Un dispositivo de cámara de flujo tridimensional Novel para el Estudio de quimioquinas-dirigida extravasación de células circulantes en condiciones de flujo fisiológicas

El objetivo general del siguiente experimento es medir cuantitativamente la ación de las células circulantes hacia un gradiente de quimiocinas. En condiciones de puro estrés fisiológico, esto se logra primero cultivando, una monocapa de células endoteliales en insertos microporosos recubiertos de colágeno, y luego ensamblándolos en una cámara de flujo donde cubren un compartimento estático separado que contiene quimiocinas. A continuación, se aplica un esfuerzo cortante a las células para imitar las condiciones fisiológicas de la vasculatura.

Como segundo paso, las células de prueba de interés, como los leucocitos, las células madre o las células tumorales, pueden circular en el sistema 3D durante la circulación. El contenido en el compartimento estático influye en la eficiencia de las interacciones entre las células circulantes y las células endoteliales y, posteriormente, en la tasa de transmigración de las células de prueba a través de la capa endotelial. A continuación, se desmonta el sistema 3D y se recogen las células de prueba transmigradas del compartimento estático inferior con el fin de medir cuantitativamente la célula utilizando varios métodos de última generación, se obtienen resultados que muestran la capacidad de las células de prueba circulantes para interactuar con las células endoteliales en condiciones de flujo fisiológico y salir de la circulación en función de la concentración de quimiocinas en el compartimento estático.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de cámaras de flujo de lámina paralela y ensayos de transferencia estática, es que combina tanto la tensión de she en el compartimento superior como las cinas en el compartimento estático inferior. Esto permite a los investigadores medir cuantitativamente la externalización de las células circulantes al gradiente de parentesco y las condiciones de flujo fisiológico. Este método también se puede utilizar para estudiar el efecto de una diafonía entre las células del microambiente local y las células endoteliales en la extravasación de las células circulantes.

Con la ayuda de una capa adicional de células en un inserto separado debajo de las células endoteliales, la demostración del procedimiento será Valentina contra rova, un técnico de mi laboratorio. Para empezar, calcule el número de insertos necesarios para el experimento y coloque cada inserto en una placa de Petri estéril separada. Esterilícelos mediante irradiación gamma hasta que la dosis total alcance los 11 grises según las configuraciones individuales.

A continuación, diluya el colágeno de caldo. Escriba una solución a 50 microgramos por mililitro utilizando ácido clorhídrico 0,01 molar almacenado a cuatro grados Celsius y prepare 154 alícuotas de microlitros de la solución final para cada inserto. A continuación, coloque varias gotas de un Eloqua sobre la superficie del inserto en un patrón circular.

A continuación, añada el resto de la alícuota para formar una gota grande en la superficie del inserto. Asegúrese de que la punta de la pipeta no toque el inserto en ningún punto y de que el colágeno cubra toda la superficie del inserto, pero no se drene. Una vez que el inserto esté cubierto, coloque la tapa en la placa de Petri y colóquela con cuidado sobre una superficie plana.

Incubar los insertos durante una hora a temperatura ambiente después de la incubación, aspirar la solución de colágeno y lavar la membrana con 160 microlitros de PBS. A continuación, aspire el PBS. Vuelva a colocar la tapa y envuelva el plato con paraform.

Si los insertos se van a utilizar el mismo día, coloque la placa de Petri en un lugar seco a temperatura ambiente. De lo contrario, coloque el plato a cuatro grados centígrados y use el inserto dentro de los siete días. Coseche las células endoteliales de la vena umbilical humana cultivadas justo antes de su uso y vuelva a suspenderlas en el medio de cultivo deseado a 2,5 millones de células por mililitro.

Al contar las células, asegúrese de que la viabilidad de la célula sea superior al 98% utilizando azul triano, luego agregue 160 microlitros de la suspensión celular en cada inserto. Colocando primero varias gotas pequeñas sobre la superficie del inserto recubierto de colágeno en un círculo, y luego agregando con cuidado el resto de la suspensión celular para formar una gota grande. Cuando termine, vuelva a colocar las tapas y coloque con cuidado los platos en una incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados e incube durante 30 minutos para permitir que las células se adhieran a la membrana.

Después de 30 minutos, retire las placas de la incubadora y agregue suavemente cinco mililitros de medio de cultivo precalentado sobre cada inserto. Tenga cuidado de asegurarse de que el inserto permanezca en el fondo del plato y esté completamente cubierto por el medio. Luego vuelva a colocar las tapas y vuelva a colocar con cuidado los platos en el cultivo de la incubadora.

Las celdas a 37 grados centígrados durante la noche. Para ensamblar primero la cámara de flujo, atornille las placas superior e inferior. A continuación, conecte las placas a la unidad de intercambio de gas mediante un tubo de PVC de 1,42 milímetros de diámetro con paredes de 0,8 milímetros de grosor.

A continuación, coloque el dispositivo ensamblado en una bolsa de plástico limpia y esterilícelo mediante irradiación gamma hasta que la dosis total alcance 11 grises. El siguiente paso es retirar una bandeja de incubadora, colocarla en una campana de cultivo de tejidos estéril y esterilizarla con etanol al 70%. A continuación, cubra la bandeja con una servilleta estéril grande.

