Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO 2 Sustratos
7 de marzo de 2014
Este protocolo describe un método compatible con la microfabricación de patrón de células en SiO2. Un diseño parileno-C predefinido se fotolitográficamente impreso en SiO 2 obleas. Después de la incubación las células con suero (u otra solución de activación) se adhieren específicamente a (y crecen de acuerdo con la conformidad de) subyacente de parileno-C, mientras que siendo repelido por SiO 2 regiones.
El objetivo general de este procedimiento es modelar las células en los servicios de dióxido de silicio de acuerdo con un diseño subyacente predefinido de paralina. Esto se logra creando primero una máscara fotográfica del patrón deseado. El segundo paso es oxidar y luego recubrir una oblea de silicio con paralina.
A continuación, los procesos fotolitográficos realizados en una instalación de sala limpia de microelectrónica se utilizan para grabar selectivamente el recubrimiento de paralina para revelar el diseño deseado. El paso final es activar los chips utilizando primero ácido de piraña y luego incubar en suero de ternera fetal durante tres a 12 horas, después de lo cual se puede aplicar una suspensión celular para el cultivo. En última instancia, el patrón celular se puede evaluar mediante imágenes de células vivas con un microscopio de disección o después de la fijación con microscopía de fluorescencia confocal.
La principal ventaja de esta técnica sobre varias plataformas de modelado celular existentes es que no es necesario llevar agentes biológicos a la sala limpia. Además, los chips de patrones se pueden mantener indefinidamente hasta que se activen primero con ácido par y luego suero. Para diseñar la configuración deseada de la paralínea C, utilice un paquete de software de edición de diseño que sea capaz de leer, escribir archivos CIF o GDS dos.
Subcontrate al fabricante de mascarillas fotográficas a una instalación de microelectrónica adecuada o fárquela internamente. Si existen instalaciones, oxide una oblea de silicio en un horno horizontal atmosférico a 950 grados Celsius durante 40 minutos para producir una capa de dióxido de silicio de 200 nanómetros. Después de eso, confirme el grosor con un pequeño punto.
Reflectómetro espectroscópico. Coloque las obleas en el sistema de deposición al vacío, aplique un promotor de adhesión sinusoidal en el interior de la tapa de la cámara. Durante el ciclo de bombeo, el promotor de adhesión sinusoidal recubre la paralina de carga de oblea oxidada en la paralina C del depósito del horno a temperatura ambiente a una tasa de 1,3 nanómetros por miligramo de dímero utilizando un sistema de deposición al vacío.
Después de eso, deposite el promotor de adhesión HMDS en la oblea recubierta de paralina. Utilizando un sistema de recubrimiento fotorresistente adecuado, gire la oblea a 4.000 RPM durante 30 segundos mientras aplica fotorresistencia positiva para obtener un espesor de una micra utilizando el sistema de recubrimiento fotorresistente, luego hornee suavemente la oblea durante 60 segundos a 90 grados centígrados. Ahora inserte tanto la oblea como la fotomascarilla prefabricada en un alineador de mascarillas.
Exponga la oblea recubierta de fotorresistencia con luz ultravioleta para transferir el patrón deseado a la fotorresistencia. Luego, hornee la oblea expuesta durante 60 segundos a 110 grados centígrados. A continuación, elimine toda la fotorresistencia expuesta de la oblea revelándola en una solución de revelador adecuada en la paralínea no protegida mediante el uso de un sistema de grabado con plasma de oxígeno para revelar el dióxido de silicio subyacente.
Luego, guarde las papas fritas después de cortarlas en cubitos en cajas sin polvo hasta que las necesite. En este procedimiento, elimine la fotorresistencia residual de las virutas lavando una acetona durante 10 segundos. Luego enjuáguelos en H2O destilado desionizado tres veces, haga el ácido de piraña fresco en una campana de humo ácido después, limpie y grabe las virutas por inmersión en ácido piana durante 10 minutos.
A continuación, enjuague las virutas tres veces en H2O desionizado y transfiéralas a una placa de cultivo estéril en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar. Active los chips para el patrón de celdas colocando dos chips por pocillo en una placa de seis pocillos. A continuación, agregue dos mililitros de suero fetal bovino para sumergir completamente todas las papas fritas.
