Name: Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a evaluar la organización miofibrilar y la respuesta locomotora en larvas de Danio rerio mediante ensayos de birrefringencia y escape táctil. Estas técnicas no invasivas permiten analizar defectos musculares esqueléticos in vivo.

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Agradecemos a Behzad Moghadaszadeh por su maravillosa ayuda con la cuantificación de imágenes de birrefringencia. Este trabajo fue financiado por la Asociación de Distrofia Muscular de EE. UU. (MDA201302) y el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel (R01 AR044345), así como por el generoso apoyo de A Foundation Building Strength, Cure CMD y AUism Charitable Foundation. VAG cuenta con el apoyo de K01 AR062601 del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel, y LLS cuenta con el apoyo de F31 NS081928 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares.

1. Análisis in vivo de la estructura del músculo esquelético por birrefringencia
<ol>
	<li>Prepare jaulas de apareamiento que separen a los machos de las hembras de la línea de pez cebra deseada a última hora de la tarde después de alimentarse.
	<ol>
		<li>Distinga a las hembras por su vientre más grande y su ligera coloración azul/blanca, y a los machos por su forma corporal esbelta y sus tonos rosados/amarillos.</li>
		<li>El éxito con los cruces por parejas (un macho y una hembra) puede ser solo del 50%. Para una mayor tasa de éxito, aparee un macho con 2-3 hembras.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Retire los divisores de la jaula a la mañana siguiente, poco después del inicio de la luz, y permita que los peces desoven sin ser molestados.</li>
	<li>Recoja los huevos con un colador cuando se haya puesto un número suficiente de huevos fertilizados en el fondo del tanque.</li>
	<li>Transfiera los embriones a una placa de Petri profunda enjuagando el colador con agua de pescado y devuelva los peces padres a sus tanques. Coloque las placas de embriones en una incubadora a 28,5 °C.</li>
	<li>Limpie los huevos inviables y los desechos más tarde ese día o a la mañana siguiente, y devuelva los embriones a la incubadora para que sigan creciendo.</li>
	<li>Los embriones/larvas alcanzan la edad adecuada para observar birrefringencia a los 3-7 días después de la fertilización (dpf), ya que los resultados anteriores a 3 dpf pueden sufrir un contraste limitado. Los embriones de tipo salvaje eclosionan de sus coriones entre 48 y 60 horas después de la fertilización (hpf), seguida de un enderezamiento del eje del cuerpo. Los embriones de tipo salvaje o mutantes de eclosión tardía pueden requerir decorionación manual.
	<ol>
		<li>Haz suavemente un desgarro en el corion con pinzas afiladas y gíralo boca abajo para que el embrión se caiga.</li>
		<li>Permita que los embriones decorionados se enderezen antes de comenzar el ensayo.</li>
		<li>Anestesiar el/los embrión/es con tricaína (0,04% en agua de pescado) para ayudar en su correcta posición.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque un microscopio de disección con una lente polarizada que se pueda girar para ajustar el ángulo de la luz polarizada (Figura 1A).</li>
	<li>Coloque los embriones anestesiados y decorionados directamente encima de una segunda lente polarizada a lo largo del eje lateral del cuerpo. La segunda lente debe colocarse debajo de la lente superior, en la platina del microscopio (Figura 1B). No utilice placas de Petri de plástico en ningún momento durante el ensayo de birrefringencia, ya que el plástico no es un medio adecuado para la transmisión de luz refractada.</li>
	<li>Gire la lente superior con el embrión de interés a la vista hasta que los ejes de polarización de las dos lentes estén orientados a 90° entre sí y el fondo esté completamente oscuro.</li>
	<li>El resultado óptimo del ensayo depende de la orientación de los peces entre dos lentes polarizadas. Mueve los peces para asegurarte de que estén acostados lo más planos posible.
	<ol>
		<li>Si el pez es curvo, solo los segmentos con esta orientación plana pasarán la luz polarizada y exhibirán birrefringencia. En tales casos, mida la birrefringencia en las áreas planas y registre la birrefringencia del área correspondiente en los peces de tipo salvaje (por ejemplo, somitas 1-10 tanto en peces de tipo salvaje como mutantes).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Observa el fenotipo birrefringente de los peces.
	<ol>
		<li>Los peces de tipo salvaje con músculo esquelético altamente organizado muestran birrefringencia brillante, ya que el índice de refracción de la luz paralela a los miofilamentos es mayor que la luz polarizada perpendicular a estas estructuras.</li>
		<li>Los peces con músculo esquelético desorganizado que sugiere una miopatía no degenerativa o un defecto del desarrollo suelen mostrar una reducción general de la birrefringencia.</li>
