Name: Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Aprenda a visualizar subdominios del retículo endoplásmico en células cultivadas mediante transfección con proteínas GFP y microscopía confocal. Este método permite estudiar la movilidad proteica y la arquitectura subcelular.

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Los autores agradecen a la Fundación Filarete por su ayuda y apoyo en la publicación de este artículo. También nos gustaría agradecer Centro Europeo di nanomedicina para el uso del microscopio electrónico de transmisión Tecnai G2.

1. El plásmido, cultivo celular, y la transfección con ER proteínas fluorescentes <ol><li> El plásmido usado en este estudio consiste en una versión mejorada de GFP fusionada en su extremo C-terminal a la región de la cola de la isoforma ER de rata citocromo b (5) (abreviado aquí como B (5)) a través de una secuencia de engarce. La región de la cola contiene toda la secuencia (Pro94-Asp134) que permanece asociado a la membrana después de la escisión de tripsina de B nativa (5), incluyendo el TMD 17-residuo (dominio transmembrana), flanqueado por secuencias polares aguas arriba y aguas abajo (UPS y DPS) . El enlazador consiste en el epítopo myc seguido de [(Gly) 4 Ser] 3, y todo el ADNc se insertó en los sitios Hind3-Xba1 del vector de expresión de mamíferos pCDNA3. Los detalles de la construcción de este plásmido se han descrito en una publicación anterior en la que se conoce como GFP-ER 16. </li><li> Crecer células COS-7 en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de queso Fetal de suero bovino, 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina en una incubadora a 37 ° C y 10% de CO 2. </li><li> La transfección. Placa 3 x 10 5 células sobre un cubreobjetos de vidrio redonda en una placa de 6 pocillos y, al día siguiente, transfectar con el sistema JetPEI como se describe por el fabricante. Tenga en cuenta que la relación JetPEI / ADN óptima ha sido probado con el fin de establecer la máxima eficiencia de la transfección dependiendo de la plásmido y la línea celular utilizada: en nuestro caso, un JetPEI: relación de ADN de 2:01 conduce a 70-80% de eficiencia de transfección. </li></ol> 2. Vivo de fluorescencia confocal de barrido Microscopía <ol><li> Imágenes de células vivas. Coloque el cubreobjetos en la que las células transfectadas se sembraron en una cámara de cultivo celular de acero para cubreobjetos 24 mm relleno con DMEM w / o rojo de fenol, suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1% penicilina / estreptomicina, 25 mM de HEPES , 50 mg / ml de cicloheximida y 1:100 OxyFluor para evitar que las muestras de photobleaching. Un microscópicas confocal SP5e equipado con una incubadora de CO2 a temperatura controlada (37 º C y 5% CO 2) se utiliza para experimentos de imagen de células vivas, con d GFP-ER se visualizó usando un láser de 488 nm y un filtro de 525/50 emisión del paso de banda. </li><li> Recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP). Dibujar una región de interés (ROI), correspondiente a una estructura Oser y lejía usando 20 iteraciones y una combinación de 488 nm (100% de un láser de 30 mW de argón, correspondiente a 5.5-6 mW en la muestra) y 405 nm (60% de una 30 mW diodo láser de 405, lo que corresponde a 11,6 mW en la muestra) láseres que, en nuestra experiencia, conduce a fotoblanqueo eficiente y rápida. </li><li> Registre la recuperación de la fluorescencia en las regiones de interés blanqueados mediante la adopción de un único fotograma cada 10 segundos durante 10 minutos (tiempo de píxel = 1,61 microsegundos / px). </li><li> Pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP). Dibuje un retorno de la inversión correspondiente a una estructura RPEO, y blanqueador como se describió anteriormente. El blanqueo se repite cada 30 segundos,y las imágenes post-blanqueamiento se registran cada 10 segundos durante 30 minutos (tiempo de píxel = 1,61 microsegundos / px). </li><li> FRAP y el análisis de la FLIP. Todas las