Observación Y Cuantificación De Fibroblastos Mediada Por Fibrina Gel Compactamiento

El objetivo general de este procedimiento es observar y analizar el efecto de las interacciones entre la célula y la matriz sobre el reordenamiento de fibras y las actividades de remodelación matricial en un sistema de gel de fibrina. Esto se logra primero polimerizando un gel tridimensional de fibrina que contiene microesferas sobre un cubreobjetos contenido dentro de un biorreactor con control ambiental. El segundo paso consiste en preparar una suspensión celular altamente concentrada que se utiliza para posicionar agrupaciones de fibroblastos o explantes X en patrones geométricos sobre la superficie del gel.

A continuación, se obtienen imágenes de la muestra cada 15 minutos mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial durante un periodo de 48 horas. El paso final consiste en medir el grado de reorganización y remodelación del fibrinógeno en forma de deformación (strain) a partir de diferentes regiones del gel, utilizando la correlación digital de imágenes. En definitiva, este sistema de explante permite organizar las células en patrones geométricos simples, lo que facilita la visualización y el estudio de los mecanismos subyacentes a la remodelación matricial y al reordenamiento de fibras impulsados por las células.

Este método puede responder preguntas clave en el campo de la biología mecánica, como cuáles son los efectos de señales mecánicas muy específicas en el espacio y en el tiempo sobre el comportamiento celular y los cambios resultantes que estas generan en la matriz de tejido circundante. Se demostrará en este procedimiento Arabic de Jesús, un estudiante de posgrado de mi laboratorio, que disuelve suavemente el fibrinógeno en solución salina precalentada a 37 grados Celsius durante la noche para crear una solución stock de 33,3 miligramos por mililitro. Prepare una plantilla en perfil para delimitar la ubicación de cada explante x siguiendo la geometría espacial deseada.

Cada punto a aproximadamente uno o dos milímetros de distancia. Esta distancia corresponde a un espaciado ideal para generar alineación de fibras entre explantes. A continuación, limpie cuidadosamente todos los componentes del biorreactor utilizando etanol al 70 % y coloque los componentes limpios bajo la luz UV de una cabina de cultivo tisular durante dos o tres horas antes de la implantación.

Después de que los componentes del biorreactor hayan sido esterilizados, fije la plantilla debajo del área del cubreobjetos de 60 milímetros de diámetro donde se preparará la muestra utilizando cinta adhesiva. A continuación, prepare la suspensión de microesferas, seguida por el fibrinógeno y la trombina. Las soluciones stock combinan 0,017 mililitros de la solución stock de microesferas y 0,149 mililitros de DMEM en un tubo microcentrífuga para obtener una concentración de 10 millones de esferas por mililitro.

Luego, someta la suspensión a ultrasonido durante 10 minutos para dispersar las perlas y homogeneizar la solución. Añada 0,22 mililitros de la solución stock de fibrinógeno a 0,44 mililitros de tampón HEPES 20 milimolar y 0,1667 mililitros de la solución de microperlas en un tubo cónico de 15 mililitros. Mezcle suavemente los componentes y luego coloque el tubo en hielo dentro de otro tubo cónico de 15 mililitros.

Mezclar juntos. 32,8 µL de trombina disuelta en solución salina al 25 unidades por mililitro. 131 µL de tampón HEPES 20 milimolar, y 2,46 µL de cloruro de calcio 2 molar.

A continuación, mezcle cuidadosamente las soluciones preparadas de trombina y fibrinógeno pipeteando de arriba abajo de cinco a 10 veces hasta que la solución esté uniformemente distribuida. Intente minimizar la introducción de burbujas en la mezcla sin vaciar completamente la pipeta durante la mezcla. Pipetee la solución mezclada en moldes cuadrados de PDMS de ocho milímetros de lado sobre un cubreobjetos lo antes posible y deje que el gel se polimerice a temperatura ambiente.

La adición de trombina hará que la solución se gelifique rápidamente en aproximadamente 30 segundos tras la polimerización; selle el biorreactor y prepare los explantes celulares para comenzar la recolección de células de fibroblastos dérmicos humanos con una confluencia del 70 al 90 %. Recolecte las células de un frasco T75 utilizando tripsina y centrifúguelas a 200 × g durante cinco minutos. Transfiera el biorreactor a una cabina de seguridad biológica y retire cuidadosamente la tapa siguiendo condiciones asépticas. Luego aspire el medio y re suspenda el sedimento celular hasta una concentración final de 20 millones de células por mililitro en DMEM con 10 % de FBS.

