) y la inundación de inmediato con agua ultrapura estéril. Dip fórceps en etanol y brevemente la llama de esterilizar. Utilice pinzas estériles para empujar suavemente las puntas de las raíces de todas las plantas bajo el agua para evitar que se sequen. Las raíces variar de 2-6 cm de largo. La mayoría será de 3-4 cm. Seleccione plántulas con raíces rectas y no obviadefectos. </li><li> Compruebe las tapas de los microcosmos medianas del Jensen para la acumulación de condensación. Flick de la tapa para quitar la condensación o sustituirla por una nueva tapa con muesca. Si hay un exceso de condensación en la tapa, la raíz de plántulas puede adherirse a la tapa y luego se seca mueren después de la condensación. </li><li> Usando las pinzas, pick suavemente una planta de semillero de la placa de la germinación de los cotiledones y se echó la raíz en un medio microcosmos de un Jensen. Asegúrese de que la punta de la raíz está en contacto con el agar. </li><li> Retire con cuidado la cubierta de la semilla si todavía está presente. Las cubiertas de las semillas deben estar sueltos después de la inmersión en agua durante 5-10 min. Suavemente se burlan de la cubierta de la semilla con las pinzas hasta que cede el paso, y deseche. Los cotiledones y aproximadamente 0,5 cm de rodaje deben sobresalir fuera de la U-muesca en la placa (Figura 4). Vuelva a colocar cuidadosamente la tapa de la placa con el U-muesca de la tapa sobre la planta de semillero, la creación de un portal para la plántula (Figura 4B).Establecer placas de lado en pilas horizontales hasta que todas las plantas de semillero se han colocado en el microcosmos. </li><li> Utilice todas las plántulas de cada placa de germinación que mirar viables y tienen una raíz recta. (Si es posible, deje un plato de plántulas sin abrir a utilizar como sustitutos de plántulas marchitas justo antes de la inoculación.) </li><li> Después de exponer todas las plántulas, les permite sentarse en el microcosmos de la Jensen horizontal mientras que el S. Se están preparando suspensiones de inóculo meliloti. </li></ol> 5. Preparación de S. meliloti inóculo Suspensiones <ol><li> Compruebe S. meliloti culturas periódicamente después de la inoculación para asegurarse de que están creciendo. Después de un crecimiento de 2 días, el OD 600 debe estar entre 2 y 4. </li><li> Pipetear 0,5 ml de cada cultivo en un tubo estéril de 1,5 ml y centrifugar para sedimentar. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Lavar las células dos veces en cualquiera de 0,85% de agua estéril ultrapura NaCl o estéril. Resuspender las células en 0,5 ml de 0,85% Stesacar de quicio NaCl o agua ultrapura. </li><li> Medir el diámetro exterior 600 de una dilución 1/10 de resuspendieron S. meliloti culturas desde el paso 5.3. En base a esta lectura, hacer una suspensión de cada cultura en agua ultrapura estéril a OD 600 = 0,05. Si la densidad celular es demasiado alta, la nodulación puede ser inhibida. Hacer lo suficiente de la suspensión diluida de manera que 100 l pueden ser inoculadas en cada plántula. La turbidez del OD 600 = 0,05 suspensión debe ser apenas perceptible a simple vista. </li></ol> 6. Inoculación y Sellado de Microcosmos <ol><li> Inmediatamente antes de que comiencen las inoculaciones, compruebe plántulas marchitas que no han sobrevivido a la transferencia al microcosmos medianas del Jensen. Vuelva a colocar los plantones con plantas frescas de placas de germinación. </li><li> Abra cada microcosmos e inocular 100 l de la S. apropiada meliloti suspensión sobre la raíz de plántulas. Vuelva a colocar la tapa y dejar de lado en stac horizontalks de 6-10 microcosmos. Para cada S. cepa meliloti a comparar, inocular al menos 15 plantas. Para las cepas que tienen sutiles diferencias en la productividad simbiótica, inocular 30-35 plantas. Deje por lo menos 10 plantas sin inocular como control negativo. Se inoculan las plantas con 30-35 S. meliloti 1021 u otra cepa de tipo salvaje apropiada para servir como control positivo. </li><li> Después de la S. suspensión meliloti ha tenido tiempo para adsorberse sobre la superficie de la raíz y el líquido de suspensión ha empapado en el agar (al menos 20 min.), envolver cada placa individualmente con película de parafina. Las placas deben ser envueltos hasta el borde mismo de la categoría, pero la película de parafina no deben bloquear el crecimiento de las plántulas (Figura 4C). </li><li> En el momento de envolver, hacer una comprobación final para las raíces adheridas al interior de la tapa de placa. Para quitar las raíces adheridas de la tapa, coloque la placa plana en el banco y puntear o chasquear la tapa para golpear la raíz hacia abajo sobre el agar dorface. </li><li> Alinee los portales de plántulas de cada pila de 6-10 platos. Coloque la pila en un ángulo de 90 º con las plantas de semillero apuntando hacia arriba (Figura 4D). La adherencia de la película de parafina sostendrá las placas en su lugar el tiempo suficiente para envolver toda la pila de papel de aluminio, dejando una franja de 1-2 cm desenvuelto cuando las plántulas emergen (Figura 4E). La lámina protege las raíces de la luz. </li><li> Coloque las pilas de papel de aluminio envuelto en una cámara de crecimiento con luz o cámara de crecimiento a 21-25 ° C, humedad relativa de 60-70% y 100-175 mmol / m -2 s -1 luz sobre un oscuro ciclo de 16 horas de luz / 8 h ( Figura 1A). Bajo estas condiciones de crecimiento, la incubación prolongada a niveles de luz mayor que 200 mol / m -2 s -1 puede tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento de la planta. </li></ol> 7. El examen de los sistemas de raíces y cuantificación de fenotipos simbióticos Las plantas pueden ser mantenidos enmicrocosmos de hasta 9 semanas. <ol><li> Número de nódulos se puede cuantificar en una serie de puntos de tiempo por desenvolver la hoja de cada pila y contando nódulos. El desarrollo de nódulos en plantas inoculadas con S. meliloti 1021 tipo salvaje son evidentes por 10 a 14 días después de la inoculación. </li><li> La productividad simbióticos también se puede medir en cada punto de tiempo mediante la medición de la longitud de la rama emergente. </li><li> Cuantificación final de la productividad simbiótica se realiza generalmente a las 7 semanas después de la inoculación y desconecta el rodaje y la medición del peso fresco de la rama. Este paso puede realizarse tan tarde como 9 semanas si se desea crecimiento a más largo. </li></ol>

