Name: Establecimiento de un modelo quirúrgicamente inducida en ratones para investigar el papel de protección de progranulina en la osteoartritis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende a establecer el modelo DMM en ratones para investigar la osteoartritis mediante análisis histopatológicos y puntuaciones MANKIN. Este método permite evaluar el papel protector de la progranulina en la progresión de la enfermedad articular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH subvenciones de investigación R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, y una enfermedad objeto de Becas de Investigación de la Fundación de Investigación de Reumatología (a CJ Liu).

Todos los procedimientos quirúrgicos relacionados con los animales debe ser aprobado por el Cuidado de Animales y el Comité de Ética de la institución local con un esfuerzo realizado para minimizar el dolor y la incomodidad causada por la cirugía. 1. Preparación <ol><li> Seleccionar 8-12 semanas de edad macho C57BL / 6 ratones con un peso corporal de aproximadamente 25 g para la cirugía. </li><li> Se anestesia a los animales mediante la inyección intraperitoneal de un cóctel que contiene tanto xilazina (5 mg / kg) y ketamina (40 mg / kg). </li><li> Afeitado de la rodilla con las maquinillas de afeitar, a continuación, cuelgue quirúrgicamente el animal y esterilizar el sitio quirúrgico con betadine y alcohol (3x) y cubrir los ojos del ratón con el ungüento. </li></ol> 2. Proceso quirúrgico <ol><li> Hacer un 1 cm de la incisión longitudinal medial para-patelar para exponer articulación de la rodilla. </li><li> Abra la articulación de la rodilla suavemente a través de la luxación lateral de la rótula y el tendón rotuliano. <ol><li> Cortar la cápsula de la articulación de la rodilla longitudinalmentea través de la incisión medial para-patelar en el paso 2.1. </li><li> Diseccionar cápsula articular de la rodilla con una pinza. </li><li> Coge la parte distal de la pata trasera con la mano izquierda, y le realizará luxación lateral de la rótula y el tendón rotuliano con fórceps. Sostenga la pata trasera con cuidado y asegúrese de evitar el trauma en la pata. Cuanto mejor sea la cápsula de la articulación se disecciona, se requiere menos fuerza para hacer que la dislocación. </li></ol></li><li> Por goteo de solución salina estéril en la superficie del cartílago articular durante la operación para evitar la desecación de la superficie del cartílago. </li><li> Cortar el ligamento medial meniscotibial que ancla menisco medial de la meseta tibial. Evitar lesiones en el cartílago debajo del menisco medial. <ol><li> Identificar el menisco medial que se localiza entre el cóndilo medial del fémur y la meseta medial de la tibia. </li><li> Identificar el ligamento que conecta meniscotibial lado lateral del menisco medial con eminencia intercondílea de la tibia. </li><li> Sostenga la hiND pata suavemente con la mano, y cortar a través del ligamento meniscotibial medial cuidadosamente mediante el uso de una cuchilla quirúrgica N º 10. Asegúrese de no causar herir al cartílago articular y otros ligamentos. En muchos casos, la almohadilla de grasa que cubre necesita ser tirada hacia el lado, pero no ser retirado con el fin de identificar el ligamento. </li></ol></li><li> Cierre la cápsula de la articulación de la rodilla con una sutura absorbible 6-0. </li><li> Cierre la piel con sutura de seda 6-0. </li></ol> 3. Cuidados después de la operación <ol><li> Aplicar una gota de 0,25% de bupivacaína en el sitio quirúrgico de cada ratón para minimizar el dolor post-operatorio. </li><li> Deje los ratones operados gratis para conseguir agua y comida. </li></ol> 4. Scoring histológico de Surgical Modelo DMM <ol><li> Sacrificar los ratones en los puntos indicados de tiempo (por ejemplo, 4 semanas, 8 semanas y 12 semanas. Aquí mostramos los resultados de 8 semanas como representante) después de la cirugía. </li><li> Las articulaciones de la rodilla enteras son fijos, descalcificada, embedded por parafina y luego realizaron cortes seriados 5 intervalo de micras. <ol><li> Cortar todo los miembros posteriores con N º 10 cuchillas. </li><li> Diseccionar la piel y los músculos de las extremidades traseras cuidadosamente, y fijar las muestras con 4% PFA durante 3 días en RT. </li><li> Retire la PFA, y limpiar las muestras con agua. Después, las muestras descalcificar en EDTA a 4 ° C durante 2 semanas. </li><li> Deshidratar las muestras en un gradiente de etanol. En detalle, mantener las muestras en etanol al 70% durante 1 hora, a continuación, cambiar el etanol y mantener las muestras en un nuevo conjunto de etanol al 70% para el S / N. Después, poner las muestras en el 80% y etanol al 90%, en consecuencia, y mantenerlos durante 1 hora, respectivamente, seguido de etanol al 100% para el S / N. </li><li> Retire el etanol. Mantener las muestras en oxylene durante 1 hora, y el cambio a un nuevo conjunto de oxylene. Repita este paso 3x. </li><li> Incorporar las muestras en un molde de parafina utilizando el centro de la incrustación de Leica. Después, las muestras se seccionaron a 5 micras usando un micrótomo rotatorio (Leica RM2255, Alemania) y después se recogieron en portaobjetos de vidrio. </li><li> Secciones sagitales en serie se cortan para cada muestra que abarca una región desde el centro del cóndilo lateral al centro del cóndilo medial. </li></ol></li><li> Tinción de safranina O se realiza, seguido de puntuación y análisis estadístico a través del sistema de puntuación OARSI lo descrito previamente 25. <ol><li> En primer lugar, Desparafinar las diapositivas en oxylene, e hidratar en un gradiente de etanol a agua destilada. Posteriormente, los portaobjetos se tiñen mediante hematoxilina de Weigert solución, 0,05% verde rápido (FCF) de soluciones, solución al 1% de ácido acético y 0,1% Solución de safranina O. Montar las diapositivas utilizando medio resinoso. </li><li> Puntuación de los portaobjetos con tinción de safranina O basado en la pérdida de proteoglicanos (color rojo) en el cartílago y el porcentaje de destrucción de la estructura del cartílago, hacer el análisis estadístico para la puntuación histológica. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+socioeconomic+trends+in+orthopaedic+practice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).</li>
