Name: Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-28T20:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Aprende a utilizar células humanas bioluminiscentes para el monitoreo continuo y en tiempo real de citotoxicidad. Este método permite evaluar la actividad metabólica celular sin destruir la muestra.

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Estos esfuerzos de investigación fueron apoyados por la División Nacional Science Foundation de la Química, Bioingeniería, Medio Ambiente y Sistemas de Transporte (CBET) bajo el número de premios CBET-0853780 y CBET-1159344 y los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental (NIEHS) bajo el número de concesión 1R43ES022567-01, y el Instituto Nacional del Cáncer, Programa de Imagen del Cáncer con el número premio CA127745-01. El instrumento IVIS Lumina utilizado en este trabajo se obtuvo del Programa de Instrumentación EE.UU. Ejército Defense University Research.

1. Preparación de células <ol><li> Recuperar un vial de células bioluminiscentes HEK293 de nitrógeno líquido stock congelado y crecer en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino, mM de aminoácidos no esenciales 0,01, 1x antibiótico-antimicótico, y 0,01 mM de piruvato de sodio en un T 75 frasco de cultivo de tejidos a 37 º C y 5% de CO 2. Nota: Los medios de comunicación y componentes complementarios pueden variar dependiendo de las líneas de células y por lo tanto deben ser elegidos en consecuencia. </li><li> Actualizar medio cada 2-3 días hasta alcanzar ~ 80% de confluencia. Nota: La cantidad de células necesarias se basa en el diseño experimental. Si es necesario, más células pueden obtenerse a través de subcultivo. </li><li> Células de la cosecha para la prueba. <ol><li> Retirar el medio y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) girando suavemente el matraz y luego desechar el estado de PBS. </li><li> Añadir tripsina e incubar a 37 ° C durante 2 min,o hasta que las células se separaron del matraz. </li><li> Recoger las células desprendidas en PBS y transferirlos a un tubo de centrífuga limpio. Nota: Si las líneas celulares adherentes se utilizan, las células separadas por centrifugación y se lavan una vez con PBS. </li></ol></li><li> Determinar el recuento total de células utilizando un hemocitómetro o de otro sistema de recuento de células. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en medio fresco, precalentado. </li><li> Semillas igual número de células en pocillos individuales de una placa de múltiples pocillos opaca. En este ejemplo, la placa de 5 x 10 5 células en un volumen de 1 ml en cada pocillo de una placa de 24 pocillos negro. Placa de un volumen igual de medio en pocillos por triplicado para actuar como el control negativo. Nota: El número de células sembradas en cada pocillo es flexible y puede ser optimizado para los experimentos individuales. Para cada línea celular bioluminiscente, determinar experimentalmente la relación entre el número de células y biolumiNESCent de salida, así como la célula mínima detectable cuentan antes de ningún ensayo de toxicidad. Para ello, la medida de bioluminiscencia en una amplia gama de tamaños de población (por ejemplo, 1 x 10 03 al 1 x 10 6 células) en condiciones de formación de imágenes estandarizadas. </li><li> Tratar las células con el compuesto de ensayo (s) según se describe a continuación. </li></ol> 2. Preparación química <ol><li> Preparar la sustancia estudiada como una solución madre concentrada. En este ejemplo, utilizar una 100 mg / ml de solución madre de un antibiótico de la familia de la bleomicina. Nota: Para reducir al mínimo los posibles efectos tóxicos vehículo a base de, especialmente si un disolvente orgánico se utiliza como un vehículo para la adición de productos químicos, se recomienda que la concentración de solución madre sea de al menos 1000 veces la concentración después de la aplicación deseada. </li><li> Añadir el caldo de química preparada directamente a las células. En este ejemplo, la dosis del antibiótico de interés a concentraciones finales de 100, 200, 300, y 400 mg / ml en triplicar pozos. Agregar tres pocillos de células no tratadas como controles. Nota: La concentración final de la sustancia química objetivo se debe seleccionar sobre la base de los objetivos experimentales específicas. Una amplia gama de concentraciones se prueba normalmente para obtener un espectro completo de los efectos tóxicos. </li></ol> 3. Imágenes y Análisis de Datos <ol><li> Inmediatamente después de la adición de productos químicos, coloque la placa en la cámara de imágenes de instrumento adecuado para la adquisición de imágenes y la medición de bioluminiscencia. </li><li> Medida bioluminiscencia cada 15 minutos durante un período de 24 horas con un tiempo de 10 min de integración para cada lectura. Nota: El tiempo de integración utilizado en este ejemplo es en una base por placa y se puede ajustar para la medición en una base por pocillos usando otros luminómetros de elección. El tiempo de integración también se puede ajustar sobre la base de la línea de células bioluminiscente elegido. Debido a que la bioluminiscencia se produce autónomamente sin la destrucción de células o ninguna estimulación externa, leernes se pueden tomar en cualquier punto en el tiempo que desee para cumplir con los objetivos experimentales específicas. </li><li> Cuantificar la intensidad bioluminiscente de cada pocillo mediante la identificación de una región de interés utilizando software compatible. Muestra la salida de luz, ya sea como el flujo total (fotones / segundo) o la luminosidad media (fotones / segundo / cm steridian 2 /) de cada muestra. </li></ol>