imágenes son analizadas utilizando software ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). En los experimentos FRAP, la recuperación de la fluorescencia de la ROI blanqueada se mide con el tiempo y se normalizaron a la fluorescencia total de células blanqueada, que siempre se comprueba para ser constante en el tiempo. </li><li> Para los experimentos de FLIP, dibuje un retorno de la inversión fuera de los RPEO blanqueada y cubriendo toda la célula. Medir su intensidad de fluorescencia con el tiempo y normalizar para los niveles de fluorescencia de un retorno de la inversión dibujadas en una célula sin blanquear con el fin de corregir para cualquier disminución de la fluorescencia causada por la propia formación de imágenes. </li><li> En todos los experimentos, se resta la señal de fondo (determinado en un área fuera de las células) de las intensidades fluorescentes de las regiones de interés. Por último, trazar los resultados utilizando Grsoftware aphPad Prism. </li></ol> 3. Análisis ultraestructural por Medio de Microscopía Electrónica de Transmisión Dada la toxicidad de muchos de los reactivos, todos los procedimientos deben llevarse a cabo usando un laboratorio apropiado. abrigo y los guantes bajo una campana de humos. <ol><li> Después de retirar el cubreobjetos de la placa de Petri, fijar las células restantes cultivadas en la parte inferior del plato como una monocapa usando filtrada 2% de glutaraldehído en 0,1 M de tampón de cacodilato, pH 7,4, durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Raspar las células utilizando un raspador de teflón y transferirlos a 1,5 ml de tubos de Eppendorf. Sedimentar las células por medio de centrifugación a 9000 g durante 10 min. Eliminar el sobrenadante, añadir fijador fresco, y dejar toda la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar los pellets con el tampón, a continuación, después de fijar con una solución de 1% de tetróxido de osmio en tampón cacodilato durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague con agua Milli-Q, y en la mancha bloque con1% de acetato de uranilo en agua destilada durante entre 20-60 min. </li><li> Deshidratar las muestras en el aumento de serie de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, y 100% durante 10 min cada uno), y se lava brevemente dos veces en óxido de propileno (15 min cada uno). </li><li> Infiltrarse en las muestras en una mezcla de óxido de propileno + Epon (01:01) (de 2 horas para la noche). </li><li> Insertar en resina epoxi Epon curado a 60 ° C durante al menos 24 horas. </li><li> Sección los bloques de resina recortadas manualmente utilizando un ultramicrotomo LEICA UC6 equipado con un cuchillo de diamante 45 ° para obtener secciones con un espesor de 60-70 nm. Recoge las secciones sobre rejillas de cobre de malla 300. </li><li> Teñir las secciones de la red con una solución saturada de acetato de uranilo (20 min) y citrato de plomo (7 min), lavar bien las rejillas sumergiéndolas en agua filtrada bidestilada, y déjelos secar a temperatura ambiente. </li><li> Las rejillas teñidos se observan con un microscopio electrónico de transmisión Tecnai G2, y las imágenes se capturaron con una bottcámara CCD montada om-con diferentes ampliaciones finales (generalmente van de 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
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<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
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<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los protocolos y métodos de formación de imágenes descritos en el presente documento se han utilizado para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes TA transfectadas residentes en el ER de las células vivas. También hemos analizado el efecto de la expresión sobre-de estas proteínas en la arquitectura de este compartimiento subcelular por medio de análisis ultraestructurales. La combinación de imagen confocal de células vivas y microscopía electrónica representa...

