Name: Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprende a estudiar propiedades mecánicas y estados de plegamiento de proteínas del celulosoma mediante espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM. Este método revela elementos estructurales terciarios que actúan como barreras energéticas durante el despliegue de dominios proteicos bajo fuerza.

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Los autores agradecen la financiación de una subvención avanzada del Consejo Europeo de Investigación a Hermann Gaub. Michael A. Nash agradece la financiación de Society in Science - The Branco Weiss Fellowship programa. Los autores agradecen a Edward A. Bayer, Yoav Barak y Daniel B. Fried del Instituto Weizmann de Ciencias por proporcionar generosamente las proteínas utilizadas en este estudio. Los autores agradecen a Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner y Stefan W. Stahl por sus útiles discusiones.

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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Para obtener datos significativos de los experimentos de espectroscopia de fuerza de una sola molécula, es crucial lograr geometrías de tracción bien definidas y reproducibles. El protocolo utilizado aquí da como resultado la inmovilización específica del sitio de complejos de proteínas en una geometría de tracción definida.
Los voladizos utilizados en este estudio fueron elegidos debido a su sensibilidad a la fuerza y alta frecuencia de resonancia en el agua. Además, la pequeña curvatura de l...

Los celulosomas son grandes complejos multienzimáticos que se muestran en la superficie de las bacterias celulolíticas anaeróbicas (por ejemplo, C. thermocellum) que han evolucionado para despolimerizar eficientemente la lignocelulosa de la pared celular de la planta en oligosacáridos solubles1. Un atributo central de los celulosomas es la interacción cohesina-dockerina de alta afinidad. En el paradigma más destacado, un módulo dockerin de 60-75 aminoácidos tipo I altamente conservado se muestra en el extremo C-terminal de las diversas enzimas bacterianas. El módulo de dockerin dirige el ensamblaje de combinaciones sinérgicas de enzimas en la proteína de andamio no catalítica ('scaffoldin'), que comprende una poliproteína de dominios de cohesina que son específicos para el módulo de dockerin de tipo I. A niveles superiores, la arquitectura del celulosoma puede llegar a ser muy compleja, incorporando pares alternativos de cohesinas y dockerinas (por ejemplo, tipo II, tipo III) que anclan las estructuras a la superficie de la célula y permiten el ensamblaje de estructuras ramificadas que contienen múltiples andamios2. Los diversos tipos de cohesina-dockerina, a pesar de tener estructuras relacionadas, exhiben especificidades de unión diferencial que suprimen la reactividad cruzada con andamios no deseados o componentes de otras especies bacterianas productoras de celulosoma. Si bien los enfoques bioinformáticos han identificado con éxito miles de componentes celulosómicos únicos a nivel genético, se conocen comparativamente pocas estructuras de proteínas, y los mecanismos que operan en la determinación de la especificidad de la cohesina-dockerina siguen siendo un área activa de la investigación en biología estructural.
Desde la invención del microscopio de fuerza atómica (AFM) por Binnig et al.3, se han desarrollado y mejorado continuamente varios modos operativos de AFM, incluidas las imágenes sin contacto, las imágenes en modo de oscilación4 y la espectroscopia de fuerza de molécula única (SMFS)5,6. SMFS se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada para sondear directamente las proteínasindividuales 7-11, los ácidos nucleicos12-15 y los polímeros sintéticos16-19. En un experimento típico de SMFS para investigar la unión receptor-ligando20,21, una punta en voladizo de AFM se modifica con uno de los socios de unión, mientras que una superficie de vidrio plana se modifica con el socio de unión complementario. El voladizo modificado se pone en contacto con la superficie, lo que permite que los socios se unan. A continuación, la base del voladizo se retira a velocidad constante y la fuerza se mide mediante el método óptico de deflexión de la palanca. Las trazas de datos de fuerza-distancia resultantes exhiben picos en forma de diente de sierra si se estableció la unión. En los casos en los que los socios de unión están fusionados a múltiples dominios de proteína, cada pico en la traza de fuerza-distancia se puede correlacionar con el despliegue de un solo dominio de proteína o subdominio plegado, mientras que el último pico corresponde a la ruptura de la interfaz de unión a proteínas. Las posiciones específicas de los elementos resistentes a la fuerza se pueden utilizar como huella dactilar para identificar los diversos dominios proteicos de interés. Este método se puede utilizar para interrogar aminoácidos importantes involucrados en el plegamiento y estabilización de proteínas. Se han reportado muchos modelos en la literatura para tratar el comportamiento característico de extensión de fuerza observado en experimentos SMFS. Los modelos más utilizados incluyen la cadena de unión libre (FJC) modelo22, la cadena en forma de tornillo sin fin (WLC) modelo18,23-25 y la cadena de rotación libre (FRC) modelo25,26.
En nuestro trabajo anterior11, utilizamos espectroscopía de fuerza de una sola molécula para investigar la interacción de los módulos de cohesina y dockerin. Aquí, presentamos un protocolo experimental para la funcionalización de la superficie del vidrio y el voladizo con construcciones de proteínas enzimática-dockerina y CBM-cohesina. También presentamos un protocolo SMFS basado en AFM que incluye procedimientos de adquisición y análisis de datos. El protocolo descrito puede generalizarse fácilmente a otros sistemas moleculares, y debería resultar particularmente útil para los investigadores interesados en pares de ligandos de receptores de alta afinidad.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropil dimetil etoxisilano</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimida</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Gel reductor de disulfuro</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini voladizos de nitruro de silicio BioLever</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Lotes blandos</td></tr><tr><td>XYZ Actuadores piezoeléctricos</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarrojos " amplio espectro" Láser IR</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D Controlador AFM</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Adquisición y análisis</td></tr><tr><td>de datos Cloruro de</td><td></td><td></td><td></td>sodio</tr><tr><td>Cloruro de calcio</td> Medidor <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>pH</td></tr><tr><td>Borato</td><td></td><td></td><td></td> de sodio</tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm de diámetro, 0,5 mm de espesor</td></tr><tr><td>Portamuestras</td><td></td><td></td> de PTFE <td>hecho a medida</td></tr><tr><td>Baño de sonicador Pureza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>analítica</td>de<td>etanol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (concentrado)</td><td></td><td></td><td>pureza analítica</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (30%)</td><td></td><td></td><td>pureza analítica</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pureza analítica</td> <td>del tolueno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio Microtubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td>adecuada para microtubos</td></tr><tr><td>Rotador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Placas <td></td><td></td><td></td><td>de Petri</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td> óptico</tr></tbody></table>

investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en afm

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Los celulosomas son complejos multienzimáticos discretos utilizados por un subconjunto de bacterias y hongos anaerobios para digerir sustratos lignocelulósicos. El ensamblaje de las enzimas en la proteína del andamio no catalítico está dirigido por interacciones entre una familia de pares receptor-ligando relacionados que comprenden módulos de cohesina y dockerin que interactúan. La unión extremadamente fuerte entre los módulos de cohesina y dockerin da como resultado constantes de disociación en el rango bajo de picomolares a nanomolares, lo que puede dificultar las mediciones precisas de la tasa de apagado con los métodos convencionales a granel. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula (SMFS) con el microscopio de fuerza atómica mide la respuesta de las biomoléculas individuales a la fuerza y, a diferencia de otros métodos de manipulación de una sola molécula (es decir, pinzas ópticas), es óptima para estudiar las interacciones receptor-ligando de alta afinidad debido a su capacidad para sondear el régimen de alta fuerza (>120 pN). Aquí presentamos nuestro protocolo completo para el estudio de ensamblajes de proteínas celulosómicas a nivel de molécula única. Utilizando una topología de proteínas derivada del celulosoma nativo, trabajamos con proteínas de fusión de enzima-dockerina y módulo de unión a carbohidratos-cohesina (CBM-cohesina), cada una con un grupo tiol libre accesible en un residuo de cisteína diseñado. Presentamos nuestro protocolo de inmovilización de superficie específico del sitio, junto con nuestro procedimiento de medición y análisis de datos para obtener parámetros de unión detallados para el complejo de alta afinidad. Demostramos cómo cuantificar las fuerzas de despliegue de un solo subdominio, las fuerzas de ruptura complejas, las tasas de desconexión cinética y los anchos potenciales del pozo de unión. Se describe con mayor detalle la aplicación exitosa de estos métodos en la caracterización de la interacción cohesina-dockerina responsable del ensamblaje de complejos celulolíticos multidominio.

Utilizamos el procedimiento descrito para investigar un par cohesina-dockerina de tipo I de C. thermocellum. Tras la unión exitosa del par cohesina-dockerina, los trazos registrados de fuerza-distancia mostraron patrones de picos característicos. Un trazo típico se muestra en la Figura 4a. Cada pico en el trazo representa el desdoblamiento de un subdominio proteico, siendo el último pico correspondiente a la disociación del complejo receptor-ligando.
Para el complejo ...

Los celulosomas son complejos multienzimáticos diseñados para digerir la celulosa. Se utilizó SMFS basado en AFM para estudiar las propiedades mecánicas y la configuración de plegamiento de los ensamblajes de proteínas asociados al celulosoma. Presentamos un flujo de trabajo completo para la inmovilización de proteínas, la adquisición de datos y el análisis de datos para estudiar las interacciones de los complejos receptor-ligando individuales involucrados en el ensamblaje del celulosoma.

Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar las propiedades mecánicas y los estados de plegamiento de las proteínas de unión fusionadas utilizando una espectroscopía de fuerza de molécula individual basada en MF. Esto se logra inmovilizando covalentemente las proteínas de unión sobre un portaobjetos de vidrio y sobre un cantiléver de MF para obtener una geometría de tracción bien definida como segundo paso. La superficie de vidrio se indentifica con el cantiléver, lo que permite establecer la unión entre receptor y ligando.A continuación, el cantiléver se retrae a una velocidad constante con el fin de desplegar dominios proteicos individuales y asociar el complejo receptor-ligando; los resultados obtenidos revelan elementos estructurales terciarios que actúan como barreras energéticas a lo largo del trayecto de desdoblamiento, los cuales se evidencian en modelos de elasticidad polimérica. Se puede obtener información adicional sobre la cinética y la energía de las parejas de unión mediante el ajuste de modelos cinéticos al espectro de fuerza dinámico. El objetivo general de este procedimiento es estudiar las vías de desdoblamiento de proteínas bajo fuerza.Este método puede proporcionar información sobre la estabilidad mecánica de las proteínas. Puede aplicarse a cualquier sistema de receptor de proteína y ligando que pueda modificarse genéticamente con un grupo funcional accesible. Los investigadores que utilizan este método por primera vez pueden tener dificultades porque el momento es crucial y el manejo de los cantiléveres puede ser complicado.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica, como la forma en que una proteína de múltiples dominios se desnaturaliza. Para comenzar, coloque dos laminillas de vidrio de 2 por 24 milímetros de diámetro y 0,5 milímetros de espesor en un portador de A-P-T-F-E y luego sométalas a ultrasonido en una mezcla 50 a 50 de etanol y agua ultrapura durante 15 minutos.Cuando la sonicación haya finalizado, enjuague las laminillas con agua ultrapura y ataquelas con una solución piraña durante 30 minutos. Pasados los 30 minutos, retire las laminillas, enjuáguelas con agua ultrapura y séquelas bajo un flujo suave de nitrógeno. A continuación, sumerja las laminillas en una mezcla de 45 a cinco a uno de etanol, agua ultrapura y tres amino propil dimetil ahoy.Coloque las muestras sumergidas en un agitador a temperatura ambiente durante 60 minutos a aproximadamente 50 rotaciones por minuto. Luego, sumerja el portaobjetos secuencialmente en etanol al 100 %, seguido de agua ultrapura, dos veces cada uno. Nuevamente, seque los portaobjetos bajo una corriente suave de nitrógeno.Una vez secos, hornee las laminillas en una estufa a 80 grados Celsius durante 30 minutos. Almacene las laminillas no utilizadas bajo Argonne durante hasta seis semanas para realizar la aminoilación de puntas de cantiléver de silicona. Primero coloque cuatro cantiléveres de silicona sobre una portaobjetos limpia y trátelos con ozono UV durante 15 minutos.Luego, sumerja las palancas durante tres minutos en una solución al 50-50 de etanol y tres amino propil dimetil oxis Ilene, junto con un 0,25% de agua ultrapura. A continuación, enjuague las palancas secuencialmente durante 60 segundos en baños de tolueno, etanol y agua ultrapura. Seque cuidadosamente las palancas sobre papel de filtro entre enjuagues después del último enjuague.Coloque las palancas sobre un portaobjetos de vidrio limpio y sométalas a cocción a 80 grados Celsius durante 30 minutos. Prepare dos TEP con perlas reductoras de disulfuro cortando primero la punta de una punta de pipeta de 200 microlitros para ampliar su diámetro y luego pipeteando 100 microlitros de la solución stock de perlas en cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. A continuación, añada un mililitro de TBS a la suspensión de perlas TEP en los OTTs y lave las perlas agitando brevemente el tubo microcentrífugo en vórtex.Luego, haga un pellet de las perlas centrifugando las muestras a 850 G durante tres minutos. Retire cuidadosamente y deseche el sobrenadante con una micropipeta y lave las perlas dos veces más con un mililitro de TBS. Después de cada lavado, centrifugue; tras el lavado final, agregue una solución concentrada de proteína a tres miligramos por mililitro a las perlas TEP en una proporción de uno a dos y mezcle suavemente la suspensión agitando con la punta de una micropipeta para evitar la formación de burbujas de aire.Luego, coloque la mezcla en suspensión de perlas de proteína TEP en un rotador durante 2,5 horas. Sumerja las barras sensibles con ojos amino y láminas cubreobjetos en tampón de borato sódico a un pH de 8,5 durante 45 minutos para desprotonar los grupos amina primarios en la superficie. A continuación, caliente el polvo de malamina N-H-S-P-E-G a temperatura ambiente y prepare 210 microlitros del mismo a 25 micromolar, agitándolo por vórtex en tampón de borato sódico.La solución debe usarse lo más rápidamente posible debido a la vida media extremadamente corta de