<ol><li>U.S. Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+really+FDA+approved%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FDA+Consumer+Health+Information%22%5BJournal%5D)">Is it really FDA approved?</a> FDA Consumer Health Information. 2, (2009).</li>
<li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicology+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460, 208-212 (2009).</li>
<li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Regul.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).</li>
<li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+developments+in+cell+culture+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Current developments in cell culture technology.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).</li>
<li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+human+ADME%2FTox+drug+properties+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).</li>
<li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+to+evaluate+ADMET+drug+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties.</a> Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).</li>
<li>Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+for+the+luciferase+from+the+marine+ostracod+Vargula+hilgendorfii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).</li>
<li>Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real+time+Metridia+luciferase+based+non-invasive+reporter+assay+of+mammalian+cell+viability+and+cytotoxicity+via+the+beta-actin+promoter+and+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+bacterial+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of bacterial bioluminescence.</a> Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).</li>
<li>Close, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+bioluminescent+expression+of+the+bacterial+luciferase+gene+cassette+%28lux%29+in+a+mammalian+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line.</a> PLoS ONE. 5, e12441(2010).</li>
<li>Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).</li>
<li>Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+the+antibiotic+Zeocin+by+stable+expression+of+the+Sh+ble+gene+does+not+fully+suppress+Zeocin-induced+DNA+cleavage+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells.</a> Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).</li>
<li>Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+detection+of+human+toxicants+in+real+time+using+a+human+optimized+bioluminescent+bacterial+luciferase+gene+cassette+bioreporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE+8371%2C+Sensing+Technologies+for+Global+Health%2C+Military+Medicine%2C+Disaster+Response%2C+and+Environmental+Monitoring+II%3B+and+Biometric+Technology+for+Human+Identification+IX%22%5BJournal%5D)">Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter.</a> Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).</li>
<li>Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+optimized+bacterial+luciferase%2C+firefly+luciferase%2C+and+green+fluorescent+protein+for+continuous+imaging+of+cell+culture+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models.</a> J. Biomed. Opt. 16, e12441(2011).</li>
</ol>

DM Close, SA Ripp y GS Sayler son fundadores y propietarios de 490 BioTech, Inc.

Este método demuestra el uso de células de mamíferos bioluminiscentes forma autónoma como un ensayo de cribado de citotoxicidad in vitro que permite a las células en vivo para ser controlados continuamente durante toda su vida en. Este protocolo es flexible y puede ser modificado para adaptarse a las condiciones experimentales específicas según se requiera. Por ejemplo, el experimento que aquí se presenta es adecuado para el seguimiento de los efectos tóxicos agudos, pero puede ser adaptado para evalua...