El descubrimiento de la proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes espectrales, y el desarrollo paralelo de la microscopía de fluorescencia, se han abierto por completo nuevas avenidas para la investigación del comportamiento de proteínas en las células. Técnicas tales como la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP), que son posibles debido a la capacidad intrínseca de fluoróforos para extinguir su fluorescencia bajo iluminación intensa, se basan en imágenes de células vivas confocal y el uso de transfectaron proteínas de fusión fluorescente 1-3. Son ampliamente utilizados para evaluar no sólo la localización de las proteínas, sino también su movilidad y el transporte vesicular, que puede revelar pistas importantes en cuanto a su función 4. La característica única de las células eucariotas es la presencia de compartimentos intracelulares que tienen composiciones de lípidos y de proteínas específicas. Aunque orgánulos son físicamente isolated, que necesitan comunicarse unos con otros y compartir componentes moleculares con el fin de mantener la homeostasis celular. La vía secretora garantiza que las proteínas y lípidos sintetizados en el ER llegar al destino final correcto en el que ejercen su función. Orgánulos intracelulares también se pueden conectar por los sitios de contacto dinámicos que permiten a las moléculas (lípidos) para ser intercambiados directamente entre compartimentos. Además, muchas proteínas tienen que reunidos en grandes complejos heteroméricos o asociada a determinadas especies de lípidos (balsas lipídicas / microdominios) para llegar a ser funcionalmente activo o ser transportado a su destino final. Todos estos aspectos biológicos influyen en gran medida las propiedades cinéticas de las proteínas, y por lo tanto puede ser investigado apropiadamente por medio de las técnicas descritas a continuación. Nuestro grupo ha utilizado ampliamente FRAP y FLIP combinado con microscopia electrónica para estudiar la arquitectura de la sala de emergencia y de sus subsistemasdominios. El ER es la primera estación de la vía secretora y juega un papel clave en proteínas y lípidos de clasificación 5. Es un orgánulo muy dinámico cuya subdominios distintos reflejar sus muchas funciones diferentes (es decir, las proteínas y la biosíntesis de lípidos y la trata de personas, plegamiento de proteínas, Ca 2 + de almacenamiento y liberación, y el metabolismo de xenobióticos). Sin embargo, a pesar de que son morfológicamente, espacialmente, y funcionalmente distintos, estos dominios son continuas entre sí, y su abundancia relativa se pueden modificar en las células bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Los más conocidos y dominios generalmente espacialmente segregados de la sala de emergencias son la envoltura nuclear, y el RE liso y áspera, sin embargo, nosotros y otros han demostrado que hay estructuras ER con una arquitectura más elaborada y la organización tridimensional en varios tipos de células y tejidos en condiciones fisiológicas que también pueden ser inducidos por medio de estímulos estresantes tales como la hipoxia, la drogala administración, o la sobre-expresión de proteínas transmembrana-ER residente 2,6 (y las referencias en él). Recientemente, también hemos demostrado la presencia de tales estructuras en los modelos celulares de enfermedades humanas 1,7. Procedentes de las cisternas apiladas de RE liso, se les dio el nombre colectivo de retículo endoplásmico liso organizada (RPEO) en 2003 6, a pesar de que también se conocen como karmellae, laminillas y ER cristaloide sobre la base de su arquitectura, que, al igual que su tamaño, puede variar. Después de que las células son transfectadas con GFP fusionado a la región citosólica de cola-anclado (TA) proteínas ER-residente (d EGFP-ER), la tendencia débilmente dimerizing de GFP en trans altera dramáticamente la organización y estructura de la sala de emergencias. FRAP y FLIP experimentos mostraron que d EGFP-ER es libre de difundirse dentro de RPEO, y el hecho de que se mueve desde el ER reticular a la RPEO y viceversa &lt;/ Em&gt;, indica que los agregados son continuas con la ER reticular circundante. El análisis ultraestructural nos ha permitido correlacionar los datos de fluorescencia con una descripción detallada de la arquitectura RPEO y organización a nivel de nanoescala: RPEO siempre están compuestos de pilas de cisternas emparejado del RE liso pero pueden tener diferentes formas de organización espacial, como dispuestos regularmente sinusoidal matrices o espirales o matrices tubulares &quot;cristaloides&quot; hexagonales. Estos reordenamientos conducen a morfologías cúbicos 8 que, ya que se han encontrado en las células bajo condiciones fisiológicas 9 y siguientes tensiones tales como la hipoxia 10, el tratamiento de drogas 11, y el cáncer 9, pueden tener un potencial significativo como marcadores ultraestructurales. Después de esta primera demostración del uso de proteínas de fusión GFP, utilizamos los experimentos de imagen para analizar la proliferación de dominios ER en