A continuación, cree explantes cargando células en una micropipeta e inyectando 0,3 microlitros de la suspensión celular en el gel de fibrina polimerizado. Siguiendo el patrón en la plantilla, cada explante debe contener aproximadamente 6.000 células. Una vez que los explantes hayan sido colocados sobre el gel, selle el biorreactor.

A continuación, inserte los bloques calefactores y conecte los termopares al controlador de temperatura. Ajuste el controlador de temperatura a 37 grados Celsius e incube los geles durante una hora para permitir que las células se sedimenten y se adhieran a la matriz de fibrina. Luego, agregue aproximadamente cinco mililitros de DMEM que se ha condicionado durante dos a tres horas con 5% dióxido de carbono y suplementado con 10% suero bovino fetal, 1% penicilina-estreptomicina, 0,1% anfotericina B y 10 microgramos por mililitro de aprotinina directamente en la cámara del biorreactor.

Luego, vuelva a sellar el biorreactor. Utilice una jeringa para introducir los cinco mililitros adicionales de medio acondicionado con dióxido de carbono a través del conector abocardado del puerto de entrada, llenando completamente el biorreactor; retire cuidadosamente cualquier burbuja que se forme. Prepare una bomba de jeringa con una jeringa de 10 mililitros o de 30 mililitros llena con medio adicional acondicionado con 5% de dióxido de carbono. Conecte la jeringa directamente al puerto de entrada de la tapa del biorreactor mediante un tubo estéril con conexión tipo bayoneta.

Establezca la velocidad de perfusión en la bomba de jeringa a 0,01 mililitros por minuto. Luego conecte piezas modificadas de tubo a ambos puertos de salida y coloque los extremos en un vaso de precipitados de 100 mililitros. Para recoger los desechos, utilice un elevador de laboratorio para ajustar las alturas de las entradas y salidas de manera que no se genere un diferencial de presión en el suministro del biorreactor.

Añada medio enriquecido con dióxido de carbono al 5 % fresco al biorreactor durante todo el experimento. Con el fin de mantener el pH, suministrar nutrientes y eliminar los productos de desecho, una jeringa de 10 mililitros llena de medio durará aproximadamente 16 horas. Coloque el objetivo 20 XDIC debajo de la ventana de observación del microscopio y asegúrese de que el polarizador, el analizador y el prisma estén todos colocados correctamente.

Luego abra el software de imagen. Enfoque el objetivo en el área entre los tres x explan y guarde las coordenadas X, Y y Z de esta ubicación en el software de imagen. Con el fin de obtener imágenes de toda el área entre y alrededor del x explan, seleccione la opción para adquirir una imagen grande y especifique el tamaño del área.

Esto permitirá la adquisición de múltiples imágenes alrededor del área especificada y creará una imagen compuesta de gran tamaño. Configure la intensidad de luz y el tiempo de exposición en los valores más bajos posibles. Esto ayudará a evitar la muerte celular causada por la fototoxicidad, al tiempo que proporciona una resolución suficiente para distinguir entre células, microesferas y fibras de fibrina. Tenga en cuenta que, en este experimento particular, las fibras de fibrina no son visibles debido a la alta densidad de microesferas dispersoras de luz en el gel; reduzca la densidad de microesferas o el grosor del gel para poder observar las fibras de fibrina.

A continuación, inicie el seguimiento de la deformación. Primero, cree o descargue código MATLAB personalizado y luego registre las imágenes utilizando microesferas a lo largo del gel como puntos de referencia. El registro de la imagen garantizará que las imágenes obtenidas se tomen exactamente en la misma ubicación cada vez.

Se observó el reordenamiento de las fibras entre explantes mediante la captura de imágenes en mosaico cada 15 minutos. Durante un período de 48 horas, se extrajeron regiones individuales de las imágenes en mosaico y se analizaron con el algoritmo de seguimiento de deformación. Para medir las deformaciones locales a partir del desplazamiento de microesferas, los mapas de contorno muestran la distribución de la deformación principal máxima en la zona de reordenamiento de fibras correspondiente a la correa.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente de tres a cuatro horas si se realiza correctamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden llevar a cabo otros métodos, como la marcación fluorescente del colágeno y de las proteínas del citoesqueleto, así como la cuantificación de la migración celular, con el fin de responder preguntas adicionales, como qué vías mecanobiológicas están involucradas en la remodelación del tejido y cómo son modulados estos procesos por diversos compuestos bioquímicos.