<li>Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stem+cell-based+approach+to+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stem cell-based approach to cartilage repair.</a> Science. 336, 717-721 (2012).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-2alpha+is+a+catabolic+regulator+of+osteoarthritic+cartilage+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction.</a> Nat. Med. 16, 687-693 (2010).</li>
<li>Glasson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+active+ADAMTS5+prevents+cartilage+degradation+in+a+murine+model+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis.</a> Nature. 434, 644-648 (2005).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cart%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).</li>
<li>Chia, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+2+is+an+intrinsic+chondroprotective+agent+that+suppresses+ADAMTS-5+and+delays+cartilage+degradation+in+murine+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis.</a> Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).</li>
<li>Miller, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR2+chemokine+receptor+signaling+mediates+pain+in+experimental+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+central+role+for+complement+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a central role for complement in osteoarthritis.</a> Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).</li>
<li>He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+is+a+mediator+of+the+wound+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Progranulin is a mediator of the wound response.</a> Nat. Med. 9, 225-229 (2003).</li>
<li>Bateman, A., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+granulin+gene+family%3A+from+cancer+to+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The granulin gene family: from cancer to dementia.</a> Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+3+and+neutrophil+elastase+enhance+inflammation+in+mice+by+inactivating+antiinflammatoryprogranulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin.</a> J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).</li>
<li>Yin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exaggerated+inflammation%2C+impaired+host+defense%2C+and+neuropathology+in+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice.</a> J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).</li>
<li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin%3A+A+promising+therapeutic+target+for+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+factor+progranulin+binds+to+TNF+receptors+and+is+therapeutic+against+inflammatory+arthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice.</a> Science. 332, 478-484 (2011).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+proepithelin+to+epithelins%3A+roles+of+SLPI+and+elastase+in+host+defense+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair.</a> Cell. 111, 867-878 (2002).</li>
<li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+progranulin+cause+tau-negative+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17.</a> Nature. 442, 916-919 (2006).</li>
<li>Cruts, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutations+in+progranulin+cause+ubiquitin-positive+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17q21%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21.</a> Nature. 442, 920-924 (2006).</li>
<li>Wils, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+ageing%2C+increased+mortality+and+FTLD-TDP-associated+neuropathology+in+progranulin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice.</a> J. Pathol. , (2012).</li>
<li>Guo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulin-epithelin+precursor+binds+directly+to+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+and+inhibits+their+degradation+of+cartilage+oligomeric+matrix+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein.</a> Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+oligomeric+matrix+protein+associates+with+granulin-epithelin+precursor+%28GEP%29+and+potentiates+GEP-stimulated+chondrocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation.</a> J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).</li>
<li>Bai, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS-7%2C+a+direct+target+of+PTHrP%2C+adversely+regulates+endochondral+bone+growth+by+associating+with+and+inactivating+GEP+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulinepithelin+precursor%3A+a+bone+morphogenic+protein+2-inducible+growth+factor+that+activates+Erk1%2F2+signaling+and+JunB+transcription+factor+in+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis.</a> FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).</li>
<li>Liu, C. J., Bosch, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin%3A+A+growth+factor%2C+a+novel+TNFR+ligand+and+a+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Therap%22%5BJournal%5D)">Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target.</a> Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).</li>
<li>Wu, H., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+Resolves+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progranulin Resolves Inflammation.</a> Science. 332, 427-428 (2011).</li>
<li>Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OARSI+histopathology+initiative+-+recommendations+for+histological+assessments+of+osteoarthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cart%22%5BJournal%5D)">The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse.</a> Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).</li>
<li>Glasson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+osteoarthritis+target+validation+utilizing+genetically-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice.</a> Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).</li>
<li>Ma, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+severity+is+sex+dependent+in+a+surgical+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cart%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model.</a> Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).</li>
<li>Lin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+hedgehog+signaling+can+attenuate+the+severity+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis.</a> Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).</li>
<li>Malfait, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS-5+deficient+mice+do+not+develop+mechanical+allodynia+associated+with+osteoarthritis+following+medial+meniscal+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cart%22%5BJournal%5D)">ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization.</a> Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).</li>
</ol>