A continuación, saque el dispositivo de la bolsa de plástico y colóquelo en la bandeja estéril de la incubadora. A continuación, conecte el dispositivo a la bomba peristáltica y programe la bomba para que funcione a una velocidad de 0,2 mililitros por minuto. Pipetear de cinco a siete mililitros del medio de cultivo deseado en un tubo estéril de 15 mililitros que se utilizará para la entrada.

Luego desconecte el tubo de entrada de la salida tirando de la aguja de metal del tubo con pequeñas servilletas estériles para mantener la esterilidad del tubo, coloque la aguja de entrada de metal en el tubo de 15 mililitros con el medio y coloque el tubo de salida en el tubo vacío de 15 mililitros. A continuación, encienda la bomba, de modo que el flujo sea en sentido contrario a las agujas del reloj. Permita que la presión negativa extraiga el medio del tubo de entrada de 15 mililitros hacia el tubo y detenga la bomba cuando el medio llegue al final del tubo justo antes de ingresar al dispositivo.

A continuación, abra el dispositivo desenroscando las placas de los tubos y retire con cuidado la pipeta de la placa superior de 1500 a 1.550 microlitros de medio en los pocillos inferiores, asegurándose de que los pocillos contengan suficiente medio para formar un hemisferio que alcance uno o dos milímetros por encima de la placa inferior. A continuación, transfiera los insertos preparados de las placas de Petri a los pocillos de la placa inferior. Con una pinza estéril, asegúrese de que no queden burbujas atrapadas debajo de los insertos y aspire cualquier medio que aparezca en la superficie de la placa inferior.

A continuación, vuelva a colocar la placa superior en la placa inferior y vuelva a conectarlas. Con los tornillos, encienda inmediatamente la bomba peristáltica y permita que el medio fluya a través del dispositivo 3D. Eleve el extremo de salida del dispositivo y mantenga la cámara en esta posición para evitar la formación de burbujas dentro del espacio entre las placas.

Continúe llenando el tubo que conecta la cámara a la unidad de intercambio de gas con medio hasta que llegue a la unidad de intercambio de gases. A continuación, coloque tres mililitros de medio en la unidad de intercambio de gases. Encienda la bomba y permita que las burbujas de aire escapen a través de ella.

Eleve la unidad para permitir que el medio llene el tubo que sale de él y detenga la bomba cuando el medio esté dos o tres centímetros antes del extremo. Una vez que esté completamente cebado, conecte la aguja de entrada al tubo de salida con pequeñas servilletas estériles. A continuación, invierta la bomba para que el medio fluya en el sentido de las agujas del reloj hacia la unidad de intercambio de gases y asegúrese de eliminar las burbujas de aire restantes.

Con la bomba fluyendo de nuevo en sentido contrario a las agujas del reloj. Agregue 100 microlitros de la suspensión de la celda de prueba a la unidad de intercambio de gases. A continuación, cierre la tapa del respirador.

Vuelva a colocar la bandeja en la incubadora y permita que las células de prueba circulen en el dispositivo a 37 grados centígrados. Una vez que haya pasado el tiempo deseado, retire la bandeja con el sistema de trabajo de la incubadora y colóquela en la campana. Detenga la bomba, desconecte la entrada y la salida y coloque los extremos en tubos estériles vacíos de 15 mililitros.

A continuación, encienda la bomba y recoja la suspensión de la celda del sistema. Coloque la suspensión de celdas en hielo hasta su uso. A continuación, desmonte la cámara quitando los tornillos y levantando la placa superior.

Retire los insertos de la placa inferior y transfiéralos a placas de Petri para teñirlos o recolectarlos células. Finalmente, retire la suspensión celular de los pocillos inferiores y colóquela en tubos de 15 mililitros. Enjuague cada pocillo dos veces con 1,5 mililitros de medio y agréguelo a su respectivo tubo.

A continuación, centrifugar los tubos durante cinco minutos a 200 Gs y procesar las células de acuerdo con objetivos experimentales específicos, como los enumerados en el protocolo de texto adjunto que se muestra. Aquí hay un ejemplo de una de las muchas pruebas que se pueden realizar con este sistema. La configuración consiste en reflejar células endoteliales derivadas de la médula ósea cultivadas en insertos con poros de cinco micras por debajo de los insertos: se agregó el factor uno derivado de células estromales o SDF uno a concentraciones de cero, cinco o 50 nanogramos por mililitro.

Se permitió que las células de la médula ósea circularan en el sistema 3D. Las células que migraron a través del inserto se recolectaron y luego se cultivaron en placas con medios de metilcelulosa. En presencia de factores de crecimiento hematopoyéticos que causaron la formación de colonias en las células progenitoras, se puntuó el número de colonias 14 días después para determinar el número de progenitores en cada pocillo y revelar su capacidad de migrar hacia la fds.

Uno en condiciones de flujo fisiológico. Con la adición de fibroblastos estromales cultivados en el inserto inferior de la cámara estática, más células hematopoyéticas migraron de la circulación a la cámara con la adición de sdf, una a 50 nanogramos por mililitro que con solo SDF una sola después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en diferentes campos de las ciencias médicas y biológicas modelaran lechos vasculares específicos de tejidos in vitro y exploraran los mecanismos celulares y moleculares, mediando la migración de las células circulantes hacia los tejidos normales frente a los enfermos.