Incubar las patatas fritas en suero durante tres a 12 horas a 37 grados centígrados. Ahora retire los chips de su solución de activación. Lávese una vez durante 10 segundos en la solución salina equilibrada de Hank.
A continuación, coloque las virutas en un pocillo de cultivo y coloque el tipo de célula elegido como suspensión en su medio de crecimiento habitual. La densidad óptima de recubrimiento de celdas depende tanto del tipo de celda como del patrón geométrico de la paralina C en el chip. Una densidad de cinco por 10 a la cuarta celda por mililitro es un punto de partida sensato.
Las imágenes se adaptan a la motivación subyacente para el patrón de las células, pero el comportamiento de las células vivas se puede evaluar fácilmente utilizando un microscopio de disección y una cámara digital con una lente de relé adecuada. Aquí está la imagen de células vivas de HEC 2 93 células cultivadas en dióxido de silicio de paralina C después de tres días. In vitro, los barcos habían sido incubados durante tres horas en suero fetal bovino, y las células se sembraron en suspensión a una concentración de cinco veces 10 a la cuarta células por mililitro.
La paralina C promueve la adhesión celular, mientras que el dióxido de silicio desnudo repele las células. Esta figura muestra las imágenes de inmunofluorescencia de células madre derivadas de glioma humano primario cultivadas en varios patrones de paralina C en dióxido de silicio. Aquí, el esquema ilustra el diseño de la paralina reticular, la micrografía de fluorescencia de las células fijas teñidas para la proteína ácida fibrilar glial y la micrografía óptica de las células vivas en el mismo chip.
Aquí hay una imagen fluorescente que ilustra las células teñidas con GFAP en un diseño de paralínea diferente y la imagen de reflectancia del nodo en un diseño de paralínea radial. Y esta figura muestra las imágenes de células vivas de tres células T, tres L y una cultivadas en dióxido de silicio paralina C. Después de cuatro días in vitro, los chips se activaron durante tres horas en suero fetal bovino, y las células se sembraron en suspensión a una concentración de cinco veces 10 de las cuartas células por mililitro.
En este caso, la plataforma no permite la creación de patrones con células que se vuelven igualmente confluentes en las regiones de Lene C y dióxido de silicio. Al realizar este protocolo, es importante recordar que la activación del suero debe ocurrir inmediatamente después del tratamiento con piraña. De lo contrario, se socavará el proceso de creación de patrones.
No olvides que trabajar con ácido de piraña puede ser extremadamente peligroso. Prepare y use ácido de piraña en una campana de gases químicos y asegúrese de usar gafas, batas de laboratorio y guantes adecuados.
Descripción general
Este protocolo describe un método para el patrón celular sobre dióxido de silicio (SiO2) utilizando parylene-C. Las células se adhieren a las regiones de parylene-C mientras son repelidas por el SiO2, lo que permite patrones de crecimiento controlados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Patronado celular
- Microfabricación
- Aplicaciones en neurociencia
Antecedentes
- El patrón celular es fundamental para estudiar el comportamiento celular.
- El parylene-C sirve como sustrato para la adhesión celular.
- El dióxido de silicio se utiliza por sus propiedades repulsivas frente a las células.
- Este método evita la contaminación por agentes biológicos en salas limpias.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para el patrón de células sobre SiO2.
- Mejorar la comprensión del comportamiento celular en entornos con patrones definidos.
- Proporcionar un protocolo que minimice los riesgos de contaminación.
Métodos Utilizados
- Creación de una máscara fotográfica para el patrón deseado de parylene-C.
- Oxidación y recubrimiento de obleas de silicio con parylene-C.
- Grabado fotolitográfico para revelar el patrón.
- Activación de los chips utilizando ácido piraña y suero de ternera fetal.
Resultados principales
- Las células se patronizaron con éxito según el diseño de parylene-C.
- El imagenado de células vivas demostró el comportamiento celular sobre las superficies patrón.
- La inmunofluorescencia confirmó los patrones de adhesión y crecimiento celular.
- El método permite el almacenamiento indefinido de los chips patrón antes de su activación.
Conclusiones
- Esta técnica ofrece un enfoque robusto para el trazado de patrones celulares.
