Inyección de ganglios intra-linfáticos de partículas de polímero biodegradables

El objetivo general de este procedimiento es depositar partículas de vacuna de biomateriales en los ganglios linfáticos mediante una técnica de inyección directa. Primero, sintetice las partículas poliméricas estabilizadas con lípidos utilizando un método de doble emulsión. Luego, lave las partículas y mida las propiedades del material, como el tamaño, la carga, la capacidad de carga o la estabilidad.

A continuación, administre un colorante trazador en la base de la cola del ratón para permitir la visualización tras el drenaje del colorante hacia el ganglio linfático. El paso final consiste en identificar el ganglio linfático marcado con D e inyectar un pequeño volumen de partículas poliméricas en este sitio. Se puede utilizar histología, inmunofluorescencia y microscopía confocal para confirmar la presencia y distribución de las partículas en los ganglios linfáticos inguinales.

La combinación de la inyección directa en ganglios linfáticos con biomateriales para la vacunación permite un control preciso sobre las combinaciones y dosis de los componentes de la vacuna en el microentorno del ganglio linfático, y posibilita la liberación controlada de cargas en estos tejidos. Todas las vacunas deben alcanzar los ganglios linfáticos para ser efectivas. Por lo tanto, definir cómo los biomateriales y las señales inmunitarias incorporadas afectan la señalización local en los ganglios linfáticos es fundamental para relacionar estos eventos con la respuesta inmunitaria sistémica.

Este conocimiento nos ayudará a comprender mejor cómo funcionan las vacunas basadas en biomateriales administradas mediante vías tradicionales. Aunque la administración intra-nódulo linfático de biomateriales sirve como una herramienta para estudiar los efectos de estos materiales sobre la organización de los nódulos linfáticos, esta plataforma también ofrece una oportunidad aplicada para desarrollar nuevas vacunas terapéuticas e inmunoterapias dirigidas contra el cáncer y los trastornos autoinmunes. Para sonicar las micropartículas, sonicar la fase orgánica que contiene el polímero, lípido y otros componentes insolubles en agua en hielo a 12 vatios.

Para crear la emulsión de agua y aceite, agregue 500 microlitros de H2O destilada o H2O que contenga un miligramo de péptido proteico u otro componente soluble en agua. Continúe agitando durante 30 segundos. Agite suavemente el vial hacia arriba y abajo, de lado a lado, alrededor de la punta del agitador para asegurar una emulsificación completa.

Ahora prepare la emulsión de agua y aceite en agua vertiendo la emulsión de aceite en agua en 40 mililitros de H2O y homogenice durante tres minutos a 16.000 RPM. A continuación, agregue una barra magnética de agitación y agite la emulsión de agua y aceite en agua durante la noche para eliminar el exceso de disolvente tras la eliminación del disolvente durante la noche. Vierta la emulsión a través de un filtro de malla de nailon de 40 micrones en un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros y centrifugue durante cinco minutos, deseche el sobrenadante, resuspenda el botón de partículas en un mililitro de agua y transfiera las partículas en suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Recolecte las partículas mediante una centrifugación de cinco minutos. Mida el tamaño de las partículas por difracción láser o dispersión de luz. Asegúrese de que el volumen de agua agregado a la celda de fracción esté a un nivel suficiente para la alineación y el blanco. Pipetee 10 microlitros de la suspensión de partículas en la celdilla de fracción.

Cierre la puerta del compartimiento del analizador de tamaño de partículas. Luego mida el tamaño de partícula para PLGA. Utilice un índice de refracción de 1.60.

Utilice la interfaz del software para calcular el diámetro de las partículas utilizando una base numérica un día antes de la inyección. Anestesie el ratón según un protocolo para animales aprobado por el IACUC. Evalúe la profundidad de la anestesia mediante un estímulo en el dedo del pie.

Realice pruebas del reflejo de pellizco y controle la respiración para asegurar una frecuencia respiratoria de 100 a 120 respiraciones por minuto. Afeite el vello en la base de la cola y en la región posterior. Retire el vello del lado ventral del animal y lateralmente hasta el lado dorsal, justo por encima de la articulación de la pata trasera.