En los EE.UU., los productos farmacéuticos y otros productos destinados al consumo humano requieren una evaluación extensiva antes de que sean aprobados para su uso por el consumidor por la Administración de Alimentos y Drogas. La carga financiera para la realización de esta prueba se coloca en el desarrollador de 1, lo que aumenta sustancialmente el coste de desarrollo compuesto nuevo y por lo tanto, se traduce en un aumento de coste para los consumidores. Si bien tradicionalmente la mayor parte de este examen ha utilizado materias animales para actuar como representantes de los huéspedes humanos, esto ha demostrado ser una gran carga financiera, con un estimado de 2,8 mil millones dólares gastados anualmente en ADME / Tox (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad ) seleccionar solo 2 y la creciente evidencia que sugiere que los modelos animales no pueden predecir con certeza las respuestas toxicológicas humanos 3. Por lo tanto, las pruebas basadas en el cultivo de células humanas in vitro se ha ganado popularidad en las últimas dos décadas debido a su relativamente bajacoste, mayor rendimiento y una mejor representación de la biodisponibilidad humana y toxicología 4. Los métodos de cribado de toxicidad basada en el cultivo de células actuales emplean diversos criterios de valoración, tales como la medición de los niveles de ATP, la detección de la actividad de las enzimas citoplasmáticas endógenamente disponibles, el sondeo de la integridad de la membrana celular, o el seguimiento del nivel de la actividad mitocondrial, para evaluar la viabilidad celular 5 , 6. Sin embargo, independientemente del punto final elegido, todos estos métodos requieren la destrucción de la muestra antes de las mediciones se pueden tomar, por tanto, sólo la producción de datos en un solo punto de tiempo. Como resultado de ello, un gran número de muestras tienen que ser preparados y tratados en paralelo para estudios básicos cinética toxicológicos, de nuevo añadiendo al coste y mano de obra requerida para el nuevo desarrollo compuesto. Alternativamente, los ensayos de luciferasa utilizando secretadas tales como luciferasa Gaussia 7, luciferasa de Vargula 8, 9 y Metridia luciferasase han desarrollado que elimina la necesidad de la lisis celular y requiere una fracción de los medios de comunicación para la medición de la variable, sin embargo, éstos están todavía se limita a muestreo en puntos de tiempo predeterminados y también requiere la adición de sustratos exógenos luz de activación. Para evitar el detrimento de la destrucción de la muestra requerida, así como para eliminar el costo de sustratos, una línea celular humana ha sido diseñado que expresa la bioluminiscencia bacteriana completo (lux) casete del gen (luxCDABEfrp) para permitir la monitorización continua de células vivas que es similar de imágenes de células vivas fluorescente basado-dye, pero sin los procedimientos de investigación de fotones que activan y microscópicas adicionales. Esta línea celular es capaz de producir constitutivamente una señal óptica para la detección continua, directa y sin la necesidad de la estimulación externa, evitando así la destrucción de la muestra. Mecánicamente, la señal bioluminiscente generada a partir de estas células como resultados cuando la enzima luciferasa luxAB formado cataliza la oxidación de un aldehído graso de cadena larga (sintetizado y regenerado por los productos de los genes luxCDE usando sustratos endógenos) en presencia de la reducción de fosfato de riboflavina (FMNH 2, que se recicla desde FMN por el gen FRP producto) y oxígeno molecular 10. Por lo tanto, la expresión del casete de lux en la célula huésped permite que la luz a ser producido y detectado sin la destrucción celular o adición de sustrato exógeno. Del mismo modo, la interacción entre los genes lux y el FMN disponibles endógenamente, y O 2 co-sustratos, y los requisitos de mantenimiento de un entorno que puede apoyar la conversión de FMN a FMNH 2, asegura que la señal bioluminiscente resultante sólo puede ser detectado de vivir , las células metabólicamente activas. Estos requisitos previamente han sido explotados para demostrar que lux-bassalida ed bioluminiscente se correlaciona fuertemente con tamaño de la población celular 11 y que la exposición compuesto tóxico perjudica la producción autobioluminescent de una manera dosis-respuesta 12. Aquí se utiliza un autobioluminescent de riñón embrionario humano previamente caracterizado (HEK293) línea celular 11 para demostrar la detección toxicológica automatizado de un antibiótico de la familia de la bleomicina con conocida actividad que daña el ADN como un ejemplo representativo para validar la solicitud de células de mamífero autobioluminescent para las pruebas de toxicidad.

