Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el grado de organización de los miofibrillas en larvas translúcidas de pez cebra y cuantificar la distancia que nadan en respuesta a una estimulación táctil, para ambos métodos. Esto se logra primero mediante el apareamiento de los peces cebra y luego recolectando huevos viables en el segundo paso del ensayo para evaluar la estructura muscular. Un embrión de pez cebra anestesiado y recubierto se coloca directamente entre dos lentes polarizadores sobre la platina de un microscopio estereoscópico, de modo que el pez quede orientado a lo largo del eje lateral de su cuerpo y en una posición lo más plana posible.

La birrefringencia se visualiza entonces y se cuantifica la integridad muscular. En el segundo paso del ensayo de escape evocado por tacto, se coloca una larva recubierta individual en una placa de Petri profunda y luego se centra en el campo de visión del microscopio estereoscópico. Se aplica un estímulo sensorial leve a las larvas tocando la cola con una aguja para insectos, y se registra la reacción del animal hasta que el embrión deja de nadar o nada fuera del campo de visión.

En última instancia, se pueden cuantificar las diferencias en la organización muscular y las respuestas locomotoras. Las principales ventajas de estas técnicas no invasivas son que se puede analizar un gran número de peces rápidamente, y que los defectos del músculo esquelético en el mismo pez se pueden monitorear in vivo durante varios días. Las demostraciones visuales del montaje de lentes polarizadores y del posicionamiento de las larvas en la orientación adecuada son fundamentales para garantizar el éxito.

Con estos ensayos, elimine los huevos no viables de todas las posturas recolectadas de los peces adultos apareados. Estos generalmente aparecen blancos y opacos a simple vista, o como un grupo de células oscuras desorganizadas al microscopio; devuelva los embriones al incubador para continuar su desarrollo entre tres y siete días después de la fertilización. Si el embrión de interés permanece dentro de su corión, use un par de pinzas finas para hacer cuidadosamente un desgarro en el corión del embrión de interés y luego inviértalo para que el embrión caiga hacia afuera.

Anestesie los embriones recubiertos con trica para facilitar su correcta posición y luego coloque en un microscopio estereoscópico una lente polarizadora que pueda rotarse para ajustar el ángulo de la luz polarizada. Una vez que los embriones se hayan enderezado, coloque una segunda lente polarizadora sobre la platina del microscopio directamente debajo de la lente superior y sitúe los embriones directamente encima de la segunda lente. Cada embrión de interés debe colocarse entonces a lo largo del eje lateral de su cuerpo.

Gire la lente superior con el embrión de interés en vista hasta que el eje de polarización de las dos lentes esté orientado a 90 grados uno respecto al otro y el fondo esté completamente oscuro. Mueva el pez para asegurarse de que estén colocados lo más planos posible. Si un pez está curvado, solo los segmentos con orientación plana permitirán el paso de la luz polarizada y exhibirán frt.

Ahora, observe el fenotipo de birrefringencia de los peces de tipo silvestre. Los músculos esqueléticos altamente organizados muestran una intensa birrefringencia, ya que el índice de refracción para la luz paralela a los filamentos miofibrilares es mayor que el de la luz polarizada perpendicular a estas estructuras. Los peces con músculo esquelético desorganizado, lo que sugiere una miopatía neurodegenerativa o un defecto del desarrollo, muestran típicamente una reducción general de la birrefringencia en los peces con músculo esquelético desorganizado.

Característico de la distrofia muscular. Suelen presentar un patrón en parches de birrefringencia, con áreas oscuras que representan degeneración muscular entre áreas brillantes de arquitectura muscular normal. Recolecte imágenes del pez bajo luz polarizada para la cuantificación de la birrefringencia.

Guarde las imágenes como archivos tiff. Abra las imágenes de birrefringencia en un programa de procesamiento de imágenes. Si utiliza ImageJ, como se muestra aquí para cada imagen, primero use la herramienta de selección poligonal para trazar una línea alrededor del cuerpo del pez y definir el área del músculo de pez cebra para la medición.