Para cada inyección de colorante, utilice una micropipeta para transferir 10 microlitros de solución de colorante a un tubo fuge microcentrífugo y aspire los 10 microlitros completos mediante una aguja de calibre 31 hacia una jeringa de insulina de un mililitro. A continuación, inyecte 10 microlitros de solución de colorante subcutáneamente en cada lado de la base de la cola para la carga entre inyecciones. Aplique una crema depilatoria suave para eliminar el vello restante.

Asegúrese de cubrir la zona entre la pata trasera y el abdomen. Después de tres minutos, use una mano enguantada húmeda con H₂O tibia y frótelas suavemente la crema depilatoria sobre la piel. Repita inmediatamente para eliminar el exceso de depilatorio.

A continuación, humedezca un paño suave o una toalla de papel con agua tibia y, con un solo movimiento, limpie la porción inferior del ratón. Coloque el ratón bajo una lámpara de calor para que se recupere y luego devuélvalo al alojamiento durante al menos 12 horas. Examine el ratón anestesiado para confirmar el drenaje del trazador o colorante hacia cada ganglio linfático inguinal.

El ganglio linfático debe ser visible como una mancha oscura cerca del muslo trasero y el abdomen. Ahora, resuspenda las partículas en agua destilada a la concentración deseada para cada inyección. Utilice una micropipeta para transferir 10 microlitros de la solución de partículas a un tubo de microcentrífuga.

Aspire los 10 microlitros completos hacia una aguja de insulina de calibre 31 unida a una jeringa de un mililitro. Tense la piel alrededor del ganglio linfático teñido con la aguja en un ángulo de 90 grados respecto a la piel. Penetre la piel hasta una profundidad de un milímetro.

Inyecte lentamente todo el volumen, monitoreando la presencia de aumento visible del ganglio linfático. Permita que el ratón se recupere bajo una lámpara de calor y luego devuélvalo al alojamiento o realice pruebas adicionales. En primer lugar, confirme la síntesis de partículas y la distribución de tamaño.

El protocolo de síntesis por evaporación del disolvente en emulsión puede evaluarse cualitativamente mediante inspección visual de las emulsiones finales generadas. Las emulsiones deben ser una suspensión homogénea libre de agregados visibles. La distribución del tamaño de partículas puede confirmarse mediante difracción láser o dispersión dinámica de luz; las muestras de partículas deben presentar una distribución monomodal.

Se puede lograr una evaluación cualitativa adicional de la síntesis de partículas mediante la modificación del protocolo para incorporar una o más cargas fluorescentes, como un péptido fluorescente o un colorante lipofílico. El colorante puede utilizarse para localizar y dirigirse al ganglio linfático para la inyección de partículas. Durante el entrenamiento, los ratones pueden ser sacrificados y sometidos a necropsia tras la inyección del colorante, con el fin de familiarizarse con la ubicación de los ganglios linfáticos. La distribución de las partículas dentro de las zonas de células T y B del ganglio linfático infectado se confirma mediante microscopía confocal de ganglios linfáticos seccionados y teñidos.

Pueden observarse diferencias en las propiedades de las partículas, como el tamaño, en los ganglios linfáticos tras la inyección y la visualización mediante microscopía de fluorescencia. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en el transcurso de dos días. La síntesis de partículas y la preparación de los animales se realizan el primer día. El lavado de partículas, su caracterización y la inyección intra ganglio linfático se llevan a cabo el segundo día.

Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo un trazador o colorante puede utilizarse para visualizar e inyectar los ganglios linfáticos inguinales de ratones. Esta técnica permite la administración no quirúrgica de portadores de vacunas basados en biomateriales directamente al ganglio linfático, con un nivel de control que antes no era posible. La administración directa de biomateriales al ganglio linfático permitirá a científicos e ingenieros en inmunología y desarrollo de vacunas explorar las interacciones fundamentales entre las vacunas basadas en biomateriales y las señales inmunitarias con el ganglio linfático, arrojando nueva luz sobre los mecanismos mediante los cuales estos materiales estimulan y modulan la inmunidad.