Inyección de ganglios intra-linfáticos de partículas de polímero biodegradables

El objetivo general de este procedimiento es depositar las partículas de la vacuna del biomaterial en los ganglios linfáticos mediante una técnica de inyección directa. En primer lugar, sintetizar las partículas de polímero estabilizadas con lípidos utilizando un método de doble emulsión. A continuación, lave las partículas y mida las propiedades del material, como el tamaño, la carga, la carga o la estabilidad.

A continuación, administre un tinte trazador en la base de la cola del ratón para permitir la visualización después del drenaje del tinte al ganglio linfático. El paso final es identificar el ganglio linfático marcado con D e inyectar un pequeño volumen de partículas de polímero en este lugar. La histología, la inmunofluorescencia y la microscopía confocal se pueden utilizar para confirmar la presencia y distribución de partículas en los ganglios linfáticos inguinales.

La combinación de la inyección directa de ganglios linfáticos con biomateriales para la vacunación permite un control estricto sobre las combinaciones y dosis de los componentes de la vacuna en el microambiente de los ganglios linfáticos, y permite la liberación controlada de la carga en estos tejidos. Todas las vacunas deben llegar a los ganglios linfáticos para ser efectivas. Por lo tanto, es importante definir cómo los biomateriales y las señales inmunitarias incorporadas afectan la señalización de los ganglios linfáticos locales para vincular estos eventos con la respuesta inmunitaria sistémica.

Este conocimiento nos ayudará a comprender mejor cómo funcionan las vacunas de biomateriales que se administran por las vías tradicionales. Aunque la administración de biomateriales dentro de los ganglios linfáticos sirve como herramienta para estudiar los efectos de los biomateriales en la organización de los ganglios linfáticos, esta plataforma también brinda una oportunidad aplicada para desarrollar nuevas vacunas terapéuticas e inmunoterapias dirigidas al cáncer y los trastornos autoinmunes. En el caso de las micropartículas, el sonicato es la fase orgánica que contiene el polímero, el lípido y otras cargas insolubles en agua en hielo a 12 vatios.

Para crear la emulsión de agua y aceite, agregue 500 microlitros de H2O o H2O destilado que contenga un miligramo de proteína peptídica u otra carga soluble en agua. Continúa fornicando durante 30 segundos. Balancee suavemente el vial de arriba hacia abajo de lado a lado alrededor de la punta del monitor para asegurar una emulsificación completa.

Ahora prepare el agua y el aceite en emulsión de agua vertiendo la emulsión de agua y aceite en 40 mililitros de H2O homogeneizado durante tres minutos a 16, 000 RPM. A continuación, agregue una barra agitadora magnética y revuelva el agua y el aceite en emulsión de agua durante la noche para eliminar el exceso de solvente después de la eliminación del solvente durante la noche. Vierta la emulsión a través de un colador de celdas de malla de nailon de 40 micras en una centrífuga de tubo cónico de 50 mililitros durante cinco minutos, decantar el sobrenadante, resuspender el pellet de partículas en un mililitro de agua y transferir las partículas suspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Recoja las partículas mediante una centrifugación de cinco minutos. Mida el tamaño de partícula por difracción láser o dispersión de luz. El volumen de agua añadido a la célula de fracción se encuentra en un nivel suficiente para la alineación y la supresión Pipetea 10 microlitros de suspensión de partículas en la célula de fracción.

Cierre la puerta del compartimiento del analizador de tamaño de partícula. A continuación, mida el tamaño de partícula para el PLGA. Utilice un índice de refracción de 1,60.

Utilice la interfaz del software para calcular el diámetro de la partícula utilizando una base numérica un día antes de la inyección. Anestesiar al ratón de acuerdo con un protocolo animal aprobado por la IAUC. Evalúe la profundidad de la anestesia con un dedo del pie.

Realice pruebas de reflejo de pellizco y controle la respiración para garantizar una frecuencia respiratoria de 100 a 120 respiraciones por minuto. Afeita el pelo de la base de la cola y el cuarto trasero. Retire el pelo del lado ventral del animal y lateralmente alrededor del lado dorsal, justo por encima de la articulación de la pata trasera.