Estamos aquí declaramos que no tenemos ningún conflicto de intereses.

Se ha informado de que la cepa de ratones es muy importante para el modelo de DMM de inducción, como diferentes cepas de ratones han diversa gravedad de la OA después de DMM, con más alto nivel en la cepa 129/SvEv, seguido de C57BL6, 129/SvInJ y luego FVB / n 26. Una gran parte de los transgenes se establecen en ratones C57BL6, como PGRN-/ - ratones que usamos en el presente estudio, que son relativamente susceptibles a DMM. Sin embargo, si el transgén se basa en la cepa insensible tales como FVB / N ratones,...

La osteoartritis (OA), también conocida como artritis degenerativa, afecta al 15% de la población mundial y más de 46 millones de personas dentro de los Estados Unidos, y se caracteriza por una sinovitis, la degeneración del cartílago y formación de osteofitos 1. Puede ser el resultado de una interacción compleja de factores genéticos, metabólicos, biomecánicas y bioquímicas. Los mecanismos subyacentes de la OA continúan para evadir la comunidad científica. Actualmente existen numerosos modelos animales que pueden imitar la patogénesis de la OA 2,3. Es importante establecer modelos animales en ratones tanto por la disponibilidad de varios ratones modificados genéticamente y la rentabilidad de la experimentación. Entre los diferentes tipos de modelos experimentales de OA, la desestabilización inducida quirúrgicamente de menisco medial modelo (DMM) es un modelo bien aceptado OA-debido a su buena reproducibilidad y una progresión relativamente más lenta durante el desarrollo de la OA. Ambos atributos tienensido clave para la evaluación de la progresión de la OA en diferentes tratamientos o transgenes 3-8. Sin embargo, la consistencia de OA modelo quirúrgico se ve afectada por varios factores durante la cirugía y como resultado, la aplicación de modelo de ratón quirúrgica está limitado. Progranulina (PGRN) es un factor de crecimiento multifuncional expresado en varias células. Se sabe que PGRN desempeña un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos y patológicos tales como la cicatrización de heridas 9, la tumorigénesis 10, y la inflamación 11-15. Los estudios también muestran que la insuficiencia de PGRN puede causar enfermedades degenerativas del sistema nervioso en los seres humanos y los ratones 16-18. Se sabe que PGRN se expresa en el cartílago articular humano, y su nivel es significativamente elevado en el cartílago de pacientes con OA y la artritis reumatoide 19. Además, PGRN también juega un papel crucial en la proliferación de condrocitos 20, diferenciación y endocondralosificación del cartílago de crecimiento durante el desarrollo 21,22. Recientemente, se informó de que PGRN antagoniza el TNF-α a través de la unión a los receptores de TNF y exhibió una función anti-inflamatoria en modelos de artritis inflamatorias 13,14,23,24. Sin embargo, el papel de PGRN en la OA, especialmente in vivo, sigue siendo un enigma. Aquí, se presenta el procedimiento para inducir un modelo DMM quirúrgica, e investigar el papel de PGRN en el desarrollo de OA a través del establecimiento del modelo DMM en WT y PGRN-/ - ratones.