		<li>Los peces con músculo esquelético desorganizado característico de una distrofia muscular comúnmente exhiben un patrón de birrefringencia en forma de parche, con áreas oscuras que representan la degeneración muscular entre áreas brillantes de arquitectura muscular normal.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cuantifique la birrefringencia tomando imágenes de peces de tipo salvaje y mutantes bajo luz polarizada con los mismos ajustes de exposición y aumento. Guarde las imágenes como archivos .tiff.
	<ol>
		<li>Abra imágenes de birrefringencia en el software ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
		<li>Para cada imagen, seleccione el área del músculo del pez cebra dibujando una línea alrededor del cuerpo usando la opción "Selecciones de polígonos" de la barra de herramientas.</li>
		<li>Utilice "Establecer mediciones" en el menú desplegable "Analizar" para seleccionar las estadísticas necesarias para la imagen.
		<ol>
			<li>La selección mínima requiere que las casillas "Área", "Valor medio de grises" y "Valor de gris mínimo y máximo" estén marcadas.</li>
			<li>Un valor de gris máximo de >255 indicará saturación de píxeles. Por lo tanto, utilice imágenes con valores máximos de gris inferiores a 255.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Normalice la intensidad media con el área seleccionada y repita este mismo procedimiento de cuantificación para cada imagen birrefringencia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ensayo de Comportamiento de Escape Evocado por el Tacto
<ol>
	<li>Establezca parejas de apareamiento de la(s) línea(s) de pez cebra apropiada(s) y recoja los embriones como se describe anteriormente en los pasos 1.1-1.5.</li>
	<li>A los 2-7 días después de la fertilización, coloque los embriones/larvas decorionados individualmente en una placa de Petri profunda o en las cámaras de placas de pocillos múltiples.</li>
	<li>Trabajando con un solo embrión a la vez, centre el embrión en el campo de visión de un microscopio estereoscópico Nikon SMZ1500 con un sistema de cámara digital SPOT RT3 o similar, y comience la obtención de imágenes secuenciales.
	<ol>
		<li>Se debe utilizar la misma frecuencia de obtención de imágenes tanto para los peces de tipo salvaje como para los mutantes. Se recomiendan velocidades de fotogramas de >30 Hz, ya que las velocidades más lentas generalmente no serán suficientes para capturar la natación rápida de los peces de tipo salvaje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Administra estímulos mecanosensoriales al embrión tocando la cola con un alfiler de insecto.</li>
	<li>Detener la toma de imágenes cuando el embrión ha dejado de nadar o ha nadado fuera del campo de visión.</li>
	<li>Convierta imágenes secuenciales en un archivo de vídeo, o analice fotogramas individuales de imágenes time-lapse fuera de línea, utilizando el software SPOT 5.1 Advanced. Paquetes de software similares incluyen Open Lab, NIS Elements, o ImageJ disponible gratuitamente (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" title="">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
	<li>Cuantificar el comportamiento de natación realizando la respuesta de tacto evocado en múltiples embriones.
	<ol>
		<li>Esto se puede lograr promediando la distancia que los embriones pueden nadar dentro de un intervalo de tiempo fijo utilizando un software o una regla métrica para marcar los puntos de inicio y final de la sesión de natación.</li>
		<li>Evite que los embriones se habitúen al estímulo táctil con el tiempo realizando el ensayo con un nuevo embrión para cada repetición experimental. Los comportamientos en modelos mutantes confiables y de tipo salvaje tienden a ser altamente reproducibles.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
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<li>Granato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+controlling+and+mediating+locomotion+behavior+of+the+zebrafish+embryo+and+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva.</a> Development. 123, 399-413 (1996).</li>
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<li>Low, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+is+required+within+zebrafish+sensory+neurons+for+the+activation+of+touch-evoked+escape+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors.</a> J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+identified+motoneurones+and+co-ordination+of+primary+and+secondary+motor+systems+during+zebrafish+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming.</a> J. Physiol. 403, 73-89 (1988).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Los trastornos neuromusculares primarios se clasifican tradicionalmente como procesos distróficos o no distróficos. Las distrofias musculares se caracterizan por la degeneración de las miofibras seguida de rondas repetidas de regeneración, lo que finalmente conduce a un proceso en etapa final tipificado por fibrosis y reemplazo por tejido adiposo14. Las miopatías no distróficas, por el contrario, no se asocian con necrosis o cambios regenerativos, pero dan como resultado miofibras desorganizadas y debilidad ge...