respuesta a los tratamientos farmacológicos 12, assess la tendencia de las proteínas fluorescentes para oligomerise en las células 13, y para investigar el papel de un mutante, ALS ligado a proteína TA en la formación de agregados intracelulares de origen ER que pueden ser relevantes para su 1,8 patogenicidad. Se ha sugerido que la formación de agregados intracelulares (que se produce en muchas enfermedades neurodegenerativas 14) puede ser un mecanismo protector diseñado para evitar las interacciones entre las proteínas mutantes tóxicos y los componentes de las células circundantes 15. Lo que sigue es una descripción de una combinación de métodos de microscopía óptica y electrónica para la investigación de las construcciones cuyo C-terminal de dominios hidrofóbicos se insertan en la membrana del ER, y un análisis de su comportamiento dinámico y los efectos de su sobre-expresión de dominio ER arquitectura en células cultivadas (véase la Figura 1 para un diagrama de flujo del protocolo experimental).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM) sin rojo de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Estreptococo</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM solución</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfección</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído Grado I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de sodio Trihidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio Solución al 4%</td><td>Microscopía Electrónica Ciencia</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo dihidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td> ligeramente radiactivo <td>Sigma-Aldrich</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>Kit de medio de inclusión EPON</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de plomo </td><td>Microscopía electrónica Science</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Microscopio</td> confocal espectral Eppendorf <td>5415 D</td><td></td></tr> Sistema de incubación en jaula de microscopio <tr><td> </td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de incubación en jaula de CO2 </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante </td><td>Diatome</td><td>Ultra 45 &deg;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de células de cultivo de acero para cubreobjetos de 24 mm</td><td>Bioscience Tools</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas de microscopía electrónica Ciencia de</td><td>la microscopía electrónica</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Los lípidos y proteínas en células eucariotas se intercambian continuamente entre los compartimentos celulares, a pesar de que estos conservan su composición y funciones distintivo a pesar de la intensa tráfico interorganelle molecular. Las técnicas descritas en este documento son poderosos medios de estudiar las proteínas y la movilidad de los lípidos y el tráfico in vivo y en su entorno fisiológico. La recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) se utilizan ampliamente técnicas de formación de imágenes en vivo de células para el estudio de tráfico intracelular a través de la vía endocítica-exo, la continuidad entre orgánulos o subcompartimentos, la formación de complejos de proteínas, y la proteína de localización en microdominios lipídicos, todos los cuales se pueden observar en condiciones fisiológicas y patológicas. Las limitaciones de estos enfoques se deben principalmente a la utilización de las proteínas de fusión fluorescentes, y sus posibles desventajas incluyen artefactos sobreexpresande iones en las células y la posibilidad de diferencias en el plegamiento y la localización de las proteínas etiquetadas y nativas. Por último, como el límite de resolución de la microscopía óptica (aproximadamente 200 nm) no permitir la investigación de la estructura fina de la sala de emergencias o los subcompartimentos específicos que puede originarse en las células bajo estrés (es decir, la hipoxia, la administración del fármaco, la expresión sobre-de transmembrana proteínas residentes ER) o bajo condiciones patológicas, combinamos imágenes de células vivas de las células transfectadas cultivadas con ultraestructural análisis basado en la microscopía electrónica de transmisión.

La Figura 2 muestra un estudio FRAP ejemplo de la movilidad de la proteína. La movilidad de la proteína EGFP D-ER se demuestra por la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching rápida en RPEO blanqueados. Para el análisis cuantitativo, la media hora y la fracción celular se obtuvieron a partir de los datos medidos experimentalmente mediante el ajuste de la siguiente ecuación monoexponencial: F (t) = F + mensaje (post F rec-F)</sub...

Se describen los métodos de formación de imágenes que utilizamos para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes transfectadas residentes en el retículo endoplásmico (RE) por medio de la imagen confocal de células vivas. También analizamos ultraestructuralmente el efecto de su expresión en la arquitectura de este compartimento subcelular.

