Name: In situ TEM de Ensamblajes Biológicos en Líquido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprende a imaginar ensamblajes biológicos en líquido mediante microscopía electrónica de transmisión in situ. Este método utiliza microchips de nitruro de silicio con superficies de captura de afinidad para observar partículas de rotavirus con resolución nanométrica.

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Los autores reconocen al Dr. Michael J. Friedlander, Director del Virginia Tech Carilion Research Institute por alentar nuestros esfuerzos de investigación. Este proyecto fue apoyado por fondos de desarrollo para S.M.M y D.F.K. y en parte por la iniciativa Nano-Bio del Instituto de Tecnología Crítica y Ciencia Aplicada de Virginia Tech.

1. Preparar dispositivos de captura de afinidad16
<ol><li>Limpie los E-chips de nitruro de silicio incubando en 15 ml de acetona durante 2 min seguidos de 15 ml de metanol durante 2 min(Figura 1A). Deje que las virutas se sequen bajo el flujo de aire laminar.</li>
	<li>Incube las virutas secas en una placa de agitación calentada (sin agitar) durante 1,5 horas a 150 °C, luego déjenlas enfriar a temperatura ambiente antes de usarlas.</li>
	<li>Utilice jeringas Hamilton para componer mezclas de lípidos en pequeños tubos de vidrio para contener 25% de cloroformo, 55% dlpc (1,2-dilauroil-fosfocolina) en cloroformo (1 mg/ml) y 20% de lípidos de Ni-NTA (1,2-dioleoil-iminodiacéctico ácido-succinil-níquel sal) en cloroformo (1 mg/ml) para un volumen total de 40 μl.</li>
	<li>Aplicar una alícuota de 1 μl de la mezcla sobre cada gota de 15 μl de agua Milli-Q en un trozo de Parafilm en una placa de Petri húmeda (Figura 1B). Incubar muestras sobre hielo durante al menos 60 min.</li>
</ol>2. Capturar macromoléculas17
<ol><li>Coloque un E-chip con un espaciador integrado de 150 nm encima de una muestra de monocapa e incube durante 1 min (Figura 1C).</li>
	<li>Levante suavemente el chip de la muestra y agregue una alícuota de 3 μl de proteína A etiquetada por His. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente (Figura 1D).</li>
	<li>Elimine el exceso de gota usando Whatman #1 papel de filtro y agregue inmediatamente una alícuota de 3 μl de solución de anticuerpos. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el exceso de solución con una jeringa Hamilton y agregue inmediatamente una alícuota de 1 μl de DLPs de rotavirus (0,1 mg/ml) en una solución tampón que contenga 50 mM de HEPES (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2 y 10 mM de CaCl2. Incubar durante al menos 2 min a temperatura ambiente. La preparación de dlps se ha descrito previamente18.
</li>
</ol>3. Montar la cámara microfluídica y cargar el soporte de muestras in situ
<ol><li>Cargue el E-chip húmedo que contiene la muestra viral en la punta del soporte de la muestra microfluídica. Descarga incandescente de un segundo E-chip plano durante 1 min y luego cargado en la parte superior del chip espaciador(Figura 2, paneles 1-5).</li>
	<li>Alternativamente, para aumentar el contraste de las macromoléculas biológicas, se puede agregar una mancha de metal pesado(por ejemplo, formiato de uranilo al 0,2%) a los especímenes húmedos antes de colocar el segundo chip E en el espécimen húmedo. Sin embargo, el chip E que contiene la muestra deberá lavarse con agua Milli-Q antes de agregar el reactivo de contraste.</li>
	<li>Sándwich de todo el conjunto juntos para formar un recinto sellado, mantenido en su lugar mecánicamente dentro del soporte por 3 tornillos de latón(Figura 2,paneles 6-8).</li>
	<li>Después del montaje, la punta del soporte se bombea a 10-6 Torr utilizando una estación de bombeo seco turbobombada antes de colocar el soporte dentro del TEM.</li>
</ol>4. Imágenes en líquido usando un microscopio electrónico de transmisión
<ol><li>Cargue el soporte de la muestra in situ en un microscopio electrónico de transmisión (FEI Company) equipado con un filamento LaB6 y funcionando a 120 kV.</li>
	<li>Encienda el filamento TEM y ajuste la altura eucéntrica de la etapa del microscopio con respecto a la muestra utilizando la función wobbler para inclinar la muestra de -15° a +15° hacia adelante y hacia atrás en la columna. Este procedimiento ajusta la etapa en la dirección z para ayudar a tener en cuenta el espesor adecuado de la cámara de líquido. Este paso también garantiza que se utilice una ampliación precisa al grabar imágenes.</li>
	<li>Grabe primero imágenes a lo largo de los bordes y en las regiones de las esquinas de la cámara microfluídica. Estas áreas suelen contener la solución más delgada. Registre imágenes de especímenes en condiciones de dosis bajas (1-3electrones/Å 2)utilizando una cámara CCD. Utilice aumentos nominales de 6,000X - 30,000X.</li>
	<li>Determine el valor de desenfoque adecuado enfocando en el borde de la cámara fluic. Utilice un valor de -1,5 μm para grabar imágenes con un aumento de 30.000X. Si se encuentra una solución gruesa o si no se utiliza el agente de contraste en la preparación de la muestra, utilice valores de desenfoque más altos en el rango de -2 a -4 μm.</li>
	<li>Para asegurarse de que la solución está contenida en la cámara microfluídica a lo largo de los experimentos, enfoque el haz de electrones hasta que se formen las burbujas en el líquido dentro del dispositivo.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