<ol><li>Galibert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composite+genome+of+the+legume+symbiont+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti.</a> Science. 293, 668-672 (2001).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520-524 (2011).</li>
<li>Glazebrook, J., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+techniques+in+Rhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic techniques in Rhizobium meliloti.</a> Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).</li>
<li>Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+in+medicago+truncatula+using+Tnt1+insertion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants.</a> Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).</li>
<li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).</li>
<li>Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Petri+Dish+Technique+for+the+Aseptic+Synthesis+of+Ectomycorrhizae%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany-Revue+Canadienne+De+Botanique%22%5BJournal%5D)">A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae.</a> Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).</li>
<li>Barker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+DG+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).</li>
<li>Leonard, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Assembly+for+Use+in+the+Testing+of+Cultures+of+Rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia.</a> J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).</li>
<li>Trung, B. C., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+Leonard+jar+assembly+for+screening+of+effective+rhizobium%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci+Plant+Nutr%22%5BJournal%5D)">Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium.</a> Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).</li>
<li>Penmetsa, R. V., Cook, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+diverse+developmental+mutants+of+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).</li>
<li>Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia%2C+J+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).</li>
<li>Vincent, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVincent%2C+JM+%22A+Manual+for+the+Practical+Study+of+the+Root-Nodule+Bacteria%22">A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria</a>. , Blackwell. (1970).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1982).</li>
<li>Pladys, D., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+during+Development+and+Senescence+of+Effective+and+Plant+Gene-Controlled+Ineffective+Alfalfa+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules.</a> Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).</li>
<li>Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abortion+of+infection+during+the+Rhizobium+meliloti-alfalfa+symbiotic+interaction+is+accompanied+by+a+hypersensitive+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction.</a> The Plant J. 4, 555-566 (1993).</li>
<li>Johnson, L. E. B., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+Biochemical+Comparisons+of+Plant+Induced+Ineffective+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules.</a> Phytopathology. 71, 884(1981).</li>
<li>Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+Comparisons+of+Plant+and+Rhizobium+Induced+Ineffective+Nodules+in+Alfalfa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa.</a> Physiological Plant Pathology. 17, 167(1980).</li>
<li>Van de Velde, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+legume+symbiosis.+A+molecular+view+on+nodule+senescence+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).</li>
<li>Jones, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+production+of+the+exopolysaccharide+succinoglycan+enhances+Sinorhizobium+meliloti+1021+symbiosis+with+the+host+plant+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula.</a> J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).</li>
<li>Queiroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+genomics+screen+identifies+a+Sinorhizobium+meliloti+1021+sodM-like+gene+strongly+expressed+within+host+plant+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules.</a> BMC Microbiol. 12, 74(2012).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios pasos del protocolo que son críticos para el éxito: 1) La necesidad de utilizar, planta de cultivo celular purificada probado agar no se puede exagerar. Esto no es crítico para las plántulas de alfalfa, pero es crítico para el crecimiento de M. truncatula A17. 2) Es importante para germinar las plantas de semillero en placas de agar verticales como se describe en el Paso 1. La técnica ampliamente utilizada de la germinación de plántulas en una superficie horizontal invertida en un plato hondo 15 mm <...

