Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

El objetivo general de este procedimiento es aislar células dendríticas y células epiteliales del timo humano. Esto se logra primero fragmentando el tejido diseccionado mediante disruptión mecánica. A continuación, los fragmentos de tejido se digieren enzimáticamente para obtener una suspensión de células individuales.

Finalmente, la suspensión celular se enriquece con la fracción de células de baja densidad mediante separación por gradiente de densidad. En última instancia, las células dendríticas y epiteliales pueden aislarse de esta fracción mediante clasificación magnética o FACS, o una combinación de ambas. El método que presentamos aquí proporciona un procedimiento eficiente, reproducible y rentable para el aislamiento exitoso y el posterior estudio de poblaciones celulares raras, como las células dendríticas y las células epiteliales tímicas presentes en el timo humano.

I rotta, una estudiante de posgrado de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento para usted. Comience colocando el tejido tímico en una placa de Petri que contenga PBS estéril a temperatura ambiente, y enjuague cualquier sangre residual. A continuación, agregue PBS fresco a la placa de Petri y utilice pinzas y tijeras para eliminar coágulos de sangre, tejido conectivo y graso, así como cualquier parte del tejido que no parezca estar sana.

Una vez que el tejido tímico esté limpio, péselo como referencia y luego corte el tejido en trozos uniformes de un centímetro cúbico. A continuación, cubra los trozos con PBS y colóquelos sobre hielo. Después, utilice la parte trasera del émbolo de una jeringa estéril de 10 a 20 mililitros para aplicar rápidamente una presión suave sobre el tejido, con el fin de eliminar la mayor parte de los timocitos y reducir el volumen total del tejido que será digerido.

La solución se volverá visiblemente turbia. A medida que se liberen los timocitos, agite suavemente la placa y luego use un aspirador de vidrio para eliminar el sobrenadante que contiene el timo, teniendo cuidado de no aspirar accidentalmente los fragmentos de tejido. Puede ser útil utilizar un raspador estéril para cultivo celular para concentrar todos los fragmentos de tejido en un lado de la placa, luego inclinar la placa a un ángulo de 45 grados y aspirar el sobrenadante restante.

Lave el recipiente con PBS fresco y continúe recolectando el sobrenadante hasta que el PBS sea relativamente transparente. Realice un lavado final con RPMI y luego use tijeras afiladas para picar los fragmentos de tejido lo más finamente posible, al menos lo suficientemente pequeños como para introducirlos en una pipeta de cinco mililitros para aislar células dendríticas o dc. Coloque primero hasta 10 gramos de fragmentos de tejido en malla en tubos de 50 mililitros con 10 mililitros de solución de colagenasa ADN y 10 mililitros de RPMI por cada cinco gramos de tejido.

Luego, incubar la suspensión de tejido durante 40 minutos con rotación lenta en un incubador térmico a 37 grados Celsius. La solución enzimática se volverá turbia a medida que las células sean liberadas en ella. Al final de la digestión, centrifugar la suspensión celular durante dos minutos a 110 G y temperatura ambiente para sedimentar los fragmentos de tejido, recolectar el sobrenadante y luego pelotar la suspensión celular.

En este paso, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 10 a 50 mililitros de RPMI completo. Dependiendo del tamaño del sedimento, determine el número de células viables mediante exclusión con azul de tripan y luego coloque la suspensión celular a 37 grados Celsius con tapa suelta para aislar las células epiteliales tímicas o t. A continuación, resuspenda los restos de tejido en 10 mililitros de solución fresca de colagenasa ADN, más 10 mililitros de RPMI y tripsina EDTA.

Digiera adicionalmente los fragmentos de tejido durante 40 minutos a 37 grados Celsius con rotación suave. Durante los últimos 10 a 15 minutos de la incubación, agregue suero de ternera fetal en una proporción de uno a cinco para neutralizar la tripsina. Después de formar el precipitado de los fragmentos de tejido, recoja el sobrenadante y centrifugue nuevamente la suspensión celular.

En este momento, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante, teniendo cuidado de preservar el sedimento suelto. Después de contar el número de células viables, coloque esta suspensión celular también a 37 grados Celsius. Para enriquecer la fracción de baja densidad o células LDF, comience por sedimentar las suspensiones celulares previamente apartadas para el enriquecimiento de DC y tech mientras las células se sedimentan.

