De Alto Rendimiento Fluorometric Medición de Potencial del Suelo extracelulares enzimáticos Actividades

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las tasas máximas potenciales a las que las enzimas extracelulares en los suelos degradan sus sustratos objetivo. Esto se logra primero combinando suelo húmedo de campo y tampón en una licuadora, y luego transfiriendo alícuotas de las muestras mezcladas a placas de muestra de pocillos profundos y placas estándar de pocillos profundos. Las placas de pocillos profundos se incuban y centrifugan antes de transferir 250 microlitros de cada pocillo de las placas de pocillos profundos a los pocillos correspondientes de placas negras de fondo plano.

Placas de 96 pocillos. A continuación, las tres placas se leen en el fluorímetro y se analizan los datos resultantes. En última instancia, las actividades potenciales de enzimas extracelulares del suelo se determinan por la velocidad con la que el colorante fluorescente se libera del sustrato mediante una reacción catalizada por enzima, en la que una mayor fluorescencia indica una mayor degradación del sustrato.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es la capacidad de medir actividades enzimáticas en un gran número de muestras aprovechando el formato profundo de placas de 96 pocillos. Tuvimos la idea original de este método al percibir la posibilidad de aumentar el volumen de muestra en comparación con las placas microplaca estándar, adaptando otros protocolos al formato de placas con pocillos profundos. Las implicaciones de esta técnica nos permiten vincular de manera más precisa la fisiología microbiana con procesos a escala de ecosistema.

La demostración visual es fundamental para esta técnica porque existen muchos matices y manejos de la muestra que no son fáciles de seguir en un procedimiento escrito. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la ecología microbiana y la biogeoquímica del suelo, como por ejemplo cómo responden los microorganismos del suelo a los cambios en su entorno y cómo sus respuestas fisiológicas afectan procesos ecosistémicos críticos, tales como la descomposición y el ciclo de nutrientes. Aunque este método puede proporcionar información sobre la descomposición de la materia orgánica del suelo y el ciclo de nutrientes en ecosistemas terrestres, también puede aplicarse a sistemas marinos y de agua dulce.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con las habilidades de pipeteo y con los aspectos relacionados con la sensibilidad al tiempo en este protocolo. Además, la gran cantidad de datos generada en este procedimiento puede resultar abrumadora para los usuarios principiantes. Para comenzar la preparación del ensayo, etiquete tres placas de pozo profundo como muestra MUB estándar para cuatro metil y beona, y MUC estándar para siete amino cuatro metil cumarina.

Viértase cada estándar y sustrato en reservorios separados, limpios y previamente etiquetados, dispuestos en filas. Luego, pipetee el estándar MUB apropiado en los pozos correspondientes de la placa de estándares MUB según se indica en el protocolo escrito. Repita este proceso con los estándares MUC, colocándolos en los pozos correspondientes de la placa de estándares MUC para preparar las suspensiones de suelo.

Para cada muestra de suelo, pese 2.75 gramos de suelo húmedo de campo antes de agregarlo a una licuadora. Añada 91 mililitros de un tampón de 50 milimolar y mezcle a velocidad alta durante un minuto. Vierta el contenido de la licuadora en un recipiente de vidrio limpio, con un tamaño de al menos el ancho de una pipeta de ocho canales, que contenga una barra magnética de agitación.

La suspensión de suelo puede filtrarse a través de un tamiz de aproximadamente un milímetro antes de verterla en el recipiente. Coloque el recipiente sobre una placa calefactora y mezcle la suspensión de suelo. Luego, pipetee 800 microlitros de la suspensión de suelo en la primera columna de la placa de muestras.

Realice lo mismo para la primera columna de las placas patrón de MUB y patrón de MUC. Enjuague la licuadora, la placa agitadora y la barra de agitación con agua desionizada o tampón entre muestras de suelo. Repita este proceso para cada muestra de suelo.

Desplazándose a la siguiente columna con cada muestra subsiguiente. A continuación, pipetee el sustrato adecuado en los pozos correspondientes de la placa de muestras. Como se indica en el protocolo escrito, prepare una placa de muestras para cada temperatura de incubación que se vaya a probar.