Para cada inyección de tinte, use una micropipeta para transferir 10 microlitros de solución de tinte a un tubo de fuga microcéntrico y aspire los 10 microlitros completos a través de una aguja de calibre 31 en una jeringa de insulina de un mililitro. Ahora inyecte 10 microlitros de solución de tinte por vía subcutánea a cada lado de la base de la cola para cargarla entre inyecciones. Aplica una crema depilatoria suave para eliminar el vello restante.

Asegúrate de cubrir el área entre la pata trasera y el abdomen. Después de tres minutos, use una mano enguantada húmeda con H two oh tibia y frote suavemente la crema depilatoria en la piel. Repita inmediatamente para eliminar el exceso de depilatorio.

A continuación, humedezca un paño suave o una toalla de papel con agua tibia y, con un solo movimiento, limpie la parte inferior del mouse. Coloque el mouse debajo de una lámpara de calor para recuperarse y luego vuelva a mantenerlo presionado durante al menos 12 horas. Examinar el ratón anestesiado para confirmar el drenaje de trazas o tinte en cada ganglio linfático inguinal.

El ganglio linfático debe ser visible como una mancha oscura cerca de la parte posterior del muslo y el abdomen. Ahora resus resuspende las partículas en agua destilada a la concentración de inyección deseada para cada inyección. Utilice una micropipeta para transferir 10 microlitros de solución de partículas a un tubo de microcentrífuga.

Aspire los 10 microlitros completos en una aguja de insulina de calibre 31 conectada a una jeringa de un mililitro. Tire de la piel alrededor del ganglio linfático teñido con la aguja en un ángulo de 90 grados con respecto a la piel. Penetra en la piel hasta una profundidad de un milímetro.

Inyecte lentamente todo el control de volumen para el agrandamiento visible de los ganglios linfáticos. Permita que el mouse se recupere bajo una lámpara de calor y luego vuelva a sostenerlo o realice pruebas adicionales. Primero, confirme la síntesis de partículas y la distribución del tamaño.

El protocolo de síntesis de evaporación de solvente de emulsión se puede evaluar cualitativamente mediante la inspección visual de las emulsiones finales. Generado. Las emulsiones deben ser una suspensión homogénea libre de agregados visibles. La distribución del tamaño de partícula de la parte se puede confirmar mediante difracción láser o dispersión dinámica de luz, las muestras de partículas deben exhibir una distribución monomodal.

Se puede lograr una evaluación cualitativa adicional de la síntesis de partículas mediante la modificación del protocolo para incorporar una o más cargas fluorescentes, como un péptido fluorescente o un colorante lipofílico. El tinte se puede usar para localizar y dirigirse al ganglio linfático para la inyección de partículas. Durante el entrenamiento, los ratones pueden ser sacrificados y necropsiados después de la inyección de tinte para familiarizarse con la ubicación de los ganglios linfáticos. La distribución de partículas dentro de las zonas de células T y B del ganglio linfático infectado se confirma mediante microscopía confocal de ganglios linfáticos seccionados y teñidos.

Las diferencias en las propiedades de las partículas, como el tamaño, se pueden observar en los ganglios linfáticos después de la inyección y la obtención de imágenes mediante microscopía de fluorescencia. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en el lapso de dos días. La síntesis de partículas y la preparación de los animales ocurren el primer día. El lavado de partículas, la caracterización y la inyección intraganglionar se realizan al segundo día.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo se puede usar un rastro o tinte para visualizar e inyectar los ganglios linfáticos inguinales de ratones. Esta técnica permite la administración no quirúrgica de los portadores de vacunas de biomateriales directamente al ganglio linfático con un nivel de control que antes no era posible. La administración directa de biomateriales a los ganglios linfáticos permitirá a los científicos e ingenieros, así como a los ingenieros de inmunología y desarrollo de vacunas, explorar las interacciones fundamentales de los biomateriales, las vacunas y las señales inmunitarias con los ganglios linfáticos, arrojando nueva luz sobre los mecanismos por los que estos materiales estimulan y dan forma a la inmunidad.