Un dispositivo de cámara de flujo tridimensional Novel para el Estudio de quimioquinas-dirigida extravasación de células circulantes en condiciones de flujo fisiológicas

El objetivo general del siguiente experimento es medir cuantitativamente la migración de células circulantes hacia un gradiente de quimioquinas. Bajo condiciones de estrés cortante fisiológico, esto se logra primero cultivando una monocapa de células endoteliales sobre insertos microporosos recubiertos con colágeno, y luego ensamblando estos insertos en una cámara de flujo donde cubren un compartimento estático separado que contiene quimioquinas. A continuación, se aplica un estrés cortante a las células para imitar las condiciones fisiológicas en la vasculatura.

Como segundo paso, se permite que las células de interés, como las células madre, los leucocitos o las células tumorales, circulen por el sistema 3D durante la perfusión. El contenido del compartimento estático influye en la eficiencia de las interacciones entre las células circulantes y las células endoteliales, y consecuentemente en la tasa de transmigración de las células de prueba a través de la capa endotelial. A continuación, se desmonta el sistema 3D y se recogen las células de prueba transmigradas del compartimento estático inferior para medir cuantitativamente la migración celular mediante diversos métodos de vanguardia. Los resultados obtenidos muestran la capacidad de las células de prueba circulantes para interactuar con las células endoteliales bajo condiciones de flujo fisiológico y salir de la circulación en función de la concentración de quimioquinas en el compartimento estático.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el uso de cámaras de flujo laminar paralelo y ensayos de transferencia estática, es que combina tanto el esfuerzo cortante en el compartimento superior como el quimiotáctico en el compartimento inferior estático. Esto permite a los investigadores medir cuantitativamente la externalización de células circulantes hacia el gradiente quimiotáctico y en condiciones de flujo fisiológico. Este método también puede utilizarse para estudiar el efecto de la comunicación cruzada entre las células del microentorno local y las células endoteliales sobre la extravasación de células circulantes.

Al ayudar con una capa adicional de células en un inserto separado debajo de las células endoteliales, quien demostrará el procedimiento será Valentina Rova, una técnica de mi laboratorio. Para comenzar, calcule el número de insertos necesarios para el experimento y coloque cada inserto en una placa de Petri estéril separada. Estérilicelos mediante irradiación gamma hasta que la dosis total alcance 11 gray, según los ajustes individuales.

Luego, diluya el colágeno stock. La solución de tipo uno a 50 microgramos por mililitro utilizando ácido clorhídrico 0,01 molar almacenado a cuatro grados Celsius y prepare alícuotas de 154 microlitros de la solución final para cada inserto. A continuación, coloque varias gotas de un Eloqua sobre la superficie del inserto en un patrón circular.

Luego, agregue el resto del alícuota para formar una gota grande sobre la superficie del inserto. Asegúrese de que la punta de la pipeta no toque el inserto en ningún momento y de que el colágeno cubra toda la superficie del inserto, pero que no se drene. Una vez que el inserto esté cubierto, coloque la tapa sobre la placa de Petri y colóquela cuidadosamente sobre una superficie plana.

Incube los insertos durante una hora a temperatura ambiente; tras la incubación, aspire la solución de colágeno y lave la membrana con 160 microlitros de PBS. Luego aspire el PBS. Reemplace la tapa y envuelva el recipiente con parafina.

Si los insertos se van a utilizar el mismo día, coloque la placa de Petri en un lugar seco a temperatura ambiente. De lo contrario, coloque la placa a cuatro grados Celsius y utilice el inserto dentro de siete días. Recolecte las células endoteliales de vena umbilical humana cultivadas justo antes de su uso y resuspenda en el medio de cultivo deseado a 2,5 millones de células por mililitro.

Al contar las células, asegúrese de que la viabilidad celular sea mayor al 98 % utilizando azul de tripano, luego agregue 160 microlitros de la suspensión celular sobre cada inserto. Para ello, coloque primero varias gotas pequeñas sobre la superficie del inserto recubierto con colágeno en forma de círculo, y luego añada cuidadosamente el resto de la suspensión celular para formar una gota grande. Una vez finalizado, coloque las tapas y coloque con cuidado las placas en un incubador con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius e incube durante 30 minutos para permitir que las células se adhieran a la membrana.

Después de 30 minutos, retire las placas del incubador y agregue cuidadosamente cinco mililitros de medio de cultivo precalentado sobre cada inserto. Tenga cuidado de asegurarse de que el inserto permanezca en el fondo del recipiente y esté completamente cubierto por el medio. Luego, reemplace las tapas y coloque nuevamente las placas en el incubador para continuar el cultivo.

Las células a 37 grados Celsius durante la noche. Para armar la cámara de flujo primero, atornille juntas las placas superior e inferior. Luego conecte las placas a la unidad de intercambio de gas utilizando tubo de PVC con una luz de 1,42 milímetros y paredes de 0,8 milímetros de espesor.

A continuación, coloque el dispositivo ensamblado en una bolsa de plástico limpia y esterilícelo mediante irradiación gamma hasta que la dosis total alcance 11 gray. El siguiente paso consiste en retirar una bandeja de incubadora, colocarla en una cabina de cultivo de tejidos estéril y esterilizarla con etanol al 70 %. Luego, cúbrala con una servilleta estéril grande.