<table><tbody><tr><td>IVIS Lumina</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>También se pueden utilizar otros modelos de IVIS y lectores de placas basados en PMT</td></tr><tr><td>Living Imaging 2.0</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Están disponibles las últimas actualizaciones de este software</td></tr><tr><td>75 cm2 matraces tratados para cultivo celular</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>placas tratadas con cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Costar</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Placa negra de 24 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662174</td><td>placas de 96 o 384 pocillos se pueden utilizar para aplicaciones de mayor rendimiento</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Hyclone</td><td>SH30910</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM),</td><td>Hyclone</td> sin rojo de fenol <td>SH30284</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH3091003</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio, 100mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Zeocina, 100 mg/ml</td><td>Life Technologies</td><td>R25001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, 0.05%</td><td>Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Células de mamíferos basado en ensayos in vitro han sido ampliamente empleada como alternativas a los ensayos con animales para los estudios toxicológicos, pero se han limitado debido a los altos costos monetarios y el tiempo de preparación de la muestra paralela que se hicieron necesaria debido a la naturaleza destructiva de los métodos de detección basados ​​en luciferasa de luciérnaga . Este video describe la utilización de células de mamíferos bioluminiscentes forma autónoma, que no requiere la adición destructiva de un sustrato de luciferina, como un método económico y fácil para el seguimiento de los efectos citotóxicos de un compuesto de interés. Las células de mamífero que expresan establemente la bioluminiscencia bacteriana completo (luxCDABEfrp) casete del gen autónoma producen una señal óptica que picos a 490 nm sin la adición de un sustrato de luciferina caro y posiblemente interferir, de excitación por una fuente de energía externa, o la destrucción de la muestra que es tradicionalmente realizado durante el procedimiento de formación de imágenes ópticass. Esta independencia de la estimulación externa coloca la carga para el mantenimiento de la reacción bioluminiscente únicamente en la célula, lo que significa que la señal resultante sólo se detecta durante el metabolismo activo. Esta característica hace que la línea de células de lux que expresan un excelente candidato para el uso como un biosentinel contra los efectos citotóxicos debido a cambios en la producción bioluminiscente son indicativos de efectos adversos sobre el crecimiento celular y el metabolismo. Del mismo modo, el carácter autónomo y la falta de la destrucción de la muestra requerida permite formación de imágenes repetidas de la misma muestra, en tiempo real durante todo el período de exposición tóxica y se pueden realizar a través de múltiples muestras de imagen utilizando el equipo existente de forma automatizada.

En este estudio, la dinámica de las células HEK293 autobioluminescent se monitorizaron continuamente durante un período de 24 horas en respuesta a la exposición a antibióticos (Figura 1). Los efectos tóxicos de este antibiótico, que es un miembro de la familia bleomicina sabido para matar a las células vivas mediante la unión a, y escisión de ADN 13, se demostraron a través de una disminución en la producción bioluminiscente en comparación con las células no tratadas, que puede ser visualizad...