La interacción entre la planta huésped leguminosa Medicago truncatula A17 y la bacteria rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 es uno de los sistemas modelo más manejables para el estudio del desarrollo de nódulos de la raíz y la simbiosis fijadora de nitrógeno. Los genomas de ambos socios simbióticas se han secuenciado 1,2 y tanto la planta y bacteria son susceptibles de 3,4 manipulación genética. El análisis de los fenotipos de ambas plantas y mutantes bacterianas requiere la capacidad de observar las etapas del desarrollo de nódulos y para cuantificar la productividad simbiótica con el tiempo. Aquí se describe un método para la observación del desarrollo de nódulos de la raíz de M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculados con S. meliloti 1021 dentro de microcosmos individuales hechas de estándar, redondo 100 mm de diámetro, 15 mm placas de laboratorio profundas (Figura 1A). El rodaje está expuesto y crece a través de un portal de muescas en el lado de la placa (FigurES 1B, 1C, y 1E). Las raíces están contenidos dentro de los microcosmos y mantenerse estéril, al tiempo que permite la observación a través de la tapa de la placa (Figura 1D). Desde el rodaje es accesible, su crecimiento no está limitado y se puede medir a intervalos periódicos sin comprometer la esterilidad de la raíz. El método de creación de microcosmos-de la placa con muescas fue desarrollado originalmente por Leigh, et ​​al. 5 para el cultivo de plantas de alfalfa, pero no fue ampliamente adoptado a pesar de sus muchas ventajas sobre otros métodos. Una variación de este método también fue desarrollado para el análisis de la interacción entre raíces de las plantas y las micorrizas 6. Ahora hemos adaptado y optimizado este método para el crecimiento de M. plantas truncatula. Las ventajas de este protocolo más utilizado más comúnmente métodos se describen a continuación. Hay varios métodos que están actualmente en uso amplio para los estudios de nodulación de M. truncatula inoculaciónLated con S. meliloti 7. El método más comúnmente utilizado para la preparación a gran escala de las raíces noduladas es el crecimiento en cajones aeropónicos 7. En este método, las plantas se suspenden en un recipiente grande y las raíces se aireó con una mezcla de S. meliloti y solución nutriente 7. Este método es práctico si sólo un genotipo de S. meliloti es hacerse la prueba. Ya que requiere la aerosolización de altas concentraciones de bacterias, hay una alta probabilidad de contaminación cruzada entre cajones inoculados con diferentes cepas bacterianas. Otro método que se utiliza a menudo para preparar grandes cantidades de plantas inoculadas es el crecimiento en las tinas o recipientes de perlita, vermiculita, arena o arcilla calcinada que se infunde con solución nutritiva y se inoculó con S. meliloti 7. Este método requiere el uso de bañeras o macetas abiertas, y requiere de riego y la reposición de la solución de nutrientes. Otra desventaja de macetas es que las plantasdebe ser eliminado de esta matriz de partículas para el examen de las raíces y nódulos. Otro inconveniente de este método es que se requiere una gran área de espacio de la incubadora cuando muchos diferente S. genotipos meliloti se han de comparar, debido a una olla separada debe ser utilizado para cada genotipo bacteriano. El &quot;tarro Leonard&quot; es una variación de este método 8,9. Un tarro de Leonard se compone de dos vasos esterilizados apiladas una encima de la otra y conectadas por una mecha. El medio de crecimiento se coloca en el recipiente inferior y arrastrado a través de la mecha por acción capilar en una matriz de crecimiento de perlita, vermiculita, arena o arcilla calcinada en el recipiente superior. La plántula (s) se colocan en la matriz de crecimiento y se inoculó con S. meliloti. Este método no requiere de riego, pero el examen de las raíces y nódulos requiere que la plántula se retira de la matriz de crecimiento de partículas. Hay varios métodos que permiten la fácil exploración de roots. Uno de ellos es la &quot;bolsa de crecimiento&quot; de plástico transparente 7. Una desventaja de este método es que se requiere el riego frecuente ya que sólo ≤ 10 ml de medio líquido es óptima para el cultivo de M. truncatula en bolsas de 7. Experimentos bolsa también se limitan generalmente a ~ 2 semanas 7, debido a la ruptura de la mecha de papel dentro de la bolsa. Otros dos métodos que se utilizan comúnmente son similares