La autora, Madeline J. Dukes, es empleada de Protochips, Inc.

En nuestro trabajo presentado, empleamos el acercamiento de la captura de la afinidad a la correa rotavirus DLPs a una plataforma microfluidic. Esto permitió la proyección de imagen in situ de complejos macromoleculares en un microambiente líquido. El enfoque de captura es significativo con respecto a otras técnicas de imagen microfluídicas porque localiza especímenes biológicos a la ventana de imágenes para negar los grandes problemas difusivos que surgen al grabar imágenes en líquido. Sin embar...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Un objetivo común de los biólogos e ingenieros es comprender el funcionamiento interno de las máquinas moleculares. Los microscopios electrónicos de transmisión (TEMs) son instrumentos ideales para visualizar estos intrincados detalles a una resolución casi atómica1-2. Con el fin de sostener el sistema de alto vacío de un TEM, las muestras biológicas se incrustan típicamente en películas delgadas de hielo vítreo3,azúcares4,sales de metales pesados5,o alguna combinación de las mismas6. Como resultado, las imágenes de especímenes incrustados pueden revelar sólo instantáneas limitadas de procesos dinámicos.
Los primeros intentos de mantener las muestras biológicas hidratadas en cámaras líquidas ambientales fueron llevados a cabo por Parsons y sus colegas utilizando etapas de bombeo diferencial. Los patrones de difracción de electrones de cristales de catalasa no manchados se registraron con éxito a una resolución de 3 Å en un estado hidratado7-8. Además, los dominios lipídicos separados por fases podrían examinarse en membranas hidratadas de eritrocitos humanos9-10. Sin embargo, el movimiento causado por la difusión de líquido y su interferencia con el haz de electrones, dio lugar a una severa pérdida de resolución y otros experimentos con especímenes biológicos no se intentaron hasta hace poco.
Se han introducido soportes de muestras microfluídicas recientemente desarrollados que utilizan microchips semiconductores para formar una cámara ambiental microescala. Estos dispositivos pueden mantener las muestras en líquido mientras se colocan en una columna TEM11-12. Este avance técnico en la imagen TEM ha permitido a los investigadores ver, por primera vez, eventos progresivos a nivel molecular13. Nos referimos a esta nueva modalidad como "microscopía molecularin situ" ya que los experimentos ahora se pueden realizar "dentro" de la columna EM14-15. El objetivo general de este método es obtener imágenes de ensamblajes biológicos en líquido para observar sus comportamientos dinámicos a resolución nanométrica. La razón detrás de la técnica desarrollada es registrar observaciones en tiempo real y examinar las nuevas propiedades de la maquinaria biológica en solución. Esta metodología amplía el uso de los TEM para fines más amplios en biología celular y molecular12-16.
En el artículo de video actual, presentamos un protocolo completo para ensamblar y usar un soporte de muestra microfluídico disponible comercialmente. Estos soportes especializados utilizan microchips de nitruro de silicio producidos con espaciadores integrados para formar una cámara líquida que encierra volúmenes minúsculos de solución. Las ventanas delgadas y transparentes se graban en los microchips con fines de imagen12. Se demuestra el uso adecuado de un soporte microfluídico para examinar las partículas de doble capa de rotavirus simios (DLPs) en líquido utilizando un TEM. Para garantizar que los ensamblajes biológicos, como los DLPs, no se difundan rápidamente a grandes distancias durante la obtención de imágenes, empleamos el enfoque affinity capture para atarlos a la superficie de la cámara microfluídica16. Este paso de captura molecular tiene una gran ventaja sobre las técnicas alternativas para la obtención de imágenes de especímenes biológicos en líquido, ya que permite la adquisición de imágenes que se utilizarán para las rutinas de procesamiento aguas abajo. Este paso de captura utilizado en conjunción con imágenes microfluídicas es exclusivo de nuestros procedimientos17. Los lectores que emplean aplicaciones de biología estructural utilizando TEM o cámaras de imágenes microfluídicas pueden considerar el uso de técnicas de captura de afinidad cuando las observaciones dinámicas a nivel molecular son el objetivo final.