A continuación, retire el dispositivo de la bolsa de plástico y colóquelo sobre la bandeja estéril del incubador. Luego, conecte el dispositivo a la bomba peristáltica y programe la bomba para que funcione a una velocidad de 0,2 mililitros por minuto. Pipete cinco a siete mililitros del medio de cultivo deseado en un tubo estéril de 15 mililitros que se utilizará para la entrada.

Luego, desconecte el tubo de entrada del tubo de salida tirando de la aguja metálica del tubo con pequeñas toallas estériles para mantener la esterilidad del tubo, coloque la aguja metálica de entrada en el tubo de 15 mililitros con el medio y coloque el tubo de salida en el tubo de 15 mililitros vacío. A continuación, encienda la bomba para que el flujo sea en sentido antihorario. Permita que la presión negativa impulse el medio desde el tubo de entrada de 15 mililitros hacia el tubo, y detenga la bomba cuando el medio llegue al extremo del tubo, justo antes de entrar en el dispositivo.

A continuación, abra el dispositivo desatornillando las placas del tubo y retire cuidadosamente con una pipeta de 1500 a 1550 microlitros de medio hacia los pozos inferiores, asegurándose de que los pozos contengan suficiente medio para formar un hemisferio que alcance uno a dos milímetros por encima de la placa inferior. A continuación, transfiera los insertos preparados desde las placas de Petri a los pozos de la placa inferior. Utilizando una pinza estéril, asegúrese de que no queden burbujas atrapadas debajo de los insertos y aspire cualquier medio que aparezca sobre la superficie de la placa inferior.

Luego, coloque nuevamente la placa superior sobre la placa inferior y vuelva a conectarlas. Utilizando los tornillos, encienda inmediatamente la bomba peristáltica y permita que el medio fluya a través del dispositivo 3D. Eleve el extremo de salida del dispositivo y mantenga la cámara en esta posición para prevenir la formación de burbujas dentro del espacio entre las placas.

Continúe llenando el tubo que conecta la cámara con la unidad de intercambio de gases con medio hasta que alcance la unidad de intercambio de gases. A continuación, coloque tres mililitros de medio en la unidad de intercambio de gases. Encienda la bomba y permita que las burbujas de aire salgan a través de ella.

Eleve la unidad para permitir que el medio llene el tubo que sale de ella y detenga la bomba cuando el medio esté a dos o tres centímetros del extremo. Una vez cebada completamente, conecte la aguja de entrada al tubo de salida utilizando pequeñas gasas estériles. Luego invierta la bomba para que el medio fluya en sentido horario hacia la unidad de intercambio gaseoso y asegúrese de eliminar cualquier burbuja de aire residual.

Con la bomba fluyendo nuevamente en sentido antihorario, agregue 100 microlitros de la suspensión de células de prueba a la unidad de intercambio de gases. Luego cierre la tapa del respirador.

Coloque la bandeja de nuevo en el incubador y permita que las células de prueba circulen en el dispositivo a 37 grados Celsius. Una vez transcurrido el tiempo deseado, retire la bandeja con el sistema en funcionamiento del incubador y colóquela en la cabina de flujo laminar. Detenga la bomba, desconecte la entrada y la salida, y coloque los extremos en tubos estériles de 15 mililitros vacíos.

Luego encienda la bomba y recoja la suspensión celular del sistema. Coloque la suspensión celular en hielo hasta su uso. A continuación, desarme la cámara retirando los tornillos y levantando la placa superior.

Retire los insertos de la placa inferior y transfiéralos a placas de Petri para la tinción o recolección de células. Finalmente, retire la suspensión celular de los pozos inferiores y colóquela en tubos de 15 mililitros. Enjuague cada pozo dos veces con 1,5 mililitros de medio y agréguelo al tubo correspondiente.

Luego, centrifugue los tubos durante cinco minutos a 200 G y procese las células de acuerdo con los objetivos experimentales específicos, como los enumerados en el protocolo de texto adjunto que se muestra. A continuación se presenta un ejemplo de una de las muchas pruebas que se pueden realizar utilizando este sistema. El montaje consiste en células endoteliales derivadas de médula ósea cultivadas en insertos con poros de cinco micrones, con factor uno derivado de células estromales o SDF uno añadido por debajo de los insertos a concentraciones de 0,5 o 50 nanogramos por mililitro.

Se permitió que las células de médula ósea circularan en el sistema 3D. Las células que migraron a través del inserto se recolectaron y luego se cultivaron en placas con medio de metilcelulosa. En presencia de factores de crecimiento hematopoyéticos que inducen a las células progenitoras a formar colonias, se contabilizó el número de colonias 14 días después para determinar la cantidad de progenitores en cada pocillo y revelar su capacidad de migrar hacia sdf.

Uno bajo condiciones de flujo fisiológico. Con la adición de fibroblastos estromales cultivados en la inserción inferior en la cámara estática, más células hematopoyéticas migraron desde la circulación hacia la cámara con la adición de SDF-1 a 50 nanogramos por mililitro que con solo SDF-1 después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que investigadores en diferentes campos de las ciencias médicas y biológicas modelaran lechos vasculares específicos de tejidos in vitro y exploraran los mecanismos celulares y moleculares que median la migración de células circulantes hacia tejidos normales frente a tejidos enfermos.