Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar las propiedades mecánicas y los estados de plegamiento de las proteínas de unión fusionadas utilizando una espectroscopía de fuerza de molécula individual basada en MF. Esto se logra inmovilizando covalentemente las proteínas de unión sobre un portaobjetos de vidrio y sobre un cantiléver de MF para obtener una geometría de tracción bien definida como segundo paso. La superficie de vidrio se indentifica con el cantiléver, lo que permite establecer la unión entre receptor y ligando.

A continuación, el cantiléver se retrae a una velocidad constante con el fin de desplegar dominios proteicos individuales y asociar el complejo receptor-ligando; los resultados obtenidos revelan elementos estructurales terciarios que actúan como barreras energéticas a lo largo del trayecto de desdoblamiento, los cuales se evidencian en modelos de elasticidad polimérica. Se puede obtener información adicional sobre la cinética y la energía de las parejas de unión mediante el ajuste de modelos cinéticos al espectro de fuerza dinámico. El objetivo general de este procedimiento es estudiar las vías de desdoblamiento de proteínas bajo fuerza.

Este método puede proporcionar información sobre la estabilidad mecánica de las proteínas. Puede aplicarse a cualquier sistema de receptor de proteína y ligando que pueda modificarse genéticamente con un grupo funcional accesible. Los investigadores que utilizan este método por primera vez pueden tener dificultades porque el momento es crucial y el manejo de los cantiléveres puede ser complicado.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica, como la forma en que una proteína de múltiples dominios se desnaturaliza. Para comenzar, coloque dos laminillas de vidrio de 2 por 24 milímetros de diámetro y 0,5 milímetros de espesor en un portador de A-P-T-F-E y luego sométalas a ultrasonido en una mezcla 50 a 50 de etanol y agua ultrapura durante 15 minutos.

Cuando la sonicación haya finalizado, enjuague las laminillas con agua ultrapura y ataquelas con una solución piraña durante 30 minutos. Pasados los 30 minutos, retire las laminillas, enjuáguelas con agua ultrapura y séquelas bajo un flujo suave de nitrógeno. A continuación, sumerja las laminillas en una mezcla de 45 a cinco a uno de etanol, agua ultrapura y tres amino propil dimetil ahoy.

Coloque las muestras sumergidas en un agitador a temperatura ambiente durante 60 minutos a aproximadamente 50 rotaciones por minuto. Luego, sumerja el portaobjetos secuencialmente en etanol al 100 %, seguido de agua ultrapura, dos veces cada uno. Nuevamente, seque los portaobjetos bajo una corriente suave de nitrógeno.

Una vez secos, hornee las laminillas en una estufa a 80 grados Celsius durante 30 minutos. Almacene las laminillas no utilizadas bajo Argonne durante hasta seis semanas para realizar la aminoilación de puntas de cantiléver de silicona. Primero coloque cuatro cantiléveres de silicona sobre una portaobjetos limpia y trátelos con ozono UV durante 15 minutos.

Luego, sumerja las palancas durante tres minutos en una solución al 50-50 de etanol y tres amino propil dimetil oxis Ilene, junto con un 0,25% de agua ultrapura. A continuación, enjuague las palancas secuencialmente durante 60 segundos en baños de tolueno, etanol y agua ultrapura. Seque cuidadosamente las palancas sobre papel de filtro entre enjuagues después del último enjuague.

Coloque las palancas sobre un portaobjetos de vidrio limpio y sométalas a cocción a 80 grados Celsius durante 30 minutos. Prepare dos TEP con perlas reductoras de disulfuro cortando primero la punta de una punta de pipeta de 200 microlitros para ampliar su diámetro y luego pipeteando 100 microlitros de la solución stock de perlas en cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. A continuación, añada un mililitro de TBS a la suspensión de perlas TEP en los OTTs y lave las perlas agitando brevemente el tubo microcentrífugo en vórtex.

Luego, haga un pellet de las perlas centrifugando las muestras a 850 G durante tres minutos. Retire cuidadosamente y deseche el sobrenadante con una micropipeta y lave las perlas dos veces más con un mililitro de TBS. Después de cada lavado, centrifugue; tras el lavado final, agregue una solución concentrada de proteína a tres miligramos por mililitro a las perlas TEP en una proporción de uno a dos y mezcle suavemente la suspensión agitando con la punta de una micropipeta para evitar la formación de burbujas de aire.

Luego, coloque la mezcla en suspensión de perlas de proteína TEP en un rotador durante 2,5 horas. Sumerja las barras sensibles con ojos amino y láminas cubreobjetos en tampón de borato sódico a un pH de 8,5 durante 45 minutos para desprotonar los grupos amina primarios en la superficie. A continuación, caliente el polvo de malamina N-H-S-P-E-G a temperatura ambiente y prepare 210 microlitros del mismo a 25 micromolar, agitándolo por vórtex en tampón de borato sódico.