<table><tbody><tr><td>Nº 10 Cuchillas quirúrgicas</td><td>Feather</td><td>25-2976#10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 sutura</td><td>Applied Dental</td><td>WG-N53133</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de un modelo quirúrgicamente inducida en ratones para investigar el papel de protección de progranulina en la osteoartritis

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

La desestabilización del menisco medial modelo (DMM) es una herramienta importante para el estudio de las funciones fisiopatológicas de numerosas moléculas asociadas con artritis en la patogénesis de la osteoartritis (OA) in vivo. Sin embargo, la detallada, especialmente el protocolo visualizado para establecer este modelo complicado en ratones, no está disponible. Aquí nos aprovechamos de tipo salvaje y progranulina (PGRN) - / - ratones como ejemplos de introducir un protocolo para inducir modelo DMM en ratones, y se comparó la aparición de OA después del establecimiento de este modelo inducida quirúrgicamente. Las operaciones realizadas en los ratones eran o simulacro de operación, que acaba de abrir la cápsula articular, o la operación DMM, que cortó el ligamento menisco tibial y causó la desestabilización del menisco medial. Severidad osteoartritis se evaluó usando el ensayo histológico (por ejemplo, tinción de safranina O), las expresiones de genes asociados a la OA, la forma de degradación del cartílago moléculas de la matriz extracelular, y osteofitosción. Operación DMM indujo con éxito la iniciación y la progresión de la OA en tanto de tipo salvaje y PGRN-/ - ratones, y la pérdida de factor de crecimiento PGNR dado lugar a un fenotipo más grave en la OA este modelo inducida quirúrgicamente.

Modelo DMM se estableció con éxito en ratones, y la deficiencia de PGRN exagerado desarrollo OA inducida quirúrgicamente. Sham y DMM operaciones (Figura 1) se realizaron en WT y PGRN-/ - ratones. 8 semanas después de la operación, los ratones fueron sacrificados, y la tinción de safranina O se realizó en las secciones de las articulaciones de rodilla, seguidos por análisis estadístico de la puntuación de artritis basada en la histología. Como se muestra en <...

Se describe un protocolo para la desestabilización del menisco medial modelo (DMM) en ratones, una herramienta eficaz para la osteoartritis (OA) de la investigación. Además, hemos demostrado que la deficiencia de desarrollo progranulincan OA exagera y la progresión mediante el uso de este modelo, lo que indica que progranulina juega un papel protector en la patogénesis de la OA.

Establecimiento de un modelo quirúrgicamente inducida en ratones para investigar el papel de protección de progranulina en la osteoartritis