Las células de mamífero que expresan el casete del gen bioluminiscencia bacteriana (<em&gt; Lux</em&gt;) Producir luz autónoma. La dinámica bioluminiscentes resultantes tras la exposición química se han demostrado para reflejar los efectos de los tratamientos sobre el crecimiento celular y el metabolismo, haciendo que estas células una herramienta barata, continua, en tiempo real toxicidad de detección que puede ser fácilmente adaptado para la automatización de alto rendimiento.

Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar células humanas luminiscentes de forma autónoma para el monitoreo continuo y en tiempo real de la citotoxicidad. Esto se logra primero obteniendo un número suficiente de células autobiluminiscentes en crecimiento activo. En el segundo paso, se siembran cantidades iguales de células en pozos individuales de una placa de múltiples pozos.A continuación, las células se tratan con un compuesto de interés en una serie de concentraciones. En la etapa final, se mide la señal bioluminiscente utilizando un instrumento compatible. En última instancia, la dinámica de la emisión bioluminiscente puede utilizarse para demostrar el efecto del compuesto en ensayo sobre la actividad metabólica de las células.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como aquellos que utilizan luciferasa aislada de insectos o especies submarinas, es que no se requiere la destrucción de la muestra ni la adición de sustrato para producir una señal detectable. James Webb, un estudiante universitario de un laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de cultivar las células bioluminiscentes de interés hasta alcanzar una confluencia del 80 % en el medio de cultivo adecuado, lave la cultura celular con PBS mediante agitación suave. A continuación, añada tripsina y incube las células a 37 °C hasta que se desprendan del frasco. Luego, recoja las células resuspendidas en PBS, transfiera la suspensión a un tubo cónico limpio y determine el número de células tras contarlas. Centrifugue la suspensión celular durante cinco minutos a 300 G a temperatura ambiente y resuspenda.Suspenda el sedimento en medio precalentado fresco, luego siembre cantidades iguales de células en pozos individuales de una placa multi-pozo opaca, agregando un volumen igual de medio solo en un conjunto de pozos por triplicado como control negativo. A continuación, deje tres pozos de células sin tratar como controles, y añada el compuesto experimental de interés directamente a las células en las concentraciones experimentales apropiadas, en triplicado. Inmediatamente después del tratamiento experimental, coloque la placa en la cámara de imagen del instrumento adecuado para la adquisición de imágenes y la medición de bioluminiscencia.Luego, configure el tiempo de integración adecuado para cada lectura y mida la bioluminiscencia cada 15 minutos durante un período de 24 horas. Finalmente, utilice el software compatible apropiado para identificar una región de interés en cada pocillo. Para cuantificar la intensidad bioluminiscente de cada muestra experimental, muestre la emisión de luz en fotones por segundo para ilustrar el flujo total o en fotones por segundo por centímetro cuadrado por Ceridian, para demostrar la radiancia promedio de cada muestra.En este estudio, se monitorearon continuamente durante un período de 24 horas las dinámicas de las células HEC 2 9 3 autoluminiscentes en respuesta a la exposición a antibióticos. Los efectos tóxicos de este antibiótico, que pertenece a la familia Blio Mycin y que se sabe mata células vivas al unirse a dos y escindir el ADN, se demostraron mediante una disminución en la producción de bioluminiscencia en comparación con células no tratadas, lo cual puede visualizarse directamente mediante imágenes de pseudocolores. Como se muestra aquí, la naturaleza bioluminiscente de las células HEC 2 9 3 permite el cribado paralelo repetido de muestras bajo diferentes condiciones de tratamiento, permitiendo la comparación de distintas concentraciones experimentales en cualquier punto temporal para un análisis de respuesta a la dosis sencillo.Por ejemplo, en este gráfico, la bioluminiscencia producida por las células tras 15, 18 o 20 horas de tratamiento se representó frente a las concentraciones del compuesto experimental añadido, lo que muestra que el aumento del tratamiento con antibiótico provoca una reducción en la producción de bioluminiscencia por las células de manera dependiente de la dosis. La técnica presentada en este video es adecuada para rastrear efectos tóxicos agudos, pero puede adaptarse para evaluar toxicidad de acción lenta o a largo plazo mediante imágenes repetidas de las células a intervalos de tiempo crecientes, manteniendo al mismo tiempo el cultivo en condiciones estándar de incubación entre lecturas.