La solución debe usarse lo más rápidamente posible debido a la vida media extremadamente corta de NHS. A pH 8,5, depositar rápidamente gotas de 30 microlitros de solución de N-H-S-P-E-G malam en una placa de Petri y 90 microlitros en cada otro portaobjetos de vidrio. Colocar cuidadosamente las palancas dentro de las gotas de 30 microlitros.

Luego, invierta el portaobjetos sin la gota sobre otro que contenga la solución de N-H-S-P-E-G malam para formar un sándwich con la solución de N-H-S-P-E-G MALAM. En el centro, incube los cantilever y los portaobjetos con la solución de N-H-S-P-E-G MALAM a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugue la perla de TEP y la solución de proteína reducida a 100 GS durante un minuto y recoja el sobrenadante.

A continuación, diluya la solución de proteína con TBS. Apunte a una concentración de proteína durante la conjugación en superficie en un rango de 0,5 a dos miligramos por mililitro. Luego, deje aparte las soluciones de proteína reducidas y diluidas durante unos minutos mientras enjuaga las palancas y las laminillas.

Lave las laminillas en tres vasos de precipitados consecutivos con agua ultrapura. Elimine el líquido residual de las laminillas tocando cuidadosamente los bordes con papel de filtro. A continuación, monte las laminillas en un portamuestras adecuado compatible con el instrumento de MF-A y seque el líquido residual bajo una corriente suave de nitrógeno.

Aplique 20 microlitros de la solución proteica diluida como una gota en el centro de las laminillas. Luego, enjuague los cantiléveres en tres vasos sucesivos de agua ultrapura, seguido de gotas de 30 microlitros de la segunda solución proteica diluida. Incube las laminillas y los cantiléveres pegilados con sus respectivas soluciones proteicas diluidas a temperatura ambiente durante una a dos horas en una cámara de humedad.

A continuación, utilice una pipeta para enjuagar las cubreobjetos al menos 10 veces con un mililitro de TBS y luego almacénelas en TBS hasta la medición. Enjuague también los cantiléveres utilizando tres vasos de precipitados consecutivos que contengan TBS para eliminar las proteínas no unidas y almacénelos también en TBS. Monte los portaobjetos de vidrio y los cantiléveres funcionalizados en un modelo de MF-A que sea adecuado para medir en líquidos y que permita un rango de velocidad accesible en el piezo Z de aproximadamente 200 a 5.000 nanómetros por segundo.

Al montar el sistema, para minimizar la exposición al aire, asegúrese de que las superficies permanezcan cubiertas con tampón durante todo el proceso tras el ajuste correcto del haz láser. Deje que el sistema alcance el equilibrio durante al menos 30 minutos para reducir cualquier efecto de deriva y realice ajustes si es necesario. Luego, comience a tomar mediciones tras la unión exitosa de la cohesión.

Docker en par los trazos registrados de fuerza-distancia mostrados aquí. Exhiben un patrón de picos característico. Cada pico en el trazo representa el desdoblamiento de un subdominio proteico, siendo el último pico correspondiente a la disociación del complejo receptor-ligando.

Las trazas registradas de fuerza-distancia se transformaron luego al espacio de fuerza-longitud contorno y se ensamblaron en un histograma de posición de barrera. Los datos muestran un incremento de longitud contorno de aproximadamente 89 nanómetros, que puede asignarse inequívocamente al desdoblamiento del dominio xin para sondear el paisaje energético del docker cohesivo y su interacción. Se obtuvo un total de 186 trazas de datos a cuatro velocidades diferentes de agrupamiento.

El espectro de fuerza dinámico resultante, mostrado como grandes círculos azules, representa las fuerzas de ruptura más probables a una tasa de carga determinada. Estos valores se ajustaron luego al modelo de Bell Evans, obteniéndose valores para Koff y delta X, que resultaron estar en buen acuerdo con resultados previamente publicados. Una vez dominada, la parte experimental de esta técnica puede realizarse en ocho a nueve horas.

Después de este procedimiento, se puede realizar una mutagénesis específica de sitio en un experimento de seguimiento para determinar los aminoácidos cruciales para la unión tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biofísica de moléculas individuales exploraran los paisajes de plegamiento proteico. La utilizamos para estudiar las propiedades mecánicas de las SOE de celulosa, que se encuentran entre los sistemas proteicos más estables mecánicamente conocidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar espectroscopía de fuerza a nivel de molécula individual en pares de receptores proteicos y ligandos.