Luego, en el menú desplegable Analizar, elija Configurar mediciones para seleccionar las estadísticas requeridas para la imagen. Marque las casillas de Área, Valor medio de escala de grises y Valores mínimo y máximo de escala de grises para configurar el ensayo de comportamiento de escape evocado por tacto entre dos y siete días posteriores a la fertilización. Coloque individualmente los peces recubiertos de interés en placas de Petri profundas, trabajando con un solo embrión a la vez.

Coloque el pez en el centro del campo de visión de un microscopio estereoscópico equipado con un sistema de cámara digital e inicie la adquisición de imágenes secuenciales utilizando tasas de fotogramas mayores o iguales a 30 hercios. Luego, utilizando una aguja para insectos, toque la cola del embrión para aplicar el estímulo sensorial mecánico, deteniendo la adquisición de imágenes cuando el embrión haya dejado de nadar o haya salido del campo de visión. Finalmente, convierta las imágenes secuenciales en un archivo de video o analice los fotogramas individuales de las imágenes de lapso de tiempo.

La birrefringencia fuera de línea puede utilizarse como un ensayo no invasivo eficiente para obtener información sobre el estado de la organización de los miofibrillas en embriones de pez cebra vivos. Los peces cebra de tipo silvestre a los cinco días posteriores a la fertilización muestran músculos esqueléticos altamente organizados bajo luz polarizada debido a su disposición ordenada de miofilamentos. En contraste, embriones de la misma edad homocigotos para una mutación patógena en el gen de distroglicano o DAG1 presentan birrefringencia irregular, indicativa de áreas de degeneración muscular. Este patrón irregular y la rápida progresión de la degeneración muscular durante el desarrollo temprano son consistentes con otros modelos de peces distroficos.

La cuantificación de la birrefringencia a los cinco días posteriores a la fecundación en mutantes distroficos DAG1 identifica una reducción significativa del brillo hasta el 27,9 ± 5,3 % de la birrefringencia máxima observada en sus hermanos de tipo salvaje. Esta reducción es más severa que la disminución hasta el 52,4 ± 5,5 % observada a los tres días posteriores a la fecundación en modelos de peces con fenotipo miopático inducidos por morfina contra mtm1. En cambio, los modelos de peces miopáticos tienden a mostrar una reducción general de la birrefringencia en comparación con el tipo salvaje, ya que frecuentemente existe desorganización de los miofibrillas en los músculos esqueléticos axiales principales, pero sin evidencia de cambios degenerativos. Los comportamientos de escape inducidos por estímulos táctiles pueden utilizarse para demostrar que los modelos de pez cebra de enfermedades del músculo esquelético presentan defectos locomotores y dificultades para nadar.

Este primer video muestra un ensayo del comportamiento de escape evocado por el tacto en peces cebra de tipo silvestre. Observe cómo, a los cinco días posteriores a la fertilización, las crías normales nadan rápidamente lejos. En respuesta al tacto en este segundo video, se capturó el comportamiento de escape evocado por el tacto en una cría del día uno.

Observe cómo los embriones mutantes cinco días después de la fertilización presentan una respuesta deficiente al tacto y no logran salir del campo de visión tras la estimulación. Luego, los videos se analizaron cuadro por cuadro para confirmar que los mutantes DAG uno muestran un movimiento alterado en comparación con los controles de tipo salvaje en respuesta a estímulos táctiles. Las distancias que ambos tipos de embriones pudieron moverse dentro de un intervalo de tiempo fijo se promediaron e indican una función motora disminuida en los mutantes DAG uno.

Una vez dominadas, estas técnicas pueden realizarse en grandes cantidades de peces en un corto período, lo cual es fundamental al realizar cribados químicos o de mutagénesis de alto rendimiento. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar enfoques más invasivos, como inmunohistoquímica o microscopía electrónica, para investigar defectos en el músculo esquelético a niveles moleculares y estructurales.