NHS. A pH 8,5, depositar rápidamente gotas de 30 microlitros de solución de N-H-S-P-E-G malam en una placa de Petri y 90 microlitros en cada otro portaobjetos de vidrio. Colocar cuidadosamente las palancas dentro de las gotas de 30 microlitros.Luego, invierta el portaobjetos sin la gota sobre otro que contenga la solución de N-H-S-P-E-G malam para formar un sándwich con la solución de N-H-S-P-E-G MALAM. En el centro, incube los cantilever y los portaobjetos con la solución de N-H-S-P-E-G MALAM a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugue la perla de TEP y la solución de proteína reducida a 100 GS durante un minuto y recoja el sobrenadante.A continuación, diluya la solución de proteína con TBS. Apunte a una concentración de proteína durante la conjugación en superficie en un rango de 0,5 a dos miligramos por mililitro. Luego, deje aparte las soluciones de proteína reducidas y diluidas durante unos minutos mientras enjuaga las palancas y las laminillas. Lave las laminillas en tres vasos de precipitados consecutivos con agua ultrapura. Elimine el líquido residual de las laminillas tocando cuidadosamente los bordes con papel de filtro. A continuación, monte las laminillas en un portamuestras adecuado compatible con el instrumento de MF-A y seque el líquido residual bajo una corriente suave de nitrógeno.Aplique 20 microlitros de la solución proteica diluida como una gota en el centro de las laminillas. Luego, enjuague los cantiléveres en tres vasos sucesivos de agua ultrapura, seguido de gotas de 30 microlitros de la segunda solución proteica diluida. Incube las laminillas y los cantiléveres pegilados con sus respectivas soluciones proteicas diluidas a temperatura ambiente durante una a dos horas en una cámara de humedad.A continuación, utilice una pipeta para enjuagar las cubreobjetos al menos 10 veces con un mililitro de TBS y luego almacénelas en TBS hasta la medición. Enjuague también los cantiléveres utilizando tres vasos de precipitados consecutivos que contengan TBS para eliminar las proteínas no unidas y almacénelos también en TBS. Monte los portaobjetos de vidrio y los cantiléveres funcionalizados en un modelo de MF-A que sea adecuado para medir en líquidos y que permita un rango de velocidad accesible en el piezo Z de aproximadamente 200 a 5.000 nanómetros por segundo.Al montar el sistema, para minimizar la exposición al aire, asegúrese de que las superficies permanezcan cubiertas con tampón durante todo el proceso tras el ajuste correcto del haz láser. Deje que el sistema alcance el equilibrio durante al menos 30 minutos para reducir cualquier efecto de deriva y realice ajustes si es necesario. Luego, comience a tomar mediciones tras la unión exitosa de la cohesión.Docker en par los trazos registrados de fuerza-distancia mostrados aquí. Exhiben un patrón de picos característico. Cada pico en el trazo representa el desdoblamiento de un subdominio proteico, siendo el último pico correspondiente a la disociación del complejo receptor-ligando.Las trazas registradas de fuerza-distancia se transformaron luego al espacio de fuerza-longitud contorno y se ensamblaron en un histograma de posición de barrera. Los datos muestran un incremento de longitud contorno de aproximadamente 89 nanómetros, que puede asignarse inequívocamente al desdoblamiento del dominio xin para sondear el paisaje energético del docker cohesivo y su interacción. Se obtuvo un total de 186 trazas de datos a cuatro velocidades diferentes de agrupamiento.El espectro de fuerza dinámico resultante, mostrado como grandes círculos azules, representa las fuerzas de ruptura más probables a una tasa de carga determinada. Estos valores se ajustaron luego al modelo de Bell Evans, obteniéndose valores para Koff y delta X, que resultaron estar en buen acuerdo con resultados previamente publicados. Una vez dominada, la parte experimental de esta técnica puede realizarse en ocho a nueve horas.Después de este procedimiento, se puede realizar una mutagénesis específica de sitio en un experimento de seguimiento para determinar los aminoácidos cruciales para la unión tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biofísica de moléculas individuales exploraran los paisajes de plegamiento proteico. La utilizamos para estudiar las propiedades mecánicas de las SOE de celulosa, que se encuentran entre los sistemas proteicos más estables mecánicamente conocidos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar espectroscopía de fuerza a nivel de molécula individual en pares de receptores proteicos y ligandos.

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Bioingeniería

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Aprende a estudiar propiedades mecánicas y estados de plegamiento de proteínas del celulosoma mediante espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM. Este método revela elementos estructurales terciarios que actúan como barreras energéticas durante el despliegue de dominios proteicos bajo fuerza.

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