<table><tbody><tr><td>E-chips, chip espaciador</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; m ventana</td></tr><tr><td>E-chip, chip superior</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; m ventana</td></tr><tr><td>Lípido Ni-NTA</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>790404P</td><td>Forma de polvo</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) lípido</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>850335P</td><td>Forma de polvo</td></tr><tr><td>Matraces volumétricos&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-812A; 20-812C</td><td>1 ml; 5 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Jeringas Hamilton</td><td>Hamilton Co.</td><td>80300, 80400</td><td>1-10 y mu; l; 1-25 y mu; l</td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman #1</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 piezas, 90 mm</td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidrio</td><td>Corning</td><td>70165-101</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de vidrio</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Cloroformo&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Su etiqueta Proteína A Abcam</td><td>, Inc.</td><td>ab52953</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de agua Milli-Q</td> de 10 mg <td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>Agua Ultrapura</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Equipo&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poseidón In situ portamuestras</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; Compatible con</td></tr><tr><td>FEI FEI Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>Cámara</td></tr><tr><td>CCD Eagle 2k HS</td> de 120 kV <td>FEI Co.</td><td></td><td>10&nbsp; Muestreo de píxeles en la</td></tr><tr><td>estación de bombeo seco Gatan 655 de</td> 30,000X <td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Punta del soporte de la bomba a 10-6&nbsp; range</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, unidad de descarga incandescente</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; Modo de polaridad negativa</td></tr><tr><td>Placa de agitación calentada Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Heat a 150 &ordm; C durante 1,5 horas</td></tr></tbody></table>

in situ tem de ensamblajes biológicos en líquido

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Los investigadores utilizan regularmente microscopios electrónicos de transmisión (MEE) para examinar las entidades biológicas y evaluar nuevos materiales. Aquí, describimos una aplicación adicional para estos instrumentos: ver conjuntos virales en un ambiente líquido. Este método emocionante y novedoso de visualizar estructuras biológicas utiliza un soporte de espécimen a base de microfluídicos recientemente desarrollado. Nuestro artículo en video demuestra cómo ensamblar y usar un soporte microfluídico para obtener imágenes de especímenes líquidos dentro de un TEM. En particular, utilizamos partículas de doble capa (DLPs) de rotavirus simios como nuestro sistema modelo. También se describen los pasos para recubrir la superficie de la cámara líquida con biopelículas de afinidad que atar DLPs a la ventana de visualización. Esto nos permite obtener imágenes de ensamblajes de una manera que es adecuada para la determinación de la estructura 3D. Por lo tanto, presentamos una primera visión de partículas subvirales en un ambiente líquido nativo.