- Simplifica el proceso al eliminar la necesidad de agentes biológicos en salas limpias.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir diversos tipos y patrones de células para la investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de patrones celulares compatible con la microfabricación permite un control espacial preciso de la adhesión celular sobre sustratos basados en silicio, apoyando el desarrollo de modelos in vitro reproducibles para la investigación en neurociencia y enfermedades. Al integrarse con procesos estándar de semiconductores, facilita la creación de plataformas escalables compatibles con matrices de electrodos múltiples y sistemas tipo laboratorio-en-un-chip. El enfoque reduce el riesgo de contaminación en ambientes de sala blanca y permite el almacenamiento indefinido de chips con patrones antes de su activación, mejorando la flexibilidad del flujo de trabajo en entornos de investigación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la organización espacial precisa de redes neuronales o gliales para estudiar interacciones específicas de las vías.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de dianas al aislar las respuestas celulares en microentornos definidos, reduciendo variables de confusión en los cribados fenotípicos.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en los datos de interacción con la diana al permitir ensayos de co-cultivo controlado o de límites repulsivos que imitan la arquitectura tisular.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Produce sustratos estandarizados y compatibles con microfabricación, adecuados para imágenes de alto contenido y lecturas electrofisiológicas en flujos de trabajo integrados con MEA.
- Reproducibilidad: Ofrece fidelidad de patrón a nivel micrométrico mediante fotolitografía, asegurando una posición celular consistente entre réplicas para cribados fiables de compuestos.
- Escalabilidad: Permite la fabricación por lotes y el almacenamiento indefinido de chips, posibilitando la implementación de ensayos bajo demanda sin necesidad de procesos repetidos en sala blanca.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Modelado de enfermedades: Apoya la exploración de la fisiología celular en sistemas neurocientíficamente relevantes, incluyendo células madre similares a las derivadas de glioma humano primario y neuronas hipocampales murinas.
- Continuidad traslacional: Permite avanzar desde la selección fenotípica en fase de descubrimiento hasta la validación preclínica utilizando plataformas de sustrato consistentes.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Clarifica el papel de las moléculas de adhesión específicas de la célula en los resultados de patrón, orientando la selección de dianas basada en la relevancia biológica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta el desarrollo de ensayos y la modelización preclínica, especialmente para blancos relacionados con neuroterapéuticos y oncología, donde la organización espacial celular informa sobre la función.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al permitir diseños de co-cultivo controlado o de límites repulsivos para aclarar la comunicación celular y la modulación de vías.
- Selección: Proporciona sustratos listos para ensayos con resultados cuantitativos mediante imágenes de células vivas o inmunofluorescencia, facilitando la comparación de los efectos de compuestos en condiciones con patrones definidos.
- Análisis: Genera lecturas con resolución espacial (por ejemplo, tinción de GFAP, métricas de confluencia) que permiten la comparación estadística del comportamiento celular en microentornos definidos.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante el uso de tipos celulares relevantes para enfermedades (por ejemplo, células madre similares a gliomas humanos) y patrones que imitan la arquitectura del tejido.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad de microfabricación reutilizable, en lugar de un protocolo de un solo uso, compatible con procesos estándar de obleas e infraestructura de sala blanca.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en las respuestas celulares mediante sistemas de cultivo definidos espacialmente.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad gracias a la precisión fotolitográfica y a la activación basada en suero, independiente de la introducción biológica en sala limpia.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción (go/no-go) al permitir la eliminación temprana de riesgos en dianas basándose en su comportamiento en contextos espaciales fisiológicamente relevantes.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar datos procedentes de modelos que reflejan mejor la organización a nivel tisular y la heterogeneidad celular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microfabricación, fotolitografía y sistemas de deposición al vacío para el recubrimiento y el patrón de parylene-C.
- Depende del acceso a instalaciones de sala blanca, alineadores de máscaras, grabadoras de plasma de oxígeno y reflectómetros espectroscópicos para el control del proceso.
- Necesita protocolos estandarizados de activación (ácido piraña seguido de incubación con suero) para garantizar resultados consistentes de patrones entre lotes.
- Requiere adaptar la densidad de siembra celular y los tiempos de incubación según las propiedades de adhesión específicas de cada tipo celular y la geometría del patrón.
- Presenta una universalidad limitada entre tipos celulares debido a su dependencia de moléculas de adhesión endógenas, lo que exige una validación empírica para nuevos modelos.