Cierre las placas de pocillos profundos con tapetes para placas. Invierta manualmente cada placa sellada hasta que la solución se mezcle completamente. Coloque las placas en el incubador adecuado durante el período de incubación requerido, según se indica en el protocolo escrito; registre el momento inicial como tiempo cero, así como los tiempos adecuados de incubación al final de cada período de incubación.

Centrifugue las placas selladas durante tres minutos a aproximadamente 2 900 G. Después de la centrifugación, transfiera 250 microlitros de cada pocillo de las placas de pocillos profundos incubadas a los pocillos correspondientes de placas negras planas de fondo. Se utilizará una placa negra por cada placa de pocillos profundos incubada.

Es importante transferir las muestras desde las placas de pocillos profundos incubadas a los pocillos correspondientes en las placas negras de fondo plano de 96 pocillos, siguiendo las instrucciones del fabricante para el lector de placas flora metric utilizado. Ajuste la longitud de onda de excitación a 365 nanómetros y la longitud de onda de emisión a 450 nanómetros.

Cargue una de las placas patrón, configure el fluorímetro en ganancia automática y lea la placa. Luego, establezca la ganancia en modo manual y reduzca el valor desde el óptimo al siguiente número más bajo, redondeado al cinco más cercano. Para cada placa patrón, repita la medición dos veces por placa.

A continuación, cargue la placa de muestras. Establezca la ganancia en automático y ejecute la placa de muestras. Vuelva a ejecutar manualmente la placa de muestras para igualar la ganancia más alta de cada una de las placas patrón.

Comience el análisis de datos introduciendo los datos de fluorescencia de la curva patrón en una hoja de cálculo para los patrones de MUB y MUC. Convierta las concentraciones micromolares a micromoles para cada muestra. A partir de los datos de fluorescencia de la curva patrón, calcule la pendiente, el intercepto en y y los valores de R cuadrado para las concentraciones patrón de MUB y MUC.

Los valores de r cuadrado aceptables deben superar 0,98 para cada muestra. Las curvas estándar pueden visualizarse en un gráfico de dispersión con las lecturas de fluorescencia representadas como la variable dependiente y la concentración estándar representada como la variable independiente. Ingrese los datos brutos de fluorescencia de la muestra más sustrato en una nueva hoja de cálculo.

Además, incluya el tiempo de incubación y el peso seco del suelo para cada muestra, reste los valores de intersección de la curva patrón de los valores de fluorescencia de la muestra correspondiente y luego divida por la pendiente de la curva patrón correspondiente. Utilizando la ecuación de la recta patrón, multiplique los micromoles de la muestra por 91 mililitros, que es el volumen de tampón utilizado en la suspensión de suelo. Divida el valor obtenido por el tiempo de incubación específico de la muestra y la masa de suelo seco.

Finalmente, multiplique el valor obtenido por 1000 para obtener las unidades deseadas. Los resultados se muestran a partir de un estudio climático experimental que compara suelos expuestos a condiciones climáticas ambientales con suelos expuestos a tratamientos de dióxido de carbono elevado y calentamiento; aquí se muestran las actividades potenciales de enzimas extracelulares o EEAs en el sitio de calentamiento de pradera y enriquecimiento de dióxido de carbono elevado, en parcelas de control y parcelas de tratamiento. En este ejemplo, las actividades de adquisición enzimática potenciales de carbono, nitrógeno y fósforo analizadas a profundidades de suelo de cero a cinco centímetros no difirieron según el tratamiento experimental.

Sin embargo, a profundidades de suelo de cinco a 15 centímetros, varias EEA potenciales diferían significativamente. Por ejemplo, las enzimas que degradan el carbono, beta 1-4 glucosidasa y beta D celobiasa, eran menores en los parcelas con dióxido de carbono elevado y calentamiento en comparación con las parcelas bajo condiciones climáticas ambientales; asimismo, las enzimas que mineralizan nitrógeno y fósforo también eran menores en las parcelas de tratamiento en comparación con las condiciones climáticas ambientales. A profundidades de suelo de cinco a 15 centímetros.