Las imágenes representativas de DLPs en líquido utilizando E-chips que fueron descargados por resplandor (Figura 3A) muestran menos DLPs en un área de visualización dada, presumiblemente debido a la difusión, en comparación con los DLPs que se enriquecen en dispositivos affinity capture (Figura 3B). La adición de formiato de uranilo en la cámara de imágenes mejora el contraste de la muestra y, por lo tanto, la visibilidad de los DLPs individuales en solución(Figura 3C,pa...

Aquí describimos un procedimiento para obtener imágenes de complejos virales en líquido a resolución nanométrica utilizando un microscopio electrónico de transmisión.

In situ TEM de Ensamblajes Biológicos en Líquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de ensamblajes biológicos y líquidos para observar sus comportamientos dinámicos con resolución nanométrica. Esto se logra primero preparando microchips de nitruro de silicio con una superficie de captura por afinidad, lo que permite anclar macromoléculas a la superficie del microchip, evitando así su difusión en el líquido. El segundo paso consiste en cargar muestras biológicas en el microchip con el fin de reclutar partículas de rotavirus.A continuación, se lava el microchip que contiene las partículas virales con un agente de contraste y luego se carga en el portamuestras microfluídico. El último paso consiste en colocar el chip superior y la placa frontal para formar un recipiente cerrado que encapsule la muestra líquida. Finalmente, se obtienen imágenes en el MET para revelar las características de la muestra viral dentro de la cámara microfluídica líquida.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes para examinar entidades en líquido es que nuestras muestras no se difunden rápidamente a grandes distancias durante la imagen, gracias al recubrimiento de captura por afinidad aplicado a los microchips. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia evaluaciones en tiempo real de sistemas de administración de fármacos basados en nanopartículas o en el desarrollo de vacunas contra patógenos virales, porque por primera vez podemos observar cómo cambian las nanoestructuras dinámicas en solución. Aunque este método puede ofrecer información sobre la visualización de macromoléculas biológicas, también puede aplicarse a otros sistemas, como aplicaciones en electroquímica.Una demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación de dispositivos de captura de afinidad y la carga del portamuestras microfluídico pueden representar un problema para el usuario novel. Para comenzar, limpie los chips de nitruro de silicio sumergiéndolos en 15 mililitros de acetona durante dos minutos, seguido de 15 mililitros de metanol durante dos minutos.Para eliminar el residuo de fotolito utilizado en el proceso de fabricación, deje que los chips se sequen rápidamente bajo flujo laminar. Una vez secos, incube los chips en una placa calentada a 150 grados Celsius durante 1,5 horas. Luego, déjelos enfriar a temperatura ambiente.A continuación, utilice jeringas Hamilton para preparar una mezcla de lípidos en un tubo de vidrio pequeño. Primero agregue 25% de cloroformo, luego añada 55% de DLPC en cloroformo a un miligramo por mililitro. Y finalmente, usando una jeringa separada, agregue 20% de lípido de NTA de níquel en cloroformo a un miligramo por mililitro, para un volumen total de 40 microlitros.Luego, corte un trozo de parafina para que encaje dentro de una placa de Petri de vidrio de 100 por 15 milímetros, y agregue nueve gotas de 15 microlitros de agua Milli Q sobre la superficie de la parafina. Aplique un alícuota de un microlitro de la mezcla de lípidos sobre cada gota de 15 microlitros de agua Milli Q y coloque la placa sobre hielo en un ambiente húmedo durante al menos 60 minutos mientras se forma una monocapa lipídica sobre la superficie de las gotas. Coloque un EIP con un espaciador integrado de 150 nanómetros encima de la gota de la monocapa y luego incube juntos durante un minuto.A continuación, levante suavemente el chip de la gota y agregue tres microlitros de proteína A con etiqueta His a 0,01 miligramos por mililitro directamente sobre la superficie del chip. Incube el chip y la proteína A durante