a nuestro método en el que las plantas se cultivan en agar y las raíces son visibles, pero estos métodos también tienen desventajas que nuestro procedimiento evita. En estos métodos, las plantas están completamente contenidos dentro de 24.5 cm x 24.5 cm de placas de agar sellados alrededor de la parte superior con cinta quirúrgica porosa o cultivadas en tubos de agar inclinado con tapón con tapones de algodón o tapas de plástico 7. Ambos de estos métodos permiten fácil examen de las raíces y se puede mantener estéril. Sin embargo, los tubos inclinados de agar se crecen generalmente con sólo 20 ml de agar de medio 7 y requieren de riego y de nutrientes de unaddition para el crecimiento a largo plazo de las plantas. Las plantas que crecen dentro de los 24.5 cm x 24.5 cm de agar microcosmos placas tienen humedad y nutrientes para el crecimiento a largo plazo suficiente, pero el rodaje creciendo rápidamente se convierte constreñidos dentro del microcosmos placa cerrada y el gas etileno pueden acumularse inhibición de la nodulación 7. En el procedimiento que se describe aquí, la sesión se expone y crece libremente fuera del microcosmos que contiene ~ 70 ml de los medios de comunicación, lo que permite el crecimiento a largo plazo. El procedimiento descrito aquí puede ser útil no sólo para el estudio de la nodulación de plantas leguminosas, pero también para el estudio de los fenotipos de las raíces de otras plantas de tamaño medio. La diferencia entre estos microcosmos y una planta de policarbonato de cultivo de tejidos tarro tradicional es que las raíces en los microcosmos de la placa descritas aquí crecen en la superficie vertical del agar en lugar de hacia abajo en una capa horizontal de agar en la parte inferior de la jarra. Esto permite que la raíz que se despegó de la superficie de agar con un mínimo de dAmage a pelos de la raíz y una adhesión mínima de agar a la superficie de la raíz, lo que facilita el examen de los pelos radicales por microscopía.

<table><tbody><tr><td>Agar purificado, probado en cultivo de células vegetales</td><td>Sigma</td><td>A7921</td><td></td></tr></tbody></table>

single-plantas, microcosmos estériles para nodulación y el crecimiento de la planta de la legumbre<em&gt; medicago truncatula</em&gt; con el rhizobial symbiont<em&gt; sinorhizobium meliloti</em

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Rizobios forman nódulos simbióticos, que fijan el nitrógeno en las raíces de plantas leguminosas huésped compatibles. Uno de los sistemas modelo más bien desarrollados para el estudio de estas interacciones es la planta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 y la bacteria rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021. Proyección de imagen repetida de raíces de las plantas y de puntuación de fenotipos simbióticas requiere métodos que son no destructivos para plantas o bacterias. Los fenotipos simbióticas de alguna planta y los mutantes de bacterias se hacen evidentes después de períodos relativamente cortos de crecimiento, y no requieren de la observación a largo plazo de la interacción huésped / simbionte. Sin embargo, las diferencias sutiles en la eficiencia y la senescencia nódulo fenotipos simbióticas que no son aparentes en las primeras etapas del proceso de nodulación requieren períodos de crecimiento relativamente largos antes de que puedan ser marcados. Varios métodos han sido desarrollados para el crecimiento y la observación de este par huésped / simbionte a largo plazo.Sin embargo, muchos de estos métodos requieren riego repetida, lo que aumenta la posibilidad de contaminación por otros microbios. Otros métodos requieren un espacio relativamente grande para el crecimiento de un gran número de plantas. El método descrito aquí, el crecimiento simbiótica de M. truncatula / S. meliloti, en microcosmos de una sola planta estéril, tiene varias ventajas. Las plantas en estos microcosmos tienen humedad y los nutrientes suficientes para garantizar que el riego no se requiere para hasta 9 semanas, evitando la contaminación cruzada durante el riego. Esto permite que los fenotipos que se deben cuantificar que pueden perderse en los sistemas de crecimiento a corto plazo, tales como retrasos sutiles en el desarrollo de nódulos y la senescencia nódulo temprano. Además, las raíces y nódulos en el microcosmos se ven fácilmente a través de la tapa de la placa, por lo que no se requiere up-enraizamiento de las plantas para la observación.