<table><tbody><tr><td>Tricaine </td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fischer Scientific</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fischer Scientific</td><td>100189-588</td><td></td></tr><tr><td>Alfiler de insectos</td><td>Fischer Scientific</td><td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>Lentes polarizadas</td><td>Ritz Camera</td><td>Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Fischer Microscopio científico</td><td>Isotemp Incubadora modelo 630D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos de diagnóstico</td> <td>de cámara</td> Inc.<td>SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen</td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td><td>SPOT 5.1 Avanzado</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en una herramienta particularmente eficaz para modelar enfermedades humanas que afectan al músculo esquelético, incluyendo distrofias musculares1-3, miopatías congénitas4,5 e interrupciones en el ensamblaje sarcomérico6,7, debido a la alta conservación genómica y estructural con mamíferos8. La desorganización muscular y el deterioro locomotor se pueden evaluar rápidamente en el pez cebra durante los primeros días después de la fertilización. Dos ensayos para ayudar a caracterizar los defectos del músculo esquelético en el pez cebra son la birrefringencia (estructural) y la respuesta de escape evocada por el tacto (conductual).
La birrefringencia es una propiedad física en la que la luz gira a medida que pasa a través de la materia ordenada, como la matriz pseudocristalina de los sarcómeros musculares9. Es un enfoque simple y no invasivo para evaluar la integridad muscular en larvas de pez cebra translúcidas en las primeras etapas del desarrollo. Los peces cebra de tipo salvaje con músculo esquelético altamente organizado parecen muy brillantes en medio de un fondo oscuro cuando se visualizan entre dos filtros de luz polarizados, mientras que los mutantes musculares tienen patrones de birrefringencia específicos para el trastorno muscular primario que modelan. Las distrofias musculares modeladoras del pez cebra, enfermedades caracterizadas por la degeneración de las miofibras seguida de rondas repetidas de regeneración, exhiben manchas oscuras degenerativas en el músculo esquelético bajo luz polarizada. Las miopatías no distróficas no se asocian con necrosis o cambios regenerativos, pero dan lugar a miofibras desorganizadas y debilidad del músculo esquelético. El pez cebra miopático suele mostrar una reducción general de la birrefringencia, lo que refleja la desorganización de los sarcómeros.
El ensayo de escape evocado por el tacto consiste en observar el comportamiento de natación de un embrión en respuesta a la estimulación táctil10-12. En comparación con las larvas de tipo salvaje, las larvas mutantes muestran con frecuencia una contracción de escape débil, seguida de una natación lenta u otro tipo de movimiento deteriorado que no logra impulsar a las larvas más queuna distancia corta. La ventaja de estos ensayos es que la progresión de la enfermedad en el mismo tipo de pez se puede monitorear in vivo durante varios días, y que se puede analizar un gran número de peces en poco tiempo en relación con los vertebrados superiores.

La birrefringencia puede utilizarse como un ensayo eficiente y no invasivo para esclarecer el estado de la organización de los miofibrilos en embriones vivos de pez cebra. Se presentan ejemplos de peces cebra silvestres, así como de peces cebra con expresión reducida de genes esenciales para el desarrollo y la función del músculo esquelético. Los peces cebra silvestres a los 5 dpf muestran músculos esqueléticos altamente birrefringentes bajo luz polarizada debido al arreglo ordenado de los miofilamentos (Figuras ...