un minuto a temperatura ambiente. Luego, absorba el exceso de líquido utilizando papel de filtro Watman número uno y agregue inmediatamente tres microlitros de solución de anticuerpo IgG a 0,01 miligramos por mililitro.Incube la muestra durante un minuto a temperatura ambiente. A continuación, elimine la solución en exceso utilizando una jeringa Hamilton y agregue inmediatamente un alícuota de un microlitro de rotavirus, partículas doblemente capa a 0,1 miligramos por mililitro en una solución tampón heaps, e incube el chip durante al menos dos minutos a temperatura ambiente. Se prepara un segundo IP plano mediante descarga de resplandor durante un minuto, y se ensambla la cámara microfluídica utilizando un ST.Stereoscope cargando primero la punta de la cámara de muestra con anillos tóricos.Luego, cargue el E IP húmedo que contiene la muestra viral en la punta del portamuestras microfluídico. A continuación, coloque el EIP plano sometido a descarga luminiscente sobre la parte superior del espécimen, ensamblando completamente el conjunto para formar un recinto sellado que se mantiene fijo mecánicamente dentro del portamuestras mediante tres tornillos de latón. Tras el ensamblaje, bombee la punta del portamuestras hasta 10 a la menos seis torr.Utilizando una estación de bombeo seco con bomba turbo antes de colocar el portaobjetos dentro del MET, cargue el portaobjetos I dos con un microscopio electrónico de transmisión equipado con un filamento lab seis que funcione a 120 kilovoltios. A continuación, encienda el filamento del MET y ajuste la altura centrada de la etapa del microscopio con respecto al espécimen utilizando la función de balanceo para inclinar la muestra entre menos 15 grados y más 15 grados hacia adelante y hacia atrás. En la columna, registre imágenes con aumentos de entre 6.000 y 30.000 veces a lo largo de los bordes y en las regiones de las esquinas de la cámara microfluídica.Primera imagen utilizando una cámara CCD en condiciones de baja dosis de uno a tres electrones por angstrom cuadrado. Determine el valor adecuado de desenfoque enfocando en el borde de la cámara fluidica. En general, utilice un valor de desenfoque de menos 1,5 micrómetros para registrar imágenes a 30.000 aumentos, asegurando así que la solución esté contenida en la cámara microfluidica. Durante los experimentos, enfoque el haz de electrones hasta que se formen burbujas en el líquido dentro del dispositivo. La imagen mostrada aquí se tomó después de dos minutos con cinco electrones por angstrom cuadrado. Después de cinco minutos, se formaron aún más burbujas, descarga luminiscente, los microchips se unen. Muy pocas partículas de doble capa en solución, presumiblemente debido a la difusión. En comparación, las partículas de doble capa están enriquecidas en microchips con decoración de afinidad; las imágenes mostradas aquí son representativas, así como una reconstrucción tridimensional de partículas de doble capa en un líquido que contiene un reactivo de contraste. El diámetro de la reconstrucción es de 80 nanómetros.Los promedios de la clase de partículas doblemente estratificadas y líquidas revelaron características bien definidas a lo largo de su superficie externa. Los paneles individuales tienen 110 nanómetros. Al realizar este procedimiento, es importante recordar centrar el E IPS en la punta del portamuestras y preparar (PrepU) el portamuestras antes de insertarlo en el microscopio electrónico.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como evaluar la actividad transcripcional, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como, ¿en qué medida afectó el haz de electrones a la capacidad funcional de los complejos virales? Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir dispositivos de captura por afinidad, decorarlos con adaptadores moleculares, cargar especímenes virales en el portaobjetos microfluídico para TEM e imaginar los especímenes utilizando procedimientos de microscopía cche. No olvide que trabajar con patógenos virales puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y protección ocular, al realizar procedimientos con patógenos de nivel de seguridad biológica dos.

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