La preparación e inoculación de estos microcosmos placa es relativamente simple en comparación con la mayoría de los otros métodos descritos en la Introducción. El uso de estos microcosmos también permite el crecimiento de plantas prolongado (hasta 9 semanas) sin riego o la suplementación de nutrientes, el mantenimiento de la esterilidad de la raíz, a la vez fácil exploración de las raíces y la protección de las raíces de la luz, el crecimiento sin restricciones de planta con brotes, fácil acceso a la sesión de medición...

Crecimiento de las plantas de Medicago truncatula en simbiosis con las bacterias que fijan el nitrógeno Sinorhizobium meliloti, en microcosmos estériles individuales a partir de placas estándar de laboratorio permite el examen frecuente de sistemas de raíces y nódulos sin comprometer la esterilidad. Las plantas pueden ser mantenidas en estas cámaras de crecimiento de hasta 9 semanas.

Single-plantas, Microcosmos estériles para nodulación y el crecimiento de la planta de la legumbre<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Con el Rhizobial Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los fenotipos simbióticos de plantas de Tula portadoras de medicamentos inoculadas con diferentes variantes mutantes de la bacteria fijadora de nitrógeno sino oum me latte, utilizando microcosmos estériles individuales elaborados a partir de placas de laboratorio estándar. Esto se logra primero mediante la escarificación de Mula, 17 semillas con ácido y la germinación de las semillas en placas de agar. El segundo paso consiste en preparar microcosmos estériles individuales utilizando una espátula caliente doblada para hacer una muesca en cada placa solidificada y su tapa, cerrando así la placa. Más adelante, dejaremos un orificio ovalado en el costado. A continuación, coloque plántulas individuales de Mula sobre los microcosmos con la punta de la raíz, en contacto con el agar y con 0,5 centímetros del conducto sobresaliendo por la muesca en forma de U en la placa. El último paso consiste en la inoculación con SME latte y la incubación de las placas como pilas envueltas en papel de aluminio en una cámara de crecimiento iluminada.Finalmente, la cuantificación de la longitud y el peso del brote vegetal, así como del tipo de nódulo, se utiliza para mostrar el éxito simbiótico relativo de cada cepa S milliot high o mutante ULA. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos que permiten el examen visual continuo del crecimiento radicular, como las bolsas de crecimiento y el cason, es que existe un riesgo muy bajo de contaminación cruzada entre plantas inoculadas con diferentes cepas de Cy Melo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la simbiosis Zoia legum, como el período de desarrollo de los nódulos radiculares en plantas mego trica inoculadas con una colección de cepas s rosa Melodi que invaden las raíces con distintas eficiencias.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la construcción de los microcosmos y la transferencia de las plántulas son difíciles de describir por escrito. Me ayudarán a demostrar este procedimiento Haji Mendez, un estudiante de posgrado, y Clotilde Caru, una investigadora postdoctoral de mi laboratorio. Este procedimiento comienza con la esterilización del M trunk aula.Para 17 semillas mediante escarificación ácida, primero pese suficientes semillas para obtener el número deseado de plántulas. Dado que las semillas de A 17 pesan aproximadamente cuatro miligramos cada una, transfiera las semillas a frascos estériles de 125 mililitros con tapas de papel aluminio estéril y añada mediante pipeta 20 mililitros de ácido sulfúrico concentrado por la pared del frasco. Agregar el ácido por la pared del frasco permitirá esterilizar la parte interna del mismo que entrará en contacto con las semillas no esterilizadas.Desagregue los grumos de semillas con una pipeta de vidrio estéril. Agite suavemente cada matraz frecuentemente durante 10 a 12 minutos. Aparecerán pequeñas hendiduras marrones en las semillas.Estos son pequeños orificios en la cubierta de la semilla cuando al menos el 10% de las semillas presentan hoyuelos marrones pequeños o han pasado 12 minutos, lo que ocurra primero; retire todo el ácido del matraz con una pipeta de vidrio estéril. Incline el matraz para