Name: Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprende a estudiar propiedades mecánicas y estados de plegamiento de proteínas del celulosoma mediante espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM. Este método revela elementos estructurales terciarios que actúan como barreras energéticas durante el despliegue de dominios proteicos bajo fuerza.

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Los autores agradecen la financiación de una subvención avanzada del Consejo Europeo de Investigación a Hermann Gaub. Michael A. Nash agradece la financiación de Society in Science - The Branco Weiss Fellowship programa. Los autores agradecen a Edward A. Bayer, Yoav Barak y Daniel B. Fried del Instituto Weizmann de Ciencias por proporcionar generosamente las proteínas utilizadas en este estudio. Los autores agradecen a Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner y Stefan W. Stahl por sus útiles discusiones.

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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Para obtener datos significativos de los experimentos de espectroscopia de fuerza de una sola molécula, es crucial lograr geometrías de tracción bien definidas y reproducibles. El protocolo utilizado aquí da como resultado la inmovilización específica del sitio de complejos de proteínas en una geometría de tracción definida.
Los voladizos utilizados en este estudio fueron elegidos debido a su sensibilidad a la fuerza y alta frecuencia de resonancia en el agua. Además, la pequeña curvatura de l...

Los celulosomas son grandes complejos multienzimáticos que se muestran en la superficie de las bacterias celulolíticas anaeróbicas (por ejemplo, C. thermocellum) que han evolucionado para despolimerizar eficientemente la lignocelulosa de la pared celular de la planta en oligosacáridos solubles1. Un atributo central de los celulosomas es la interacción cohesina-dockerina de alta afinidad. En el paradigma más destacado, un módulo dockerin de 60-75 aminoácidos tipo I altamente conservado se muestra en el extremo C-terminal de las diversas enzimas bacterianas. El módulo de dockerin dirige el ensamblaje de combinaciones sinérgicas de enzimas en la proteína de andamio no catalítica ('scaffoldin'), que comprende una poliproteína de dominios de cohesina que son específicos para el módulo de dockerin de tipo I. A niveles superiores, la arquitectura del celulosoma puede llegar a ser muy compleja, incorporando pares alternativos de cohesinas y dockerinas (por ejemplo, tipo II, tipo III) que anclan las estructuras a la superficie de la célula y permiten el ensamblaje de estructuras ramificadas que contienen múltiples andamios2. Los diversos tipos de cohesina-dockerina, a pesar de tener estructuras relacionadas, exhiben especificidades de unión diferencial que suprimen la reactividad cruzada con andamios no deseados o componentes de otras especies bacterianas productoras de celulosoma. Si bien los enfoques bioinformáticos han identificado con éxito miles de componentes celulosómicos únicos a nivel genético, se conocen comparativamente pocas estructuras de proteínas, y los mecanismos que operan en la determinación de la especificidad de la cohesina-dockerina siguen siendo un área activa de la investigación en biología estructural.
Desde la invención del microscopio de fuerza atómica (AFM) por Binnig et al.3, se han desarrollado y mejorado continuamente varios modos operativos de AFM, incluidas las imágenes sin contacto, las imágenes en modo de oscilación4 y la espectroscopia de fuerza de molécula única (SMFS)5,6. SMFS se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada para sondear directamente las proteínasindividuales 7-11, los ácidos nucleicos12-15 y los polímeros sintéticos16-19. En un experimento típico de SMFS para investigar la unión receptor-ligando20,21, una punta en voladizo de AFM se modifica con uno de los socios de unión, mientras que una superficie de vidrio plana se modifica con el socio de unión complementario. El voladizo modificado se pone en contacto con la superficie, lo que permite que los socios se unan. A continuación, la base del voladizo se retira a velocidad constante y la fuerza se mide mediante el método óptico de deflexión de la palanca. Las trazas de datos de fuerza-distancia resultantes exhiben picos en forma de diente de sierra si se estableció la unión. En los casos en los que los socios de unión están fusionados a múltiples dominios de proteína, cada pico en la traza de fuerza-distancia se puede correlacionar con el despliegue de un solo dominio de proteína o subdominio plegado, mientras que el último pico corresponde a la ruptura de la interfaz de unión a proteínas. Las posiciones específicas de los elementos resistentes a la fuerza se pueden utilizar como huella dactilar para identificar los diversos dominios proteicos de interés. Este método se puede utilizar para interrogar aminoácidos importantes involucrados en el plegamiento y estabilización de proteínas. Se han reportado muchos modelos en la literatura para tratar el comportamiento característico de extensión de fuerza observado en experimentos SMFS. Los modelos más utilizados incluyen la cadena de unión libre (FJC) modelo22, la cadena en forma de tornillo sin fin (WLC) modelo18,23-25 y la cadena de rotación libre (FRC) modelo25,26.
En nuestro trabajo anterior11, utilizamos espectroscopía de fuerza de una sola molécula para investigar la interacción de los módulos de cohesina y dockerin. Aquí, presentamos un protocolo experimental para la funcionalización de la superficie del vidrio y el voladizo con construcciones de proteínas enzimática-dockerina y CBM-cohesina. También presentamos un protocolo SMFS basado en AFM que incluye procedimientos de adquisición y análisis de datos. El protocolo descrito puede generalizarse fácilmente a otros sistemas moleculares, y debería resultar particularmente útil para los investigadores interesados en pares de ligandos de receptores de alta afinidad.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropil dimetil etoxisilano</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimida</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Gel reductor de disulfuro</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini voladizos de nitruro de silicio BioLever</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Lotes blandos</td></tr><tr><td>XYZ Actuadores piezoeléctricos</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarrojos " amplio espectro" Láser IR</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D Controlador AFM</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Adquisición y análisis</td></tr><tr><td>de datos Cloruro de</td><td></td><td></td><td></td>sodio</tr><tr><td>Cloruro de calcio</td> Medidor <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>pH</td></tr><tr><td>Borato</td><td></td><td></td><td></td> de sodio</tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm de diámetro, 0,5 mm de espesor</td></tr><tr><td>Portamuestras</td><td></td><td></td> de PTFE <td>hecho a medida</td></tr><tr><td>Baño de sonicador Pureza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>analítica</td>de<td>etanol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (concentrado)</td><td></td><td></td><td>pureza analítica</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (30%)</td><td></td><td></td><td>pureza analítica</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pureza analítica</td> <td>del tolueno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio Microtubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td>adecuada para microtubos</td></tr><tr><td>Rotador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Placas <td></td><td></td><td></td><td>de Petri</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td> óptico</tr></tbody></table>

investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en afm

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Los celulosomas son complejos multienzimáticos discretos utilizados por un subconjunto de bacterias y hongos anaerobios para digerir sustratos lignocelulósicos. El ensamblaje de las enzimas en la proteína del andamio no catalítico está dirigido por interacciones entre una familia de pares receptor-ligando relacionados que comprenden módulos de cohesina y dockerin que interactúan. La unión extremadamente fuerte entre los módulos de cohesina y dockerin da como resultado constantes de disociación en el rango bajo de picomolares a nanomolares, lo que puede dificultar las mediciones precisas de la tasa de apagado con los métodos convencionales a granel. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula (SMFS) con el microscopio de fuerza atómica mide la respuesta de las biomoléculas individuales a la fuerza y, a diferencia de otros métodos de manipulación de una sola molécula (es decir, pinzas ópticas), es óptima para estudiar las interacciones receptor-ligando de alta afinidad debido a su capacidad para sondear el régimen de alta fuerza (>120 pN). Aquí presentamos nuestro protocolo completo para el estudio de ensamblajes de proteínas celulosómicas a nivel de molécula única. Utilizando una topología de proteínas derivada del celulosoma nativo, trabajamos con proteínas de fusión de enzima-dockerina y módulo de unión a carbohidratos-cohesina (CBM-cohesina), cada una con un grupo tiol libre accesible en un residuo de cisteína diseñado. Presentamos nuestro protocolo de inmovilización de superficie específico del sitio, junto con nuestro procedimiento de medición y análisis de datos para obtener parámetros de unión detallados para el complejo de alta afinidad. Demostramos cómo cuantificar las fuerzas de despliegue de un solo subdominio, las fuerzas de ruptura complejas, las tasas de desconexión cinética y los anchos potenciales del pozo de unión. Se describe con mayor detalle la aplicación exitosa de estos métodos en la caracterización de la interacción cohesina-dockerina responsable del ensamblaje de complejos celulolíticos multidominio.

Utilizamos el procedimiento descrito para investigar un par cohesina-dockerina de tipo I de C. thermocellum. Tras la unión exitosa del par cohesina-dockerina, los trazos registrados de fuerza-distancia mostraron patrones de picos característicos. Un trazo típico se muestra en la Figura 4a. Cada pico en el trazo representa el desdoblamiento de un subdominio proteico, siendo el último pico correspondiente a la disociación del complejo receptor-ligando.
Para el complejo ...

Los celulosomas son complejos multienzimáticos diseñados para digerir la celulosa. Se utilizó SMFS basado en AFM para estudiar las propiedades mecánicas y la configuración de plegamiento de los ensamblajes de proteínas asociados al celulosoma. Presentamos un flujo de trabajo completo para la inmovilización de proteínas, la adquisición de datos y el análisis de datos para estudiar las interacciones de los complejos receptor-ligando individuales involucrados en el ensamblaje del celulosoma.

Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar las propiedades mecánicas y los estados de plegamiento de las proteínas de unión fusionadas utilizando una espectroscopía de fuerza de molécula individual basada en MF. Esto se logra inmovilizando covalentemente las proteínas de unión sobre un portaobjetos de vidrio y sobre un cantiléver de MF para obtener una geometría de tracción bien definida como segundo paso. La superficie de vidrio se indentifica con el cantiléver, lo que permite establecer la unión entre receptor y ligando.A continuación, el cantiléver se retrae a una velocidad constante con el fin de desplegar dominios proteicos individuales y asociar el complejo receptor-ligando; los resultados obtenidos revelan elementos estructurales terciarios que actúan como barreras energéticas a lo largo del trayecto de desdoblamiento, los cuales se evidencian en modelos de elasticidad polimérica. Se puede obtener información adicional sobre la cinética y la energía de las parejas de unión mediante el ajuste de modelos cinéticos al espectro de fuerza dinámico. El objetivo general de este procedimiento es estudiar las vías de desdoblamiento de proteínas bajo fuerza.Este método

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Bioengineering

Bioingeniería

Investigando los sistemas de receptor-ligando del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM

Se presenta un protocolo para acoplar una gran variedad de moléculas individuales covalentemente en una punta AFM. Se proporcionan procedimientos y ejemplos para determinar la fuerza de adhesión y la energía libre de estas moléculas sobre soportes sólidos y bio-interfaces.

Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

Describimos un protocolo para la preparación de bicapas lipídicas soportadas y su caracterización utilizando microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Describimos una técnica para medir simultáneamente la cinética de unión a un solo receptor regulado por fuerza e imágenes en tiempo real de la señalización de calcio en un solo linfocito T.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Se presenta un método para lograr imágenes de alta resolución subnanométricas con (modo de descarga) con modulación de amplitud en la microscopía de fuerza atómica líquido. El método se muestra en microscopios de fuerza atómica comerciales. Se explica la razón de ser de nuestras opciones de parámetros y sugerir estrategias para la optimización resolución.

Resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en Líquido

Se describen los procedimientos y estrategias para medir las propiedades mecánicas y las vías despliegue mecánicas de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica. También mostramos resultados representativos como referencia para la selección y justificación de las grabaciones de molécula única de proteína buena.

Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

Presentamos un protocolo para funcionalizar los voladizos del microscopio de fuerza atómica (AFM) con una sola célula T y partícula de cuentas para estudios inmunológicos. Se muestran los procedimientos para sondear la unión de células T de un solo par por AFM y para monitorear la respuesta celular en tiempo real de los macrófagos a una sola partícula sólida por AFM con imágenes de fluorescencia.

Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica

Aquí, presentamos un protocolo para conjugar monómero proteico por enzimas formando polímero proteico con una secuencia controlada e inmovilizarlo en la superficie para estudios de espectroscopia de fuerza de una sola molécula.

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

La unión covalente de moléculas de sonda a puntas voladizas de la microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica esencial para la investigación de sus propiedades físicas. Esto nos permite determinar la fuerza de estiramiento, la fuerza de desorción y la longitud de los polímeros a través de la espectroscopia de fuerza de molécula única basada en AFM con alta reproducibilidad.

Adjunto covalente de moléculas únicas para espectroscopia de fuerza basada en AFM

Este protocolo tiene como objetivo automatizar las mediciones de AFM en cientos de células microbianas. En primer lugar, los microbios se inmovilizan en microestructuras de sello PDMS y luego las mediciones de espectroscopia de fuerza se realizan automáticamente en cientos de células inmovilizadas.

Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

La microscopía de fuerza atómica-espectroscopía infrarroja (AFM-IR) proporciona una poderosa plataforma para estudios bacterianos, lo que permite lograr una resolución a nanoescala. Tanto el mapeo de los cambios subcelulares (por ejemplo, en la división celular) como los estudios comparativos de la composición química (por ejemplo, derivados de la resistencia a los medicamentos) se pueden realizar a nivel de una sola célula en bacterias.

Microscopía de Fuerza Atómica Combinada con Espectroscopía Infrarroja como Herramienta para Sondear Química de Bacteria Única

Aprende a estudiar propiedades mecánicas y estados de plegamiento de proteínas del celulosoma mediante espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM. Este método revela elementos estructurales terciarios que actúan como barreras energéticas durante el despliegue de dominios proteicos bajo fuerza.

Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM

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