El cálculo y la representación gráfica de la suma de todas las EEA potenciales de ciclado de carbono, nitrógeno o fósforo puede ser un enfoque útil para observar patrones más amplios relacionados con los ciclos potenciales de carbono, nitrógeno y/o fósforo en el suelo. En este ejemplo, se calculó la suma de las EEA potenciales de beta uno cuatro gluco, beta D cello, bio hidrolasa, beta xlo y alfa uno cuatro gluco para representar las actividades potenciales de ciclado de carbono. Se calculó la suma de beta uno cuatro N-acetil glucosaminidasa y L-leucina aminopeptidasa para representar las actividades potenciales de ciclado de nitrógeno.

La fosfatasa se utilizó para representar las actividades potenciales de ciclado de fósforo. Las EEA potenciales para el ciclado de carbono, nitrógeno y fósforo total mostraron una tendencia decreciente en los parcelas con tratamiento de dióxido de carbono elevado y calentamiento, en comparación con las parcelas bajo condiciones climáticas ambientales, a profundidades de suelo de cinco a quince centímetros. Sin embargo, esta tendencia solo fue significativa para las actividades de ciclado de nitrógeno y fósforo total, y las EEA del suelo no difirieron significativamente entre las parcelas de tratamiento.

En profundidades de suelo de cero a cinco centímetros. Los resultados sugieren tendencias contrastantes en la actividad enzimática y en los grupos funcionales entre las parcelas tratadas en respuesta a la profundidad del suelo; la relación de actividades enzimáticas potenciales es una forma de evaluar las demandas microbianas de nutrientes. Aquí, las enzimas del suelo, la geometría tochi, las relaciones de carbono a nitrógeno, carbono a fósforo o nitrógeno a fósforo difieren significativamente entre las parcelas tratadas en profundidades de suelo de cero a cinco centímetros.

Sin embargo, las relaciones potenciales de enzima de carbono a fósforo y de nitrógeno a fósforo fueron más altas en los parcelas con tratamiento de dióxido de carbono elevado y calentamiento. En comparación con las condiciones climáticas ambientales, a profundidades de suelo de cinco a quince centímetros la temperatura puede influir fuertemente en las EEA del suelo. Aun así, en ensayos de laboratorio típicos, las enzimas del suelo se miden a una única temperatura que puede no corresponder a las condiciones de temperatura en C dos.

Los gráficos de Aran se utilizan para visualizar la energía de activación y se trazan usando el logaritmo de la actividad enzimática en función de la temperatura inversa convertida a grados kelvin en el eje x. La energía de activación se define comúnmente como la energía mínima necesaria para catalizar una reacción química y se utiliza aquí como un indicador de la sensibilidad térmica de las reacciones catalizadas por enzimas. Una mayor energía de activación indica una mayor sensibilidad térmica de la enzima.

Asimismo, las energías de activación corresponden directamente al coeficiente térmico Q 10. Los valores del coeficiente térmico de la cinética enzimática potencial para las EEA de carbono, nitrógeno y fósforo se evaluaron entre ambos parcelas tratadas a las dos profundidades del suelo, y los resultados demostraron que la sensibilidad térmica de las EEA no fue significativamente diferente entre las parcelas tratadas a ninguna de las dos profundidades del suelo. Una vez dominado, se pueden inocular 12 muestras en las placas de microtitulación de 96 pocillos en 30 minutos o menos.

Además, tras los tiempos de incubación prescritos, normalmente se pueden centrifugar, transferir y volver a leer las placas en el urometro dentro de media hora mientras se realiza este procedimiento. Es importante pipetear de manera consistente. Cualquier burbuja de aire durante la pipetación afectará negativamente sus resultados tras seguir este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la extracción y secuenciación de ADN, para responder preguntas adicionales relacionadas con el papel de la composición de la comunidad microbiana del suelo en su función tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ecología microbiana exploraran el ciclo de nutrientes y los procesos biogeoquímicos en ecosistemas terrestres. Después de ver este video, deberías tener una idea muy clara de cómo cuantificar las actividades enzimáticas potenciales.

Además, debería ser capaz de interpretar los datos para reflejar posibles respuestas microbianas a factores como el clima y los diferentes tipos de suelo dentro de distintos ecosistemas. No olvide que al trabajar con materiales fluorescentes, siempre se deben tomar precauciones para minimizar la exposición a la luz debido a la sensibilidad lumínica del grupo fluoro.