recoger el ácido restante en la curvatura del mismo y utilice una pipeta de vidrio pequeña para eliminar todo el ácido residual. Enjuague las semillas vertiendo rápidamente 100 mililitros de agua ultrapura estéril en cada matraz. El exceso de volumen de agua diluirá el ácido y evitará el sobrecalentamiento y el daño a las semillas durante la reacción del ácido con el agua. Vierta fuera el agua y esterilice la boca del matraz con llama.Añada 50 mililitros de agua estéril ultrapura en cada matraz y agite suavemente. Vierta el agua, flamee el borde del matraz. Añada otros 50 mililitros de agua estéril ultrapura y agite de esta manera.Lave las semillas de ocho a diez veces después del último enjuague. Vierta 50 mililitros de agua ultrapura estéril en cada matraz y reemplace la cubierta de papel de aluminio estéril; coloque a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante la noche. Al día siguiente, para permitir la imbibición de las semillas, lleve los dos matraces a una cabina de flujo laminar estéril.Todos los pasos subsiguientes deben realizarse en una cabina de flujo laminar estéril, ya que las esporas de moho en el aire son los contaminantes más problemáticos. Deseche el agua de cada matraz y enjuague dos veces con aproximadamente 25 mililitros de agua ultrapura. Después del segundo enjuague, agregue 20 mililitros de agua ultrapura estéril a cada matraz, agite suavemente para resuspender las semillas y vierta las semillas en una placa de germinación con agar al 1,1–1,2 %; agite la placa para distribuir las semillas.Las semillas deben distribuirse uniformemente en una banda de cuatro a cinco centímetros. En uno de los extremos de la placa, esto será la parte superior de la placa. Los últimos cinco a seis centímetros deben mantenerse libres de semillas.Extraiga el agua con una pipeta estéril. Incline la placa a un ángulo de 45 grados durante 10 a 20 minutos para permitir que el agua restante drene hacia la parte inferior de la placa. A continuación, retire todo el agua que se haya acumulado en la parte inferior de la placa inclinada utilizando una pipeta estéril.Sustituya la tapa y selle la placa con parafina. Apile las placas de germinación y luego colóquelas todas en posición vertical. A un ángulo de 90 grados, las semillas quedarán sobre la superficie vertical del agar. Las semillas completamente imbuidas deben adherirse fácilmente al agar. Las raíces crecerán hacia abajo. Envuelva la pila de placas de germinación con papel de aluminio para bloquear la luz y manténgalas a 25 grados Celsius durante tres días.Para comenzar este procedimiento, prepare el medio de Jenssen siguiendo la receta y las instrucciones del manuscrito adjunto. Una vez que el medio haya enfriado, se hayan añadido los suplementos y se haya verificado el pH, comience a verter el medio en placas redondas de 100 milímetros de diámetro y 15 milímetros de profundidad.Las placas deben llenarse con una profundidad aproximada de 0,9 a un centímetro, utilizando alrededor de 70 mililitros de medio por placa. Apile las placas durante el vertido para evitar la formación de condensación en las tapas.Los componentes del medio de Jenssen pueden formar un precipitado turbio, por lo que es importante devolver periódicamente el matraz al agitador magnético para evitar que los componentes se sedimenten. Después de que los medios de Jenssen hayan solidificado, tanto las placas como las tapas deben muescarse con una espátula de pesaje doblada en forma de U. Caliente la curvatura de la espátula con un mechero hasta que esté al rojo vivo, muesque cinco o seis placas y luego caliente y muesque nuevamente; también muesque las tapas de las placas.Cuando se coloca la tapa ranurada sobre la placa ranurada, se creará una abertura ovalada a través de la cual crecerá el brote de la plántula. Tres días después de que las semillas de Mula se hayan sembrado para la germinación como se mostró anteriormente, abra una placa de germinación e inmediatamente inunde con agua estéril ultrapura. Sumerja la pinza en etanol y flamee brevemente para esterilizar.Utilice la pinza estéril para empujar suavemente las puntas radiculares de todas las plántulas bajo el agua con el fin de evitar que se sequen; seleccione plántulas con raíces rectas y sin defectos evidentes. Revise las tapas de los