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un modelo de DMM en ratones y estudiar el inicio de la osteoartritis tras la cirugía de DMM. Después de preparar los animales, se realiza una incisión longitudinal medial parapatelar de un centímetro para exponer la articulación de la rodilla. A continuación, se disecciona la cápsula articular de la rodilla y se realiza una luxación medial de la rodilla.El paso final consiste en seccionar el ligamento tibial meniscal medial y suturar la rodilla. Finalmente, se utilizan análisis histopatológicos para mostrar la destrucción de la estructura articular, así como la pérdida de proteoglicanos, glucanos y la presencia de osteoartritis. La gravedad se evalúa mediante los puntajes MANKIN de las tinciones con safranina y o.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades a menos que hayan visto realizada la cirugía en ratones. La demostración visual de este método es fundamental. Dado que los pasos detallados son difíciles de aprender y actualmente se realizan bajo el microscopio, cada estructura de la articulación de la rodilla debe reconocerse con claridad.Para establecer este modelo, prepárese para la desestabilización del menisco medial o cirugía DMM anestesiando un ratón macho C57 negro seis de ocho a doce semanas de edad que pese aproximadamente 25 gramos. Luego, coloque una pomada oftálmica en los ojos tras afeitar el área alrededor de la rodilla. Esterilice el sitio con Betadine y alcohol tres veces y prepare quirúrgicamente el área.Comience la cirugía realizando un corte longitudinal medial de un centímetro por debajo de la rótula para exponer la articulación de la rodilla. Luego, corte cuidadosamente la cápsula articular longitudinalmente a través de la incisión medial por debajo de la rótula hasta exponer el fémur. A continuación, use pinzas para aflojar la estructura de la cápsula ampliando y profundizando el corte.Sujetar suavemente la parte distal de la pata trasera con una mano. Utilizar pinzas para realizar una luxación lateral de la rótula y del ligamento patelar. La luxación no debería requerir mucha fuerza si la cápsula articular ha sido seccionada longitudinalmente. Gotear solución salina estéril sobre la superficie del cartílago articular durante el resto de la cirugía para evitar que se seque.Ahora, identifique el menisco medial, que se encuentra entre el cóndilo medial del fémur y la meseta medial de la tibia. Si es necesario, retire el cojín graso que cubre el ligamento tibial del menisco para exponer el ligamento tibial del menisco, el cual conecta el lado lateral del menisco medial con la eminencia intercondílea de la tibia. Sujete suavemente la pata trasera con una mano.Realice la cirugía de DMM cortando cuidadosamente el ligamento tibial meniscal medial con una hoja quirúrgica número 10. Asegúrese de no lesionar el cartílago articular ni otros ligamentos. A continuación, cierre la cápsula de la articulación de la rodilla con seis puntos de sutura absorbible y cierre la piel con seis puntos de sutura de seda.Para minimizar el dolor posoperatorio, administre una inyección subcutánea de 10 miligramos por kilogramo de meloxicam y devuelva al ratón a su jaula después de que la anestesia haya pasado. Varias semanas después de la cirugía, sacrifique al ratón y retire ambas extremidades traseras con una hoja número 10. Luego, separe cuidadosamente la piel y los músculos de la extremidad trasera y fije la muestra en paraformaldehído al 4 % durante tres días a temperatura ambiente.Después de tres días, retire el paraformaldehído y limpie las muestras con agua destilada durante tres minutos. Posteriormente, decalcifique las muestras en EDTA a cuatro grados Celsius durante dos semanas. Después de dos semanas, deshidrate las muestras en un gradiente de etanol.Después de eliminar el etanol final, coloque las muestras en tres baños de xileno durante una hora cada uno. A continuación, incluya las muestras en un molde de parafina. Utilice un microtomo rotatorio para realizar secciones de cinco micrones y recolecte las secciones sobre un portaobjetos de vidrio.Continúe cortando secciones sagitales seriadas desde el centro del cóndilo lateral hasta el centro del cóndilo medial para realizar la tinción con safranina y o. Primero desparafine las láminas en Celine durante tres a cinco minutos. Repita el baño en Celine dos veces.Luego, hidrate los portaobjetos en un gradiente de etanol que finalice con agua destilada. A continuación, sumerja los portaobjetos en la solución de hematina férrica de Weigert, en una solución al 0,05 % de verde rápido, en una solución al 1 % de ácido acético y en una solución al 0,1 % de safranina y O. Ahora, monte los portaobjetos utilizando un medio resinoso y puntúe las preparaciones teñidas con safranina y O según la pérdida del color rojo del proteoglucano en el cartílago y según el porcentaje de destrucción de la estructura cartilaginosa.Luego, realice un análisis estadístico utilizando el sistema de puntuación histológica O-A-R-S-I. Estas imágenes muestran articulaciones de rodilla teñidas con safranina y O en ratones de tipo salvaje y ratones knockout de PG rrn ocho semanas después de una operación simulada o una cirugía de DMM. No hay degeneración evidente del cartílago en ninguno de los genotipos tras la operación simulada.Sin embargo, ocho semanas después de una operación de DMM, se observó pérdida de proteoglicanos, como lo muestra la ausencia del color rojo en el cartílago, así como destrucción de la estructura cartilaginosa, indicada por las flechas rojas, tanto en ratones de tipo silvestre como en ratones knockout de PGRN, lo que indica la inducción exitosa de un fenotipo osteoartrítico. Tras la cirugía de DMM, la comparación de los puntajes de osteoartritis entre ratones de tipo silvestre y ratones knockout de PGRN revela una puntuación significativamente más alta en los ratones knockout, lo que demuestra que la pérdida de PGRN dio lugar a un fenotipo de osteoartritis más severo.Esta técnica puede realizarse en 10 a 15 minutos si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la operación DMM en masa.

establishment-surgically-induced-model-mice-to-investigate-protective

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

La diferenciación de las células precursoras en osteoclastos está regulada por citocinas y factores de crecimiento. En este trabajo se describe una nueva técnica de transferencia génica para la diferenciación de osteoclastos in vivo y protocolos de cultivo celular para diferenciar células precursoras en osteoclastos in vitro como método para estudiar los efectos de las citocinas en la osteoclastogénesis.