Prepare un gradiente de densidad de 1,07 gramos por mililitro por densidad celular. Según esta tabla, reconstituya ambos pellet hasta 1 × 10⁹ células en seis mililitros de la solución preparada por densidad celular. Mezcle suficientemente la solución celular para obtener una suspensión homogénea y luego transfiera las soluciones a tubos cónicos de poli carbonato Oakridge de 50 mililitros con tapón roscado.

A continuación, utilice una pipeta para superponer lentamente 30 mililitros de RPMI completo por tubo sobre la suspensión de células perca. Tenga cuidado de no mezclar las capas y transfiera cuidadosamente los tubos a una centrífuga previamente enfriada con rotor de ángulo fijo y separe las células durante 35 minutos. Luego, use pipetas posteriores estériles para transferir cuidadosamente las fracciones enriquecidas de células de baja densidad desde la interfase entre las células perca y el medio a tubos de 50 mililitros que contengan RPMI completo frío.

Luego lleno los tubos con RPMI completo adicional para diluir el resto por célula. Finalmente, lavo las células enriquecidas dos veces con RPMI incompleto, resuspendo el precipitado en medio fresco y determino el número de células viables en esta primera figura. Se muestra un fragmento de tejido bastante grande de nueve centímetros obtenido de un niño de 6 años, tal como se acaba de demostrar.

Un primer paso importante consiste en limpiar el tejido de partes indeseables. Como indican las flechas blancas, se obtuvo entonces una suspensión de células individuales del tejido tímico y se enriqueció con células de la fracción de baja densidad. Mientras que una suspensión típica de células individuales contiene aproximadamente el 3 % de células positivas para H-L-A-D-R tras la separación por gradiente de densidad, este porcentaje aumenta al 15-40 % en la célula de mayor tamaño.

Fracción de baja densidad en la fracción de alta densidad, que consiste principalmente en timocitos de tamaño pequeño y uniforme. Prácticamente no hay tales células tímicas.

Las células dendríticas mieloides pueden identificarse mediante la expresión de varios marcadores de superficie, incluyendo CD11c. Esta figura muestra el aislamiento eficiente de células positivas para CD11c utilizando un protocolo modificado de separación magnética de células tras el aislamiento. La pureza de las células dendríticas positivas para CD11c fue del 93 %, según se determinó mediante tinción inmunológica de las células aisladas. En promedio, el rendimiento de células positivas para CD11c aisladas es de cinco veces 10 a la cinco hasta cinco veces 10 a la seis células dendríticas mieloides por 10 a la nueve células tímicas totales.

En esta tabla, se muestran datos representativos obtenidos de varias muestras individuales de timo de diferentes edades y pesos de tejido, con un rango de suspensiones individuales de células de entrada, así como el número total de células de la fracción de baja densidad y el rendimiento y pureza posteriores de CD11c positivo, únicamente en la fracción enriquecida en células presentadoras de antígeno. Aproximadamente el 0,5 % de las células son células epiteliales corticales CD45, EPCA positivas de baja densidad o células epiteliales medulares CD45 negativas EPAM positivas, que pueden ser clasificadas a partir de las células estromales enriquecidas CD45 bajas negativas digeridas con tripsina como epam, CDR2 positivas bajas y epam altas CD2 negativas, respectivamente. La obtención de células dendríticas y subpoblaciones de células epiteliales tímicas a partir de timo humano.

Es sensible al tiempo. Cuanto más rápida sea la procedimiento de ululación, mejor será la condición de las células. Una vez dominado este protocolo, las células dendríticas pueden aislarse en cinco a seis horas y las células epiteliales tímicas en ocho a diez horas.

Después de ver este video hoy, debería tener una comprensión muy clara de cómo manipular tejido tímico humano para el aislamiento exitoso de células dendríticas y células epiteliales tímicas. Las células aisladas luego pueden utilizarse en muchas aplicaciones posteriores para su estudio subsiguiente, con el fin de caracterizar mejor las células y comprender más a fondo su biología.