microcosmos de medio de Jenssen en busca de acumulación de condensación. Golpee ligeramente la tapa con la pinza para eliminar la condensación.Tomar suavemente una plántula de la placa de germinación por los edins y colocar la raíz sobre un microcosmos de medio jenssen. Asegúrese de que la punta de la raíz esté en contacto con el agar. Retire suavemente la cubierta de la semilla si aún está presente. Separe con cuidado la cubierta de la semilla usando la pinza hasta que ceda, y deseche la cubierta y aproximadamente 0,5 centímetros del embrión. La plántula debe sobresalir por la muesca en forma de U de la placa; coloque cuidadosamente la tapa de la placa con la muesca en forma de U sobre la plántula, creando así un portal para la plántula antes de la inoculación de los microcosmos. Las suspensiones de inóculo se preparan a partir de cultivos de S. mil latte según se describe en el texto adjunto.Cada suspensión se diluye en agua estéril ultrapura hasta un OD 600 de 0,05, y la turbidez de la suspensión debe ser apenas perceptible a simple vista. Abra cada microcosmos e inocule 100 microlitros de la suspensión de salvati adecuada sobre la raíz de la plántula. Vuelva a colocar la tapa y coloque los microcosmos en pilas horizontales de seis a diez unidades para cada cepa de SEL que se vaya a comparar.Inocule al menos 15 plantas para cepas que presenten diferencias sutiles en productividad simbiótica. Inocule de 30 a 35 plantas. Deje al menos 10 plantas sin inocular como control negativo. Inocule de 30 a 35 plantas con Esme Lata 1 0 2 1 u otra cepa silvestre adecuada para servir como control positivo. Espere al menos 20 minutos para permitir que la suspensión de Esme Lata se absorba en la superficie de la raíz y que el líquido de la suspensión se impregne en el agar. Envuelva cada placa individualmente con película de parafina; las placas deben envolverse hasta el borde mismo de la muesca, pero la película de parafina no debe obstruir el crecimiento de la plántula. Alinee los orificios de salida de las plántulas en cada pila de seis a 10 placas.Coloque la pila en un ángulo de 90 grados con las plántulas orientadas hacia arriba. La adherencia de la película de parafina mantendrá las placas en su lugar el tiempo suficiente para envolver toda la pila con papel de aluminio, dejando una franja de uno a dos centímetros sin envolver en el lugar por donde emergen las plántulas. Coloque las pilas envueltas en papel de aluminio en una cámara de crecimiento iluminada o en un cuarto de crecimiento ajustado a las condiciones adecuadas.Las plantas pueden mantenerse en microecosistemas hasta nueve semanas. El número de nódulos puede cuantificarse en una serie de puntos temporales desenrollando la lámina de aluminio de cada pila y contando los nódulos. Los nódulos en desarrollo en plantas inoculadas con el tipo silvestre SME 1 0 2 1 son evidentes entre 10 y 14 días después de la inoculación.La productividad simbiótica también se puede medir en cada punto temporal mediante la medición de la longitud de la vaina emergente. La cuantificación final de la productividad simbiótica generalmente se realiza a las siete semanas después de la inoculación, separando la vaina y midiendo el peso fresco de las plántulas jóvenes de ch. En esta foto se muestran plántulas creciendo en microcosmos dentro de un incubador.Si se empaquetan de forma compacta, más de 220 microcosmos cabrán en un estante de incubadora de 73,8 centímetros por 67,5 centímetros. Las siguientes cuatro imágenes muestran varias vistas diferentes de microcosmos que contienen Mula. Un total de 17 plantas inoculadas con el tipo silvestre S, Malta 1 0 2 1, paneles B y C, muestran microcosmos en una pila envuelta en papel de aluminio, con plantas emergiendo de las aberturas en los microcosmos.La longitud del brote se puede medir desde el punto de emergencia del microcosmos sin perturbar la planta. El panel D muestra un microcosmos individual con el papel de aluminio retirado y las raíces y nódulos visibles a través del frente de la placa. El panel E muestra el mismo microcosmos colocado horizontalmente, con la planta emergiendo del orificio en la placa.El crecimiento en los microcosmos es ideal para recopilar una serie de puntos temporales del desarrollo de los nódulos y de la longitud del tallo. Este gráfico muestra los datos de longitud del tallo para emran atula. 