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Investigación

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Biology

Biología

Luciferasa modificados xenoinjertos de tumores humanos el cerebro puede ser establecida por vía intracraneal en ratones atímicos, con posterior seguimiento del crecimiento del tumor y la respuesta a la terapia que utiliza imágenes de bioluminiscencia. En combinación con el análisis de supervivencia, la supervisión de bioluminiscencia es una herramienta esencial para la investigación pre-clínica de las terapias que se consideran para el tratamiento de tumores cerebrales.

El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

En este artículo se describe la administración...

Imágenes bacteriana Bioluminiscente<em&gt; En Vivo</em

Fuente: Valentine, M. E., et al., Generación de mutantes de deleción génica en cuadro en Pseudomonas aeruginosa y pruebas de atenuación de virulencia en un modelo simple de infección en ratón. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el uso de un enfoque de imagen basado en bioluminiscencia para monitorizar la infección bacteriana en un modelo de ratón vivo. La imagen secuencial bioluminiscente y de rayos X permite la visualización en tiempo real y la localización anatómica de la infección...

Imagen en tiempo real de infección bacteriana en un modelo murino utilizando bioluminiscencia

Imágenes de bioluminiscencia es una herramienta bien conocida para la localización de tumores y metástasis, pero la cuantificación de estas imágenes a menudo requiere cálculos complejos e instrumentos particulares. Se describe el método luminoscore de usar fácil, sobre la base de condiciones de adquisición precisas, que no requiere de cálculos, y que permite la carga tumoral y la respuesta al tratamiento a ser monitoreados en modelos de ratón.

Método de cuantificación del tumor bioluminiscencia-base para la progresión tumoral Monitoreo y efectos del tratamiento en modelos de ratón linfoma

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Se presenta un ensayo de bioluminiscencia en vitro para determinar del ritmo circadiano celular en células epiteliales mamarias. Este método utiliza plásmidos de reportero de células de mamífero expresando desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gen de periodo 2 . Puede ser adaptado a otros tipos de células para evaluar efectos de órgano-específicas en el ritmo circadiano.

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

Luciferase genéticamente codificado es un popular reportero no invasivo de la expresión génica. Uso de un automatizado luciferase longitudinal imagen optimizada de gas y temperatura grabadora (cocodrilo) permite la grabación longitudinal de células bioluminiscentes bajo una amplia gama de condiciones. Aquí mostramos cómo cocodrilo puede utilizarse en el contexto de la investigación de los ritmos circadianos.

Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

Aquí, presentamos un protocolo para la producción y los ensayos preclínicos murinas CD19 coche de células de T por transducción retroviral y utilización como terapia contra establecido syngeneic A20 linfoma en ratones BALB/c con o sin lymphodepleting acondicionamiento previo.

Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19

Aquí, describimos un método de monitoreo no invasivo que involucra la expresión de luciferasa y proteína fluorescente verde en varias líneas celulares de cáncer de mama. Este protocolo proporciona una técnica para monitorizar la formación tumoral y la colonización metastásica en tiempo real en ratones.

Monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia

Los ritmos circadianos, que existen en la mayoría de los organismos, regulan la organización temporal de los procesos biológicos. Los organoides 3D han surgido recientemente como un modelo in vitro fisiológicamente relevante. Este protocolo describe el uso de reporteros bioluminiscentes para observar los ritmos circadianos en organoides, lo que permite investigaciones in vitro de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares.

Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

Aprende a utilizar células humanas bioluminiscentes para el monitoreo continuo y en tiempo real de citotoxicidad. Este método permite evaluar la actividad metabólica celular sin destruir la muestra.

Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad

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