A Novel In vivo Técnica de transferencia de genes y In vitro ensayos basados ​​en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos

Aunque los modelos de ratón son herramientas invaluables para la ingeniería de tejidos óseos, los modelos de defectos de huesos largos son escasos. Esta necesidad motivó el desarrollo del presente protocolo, que utiliza una placa de bloqueo con cuatro tornillos y una plantilla específica para realizar y estabilizar un defecto femoral, reproducible, de tamaño crítico y de baja morbilidad.

Establecimiento de un defecto segmentario Modelo femoral de tamaño crítico en ratones estabilizado por osteosíntesis Plate

La osteoartritis (OA) o enfermedad degenerativa de las articulaciones, es una condición debilitante asociada con el dolor que queda sólo parcialmente controlado por analgésicos disponibles. Los modelos animales se están desarrollando para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos del dolor relacionado con la OA. A continuación se describe la metodología para el modelo monoiodoacetate del dolor de la osteoartritis en el ratón.

El Modelo Monoiodoacetate del dolor de la osteoartritis en el ratón

Este protocolo describe un modelo de ratón de cirugía ortopédica que se ha utilizado para estudiar mecanismos de neuroinflamación postoperatoria y cambios de comportamiento y cuando se combina con la parabiosis, para estudiar la regeneración de los tejidos durante el envejecimiento.

Un modelo de ratón de cirugía ortopédica para el estudio de la disfunción cognitiva postoperatoria y regeneración de los tejidos

El protocolo actual establece un método riguroso y reproducible para la cuantificación de los cambios morfológicos articulares que acompañan a la osteoartritis. La aplicación de este protocolo puede ser valiosa para monitorear la progresión de la enfermedad y evaluar las intervenciones terapéuticas en la osteoartritis.

Evaluación histomorfométrica estandarizada de la osteoartritis en un modelo de ratón quirúrgico

El presente protocolo describe los arañazos controlados de microcuchilla en la superficie del cartílago articular después de desestabilizar la rodilla del ratón cortando el ligamento miniescotibial medial. Este modelo animal presenta una forma acelerada de osteoartritis (OA) adecuada para estudiar la formación de osteofitos, la osteosclerosis y el dolor en etapa temprana.

Desestabilización del menisco medial y el cartílago rasguño modelo murino de osteoartritis acelerada

Este protocolo presenta un método económico y eficiente para la evaluación cuantitativa de la microarquitectura ósea en un modelo murino de osteoporosis mediante la combinación de técnicas de tinción de hematoxilina-eosina (HE) y microtomografía computarizada (Micro-CT).

Evaluación de la microarquitectura ósea trabecular en un modelo murino de osteoporosis

Aquí, presentamos un protocolo que establece un modelo de ratón con artritis reumatoide (AR) a través de la transferencia adoptiva de células T CD4+ de ratones SKG, proporcionando una herramienta experimental rápida y confiable para investigar los mecanismos inmunológicos, la progresión patológica y el desarrollo de nuevos tratamientos para la AR.

Un modelo adoptivo de transferencia de artritis reumatoide en ratones

En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Monocapas auto-ensambladas (SAMs) formado por largas cadenas de alcanos tioles en oro proporcionan sustratos bien definidos para la formación de los patrones de proteínas y el confinamiento de la célula. Impresión por microcontacto de hexadecanethiol con un polidimetilsiloxano (PDMS) sello seguido por el relleno con un glicol terminada alcano tiol monómero produce un patrón en el que las proteínas y las células de absorber sólo a la región hexadecanethiol sellado.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Aprende a establecer el modelo DMM en ratones para investigar la osteoartritis mediante análisis histopatológicos y puntuaciones MANKIN. Este método permite evaluar el papel protector de la progranulina en la progresión de la enfermedad articular.

Establecimiento de un modelo quirúrgicamente inducida en ratones para investigar el papel de protección de progranulina en la osteoartritis (Video) | JoVE Journal

Establecimiento de un modelo quirúrgicamente inducida en ratones para investigar el papel de protección de progranulina en la osteoartritis

Explorar más videos