17 plantas inoculadas con el tipo silvestre Es Malta 1 0 2 1 en comparación con plantas no inoculadas a las siete semanas y nueve semanas posteriores a la inoculación.A las nueve semanas posteriores a la inoculación, se cortan los brotes para medir el peso fresco de la parte aérea. Las plantas no inoculadas dejarán de crecer, se volverán amarillas y sus brotes alcanzarán un peso de aproximadamente 0,01 gramos. Las plantas inoculadas con cepas ssta que invaden Mula de manera más eficiente crecerán más rápido y alcanzarán un peso de entre 0,10 y 0,12 gramos a las nueve semanas posteriores a la inoculación.Esta figura muestra ejemplos de tres fenotipos simbióticos a las siete semanas posteriores a la inoculación. La productividad simbiótica relativa de las plantas MTR aula. A 17 inoculadas con diferentes corrientes de smeta se cuantifica mediante la longitud del brote en centímetros, metros y el peso fresco del brote en gramos.Los asteriscos sobre las barras de injerto indican una diferencia estadísticamente significativa respecto a la cepa de referencia silvestre 1 0 2 1 en una prueba T no apareada. El número de nódulos radiculares en plantas inoculadas con estas cepas se muestra en el Panel C. Un color rosa indica que los nódulos son funcionales y capaces de fijar nitrógeno, mientras que los nódulos blancos pequeños suelen ser no funcionales y los nódulos marrones son senescentes y necróticos. Las comparaciones en esta figura mostraron que la productividad simbiótica de las plantas M trunk aula A 17 inoculadas con SML Lavati 1 0 2 1 que portan el plásmido P-S-T-B-L-A FFR cinco XOY, el cual sobreexpresa la fosfogalactosil transferasa parental XOY ecop, es mayor que la de la cepa silvestre S me 1 0 2 1 y las cepas que portan el plásmido de control negativo P-S-T-B-L-A-F-R cinco.Estas cepas que sobreexpresan ex oy producen más glicano de exopolisacárido simbiótico SAG que las cepas control. La capacidad de cuantificar diferencias en fenotipos simbióticos que tardan varias semanas en manifestarse es una ventaja importante de este método para todas las mediciones de productividad simbiótica. En MTR Aula A 17, las cepas Sano Zoia Medicaid WSM 4 1 9 y ABS siete tienen un mejor desempeño que las plantas Smeta 1 0 2 1 inoculadas con un mutante nulo XO YN cinco que no produce ningún suc y O-glicano, las cuales presentaron longitudes de brotes y pesos frescos similares a los de plantas no inoculadas y produjeron únicamente nódulos inefectivos en el momento en que se desmonta el microcosmos y se miden los pesos frescos de los brotes, los cuales también pueden ser removidos.Para obtener imágenes representativas del tronco M de atula. Se muestran aquí 17 raíces tras su extracción de los microcosmos en esta figura. Los paneles A y B son imágenes a los 10 días posteriores a la inoculación, y el panel C es una imagen a los 14 días posteriores a la inoculación; la barra en cada imagen corresponde a 100 micrones.Las raíces mostradas aquí fueron inoculadas con smeta 1 0 2 1 de tipo silvestre, una cepa de smeta que porta una fusión egg, C Gus y una cepa de smeta que porta una fusión SMC 0 0 9 1 1. Gus. En el panel C, la tinción Gus de células STI que portan la fusión SMC 0 0 9 1 1 Gus es visible en los pelos radicales y en la superficie de la raíz. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener siempre la raíz de la plántula en contacto con el agar siguiendo este protocolo.Otros métodos como la sección y tinción de nódulos, y la preparación de ARN total a partir de raíces y nódulos, pueden realizarse para analizar las diferencias en anatomía, fisiología y expresión génica asociadas con cada fenotipo simbiótico. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo establecer microcosmos estériles individuales para la observación de la simbiosis entre Mego Tula Sino Rosa Melo, incluyendo la germinación de semillas, la preparación del microcosmos y la inoculación de plántulas.

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Single-plantas, Microcosmos estériles para nodulación y el crecimiento de la planta de la legumbre Medicago truncatula Con el Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti (Video) | JoVE Journal

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