El pez cebra es ahora una herramienta establecida y poderosa para modelar distrofias musculares, miopatías congénitas y enfermedades neuromusculares relacionadas. La birrefringencia y el comportamiento de escape evocado por el tacto son dos ensayos no invasivos comunes que se utilizan para determinar el grado de desorganización muscular y deterioro locomotor de los embriones de pez cebra durante el desarrollo temprano.

Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el grado de organización de los miofibrillas en larvas translúcidas de pez cebra y cuantificar la distancia que nadan en respuesta a una estimulación táctil, para ambos métodos. Esto se logra primero mediante el apareamiento de los peces cebra y luego recolectando huevos viables en el segundo paso del ensayo para evaluar la estructura muscular. Un embrión de pez cebra anestesiado y recubierto se coloca directamente entre dos lentes polarizadores sobre la platina de un microscopio estereoscópico, de modo que el pez quede orientado a lo largo del eje lateral de su cuerpo y en una posición lo más plana posible.La birrefringencia se visualiza entonces y se cuantifica la integridad muscular. En el segundo paso del ensayo de escape evocado por tacto, se coloca una larva recubierta individual en una placa de Petri profunda y luego se centra en el campo de visión del microscopio estereoscópico. Se aplica un estímulo sensorial leve a las larvas tocando la cola con una aguja para insectos, y se registra la reacción del animal hasta que el embrión deja de nadar o nada fuera del campo de visión.En última instancia, se pueden cuantificar las

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Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape provocada por el tacto

Este video describe el ensayo de respuesta de evocación al tacto, que mide la respuesta de la larva de pez cebra a los estímulos táctiles.

Ensayo de respuesta de escape: un método para estudiar la respuesta de la larva de pez cebra a los estímulos táctiles

El video describe el ensayo de evitación y tigmotaxis de las larvas de pez cebra. El video examina el comportamiento de las larvas de pez cebra en respuesta a estímulos aversivos visuales.

Ensayo de evitación y tigmotaxis del pez cebra: un método de alto rendimiento para examinar el comportamiento de las larvas en respuesta a estímulos visuales aversivos

El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

Mediciones de fuerza se pueden utilizar para demostrar los cambios en la función muscular debido al desarrollo, lesión, enfermedad, tratamiento o toxicidad química. En este vídeo, se demuestra un método para medir la fuerza durante una contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra.

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

Presentamos un método para el análisis electrorretinográfico (ERG) de larvas de pez cebra utilizando técnicas de micromanipulación y electrorretinografía. Este es un método simple y directo para analizar la función visual de las larvas de pez cebra in vivo.

Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

En este estudio, describimos un método sencillo para realizar el análisis de Evans Blue Dye (EBD) en larvas de pez cebra.  Esta técnica es una herramienta poderosa para la caracterización de la integridad del músculo esquelético y la delineación de modelos de distrofia muscular de pez cebra, y es un método valioso para el desarrollo de nuevas terapias.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

peces cebra son un excelente modelo para estudiar la función muscular y las enfermedades. Durante la embriogénesis temprana, el pez cebra comienza a realizar contracciones musculares regulares produciendo un comportamiento rítmico de natación, que se altera cuando el músculo se interrumpe. Aquí describimos una respuesta evocada por el tacto y un ensayo de locomoción para examinar el rendimiento de la natación como una medida de la función muscular.

Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y la caracterización de un modelo de epilepsia de pez cebra resultante de la inhibición transitoria del gen DEPDC5.

Análisis conductual y fisiológico en un modelo de epilepsia de pez cebra

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

Un método nuevo y versátil para la observación de la microcirculación se presenta. Se considera adecuado para observación a largo plazo, y para la combinación con intervenciones biológicas pharmacophysiological o molecular.

En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

Aprende a evaluar la organización miofibrilar y la respuesta locomotora en larvas de Danio rerio mediante ensayos de birrefringencia y escape táctil. Estas técnicas no invasivas permiten analizar defectos musculares esqueléticos in vivo.

Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil (Video) | JoVE Journal

Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

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