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

El objetivo general del siguiente experimento es investigar cómo se distribuyen y desplazan las proteínas fluorescentes transfectadas en el retículo endoplásmico y evaluar el efecto de su expresión sobre la arquitectura ultraestructural. Para ello, se transfectan transitoriamente células en cultivo con proteínas ancladas mediante su extremo C-terminal, residentes en el retículo endoplásmico, marcadas con GFP. Tras la transfección, se realiza imágenes confocales en células vivas para evaluar la recuperación de la fluorescencia tras fotoblanqueo o FRAP y la pérdida de fluorescencia.En fotoblanqueamiento o flip, el análisis ultraestructural se realiza mediante microscopía electrónica de transmisión. Los datos obtenidos demuestran que la expresión del constructo B cinco marcado con GFP altera drásticamente la organización y estructura del retículo endoplasmático, induciendo la formación de agregados. El método que demostramos aquí puede proporcionar información sobre procesos básicos de biología celular, como la movilidad y el tráfico de proteínas y lípidos.También puede utilizarse para estudiar las respuestas a tratamientos farmacológicos con el fin de evaluar la proteína fluorescente, la modernización de oligonucleótidos, o para investigar el papel de proteínas mutantes patógenas en la formación de agregados intracelulares de origen que podrían ser relevantes para su patogenicidad, como en la esclerosis lateral amiotrófica. El plásmido utilizado en este estudio consiste en una versión mejorada de GFP fusionada en su extremo C a la región cola de la er, isoforma de citocromo B cinco de rata, mediante una secuencia conectora. La región cola de B cinco contiene toda la secuencia que permanece asociada a la membrana tras la escisión por tripsina.Esto incluye el dominio transmembrana de 17 residuos, flanqueado por secuencias polares upstream y downstream. El enlazador consiste en el epítope M seguido de GLY cuatro S3. Toda la CDNA se inserta en los sitios Hindi tres XO uno del vector de expresión mamífero PC DNA tres. En preparación para la transfección, crezca las células cost siete en DMEM suplementado a 37 grados Celsius y 5 %CO2 el día antes de la transfección; plaque tres veces 10 a la quinta células sobre cubreobjetos redondos de 24 milímetros en una placa de seis pocillos al día siguiente.Transfecte las células con el sistema jet PEI según lo descrito por el fabricante aquí, utilizando una relación de jet PEI a ADN de dos a uno. Esto generalmente conduce a una eficiencia de transfección del 70 al 80%. Mantenga las células a 37 grados Celsius y 5% CO2 durante 24 horas antes de la adquisición de imágenes. A continuación, use pinzas para transferir un cubreobjetos con células transfectadas a la cámara de imagen.Devuelva la placa de cultivo de tejidos al incubador para conservar las células restantes. Para análisis ultraestructural mediante microscopía electrónica. Para la visualización de células vivas, añada dos mililitros de medio de imagen a una cámara de cultivo celular de acero.Xi Fluor se incluye en el medio de imagen para evitar que las muestras sufran fotoblanqueo. Los experimentos deben realizarse en presencia de smide, un inhibidor de la traducción, para evitar cualquier aumento en la señal de fluorescencia A y, consecuentemente, en la fluorescencia total debido a la biosíntesis de proteínas. Coloque la cámara de imagen sobre la platina de un microscopio confocal, equipado con un incubador de CO2 con control de temperatura y láseres apropiados con ajustes adecuados del fotomultiplicador para realizar la recuperación de fluorescencia.Después de la fotobleaching o frack, enfoque las células, ajuste los parámetros de adquisición para evitar la saturación de los píxeles. Asegúrese también de que la potencia del láser esté ajustada al nivel más bajo posible para evitar la fotobleaching debida a la adquisición de imágenes. Una vez establecidos los parámetros de imagen, muévase a un nuevo campo de visión con dos o más células.Una célula en cada campo de adquisición debe permanecer sin blanquear, para que pueda utilizarse para normalizar la señal fluorescente de la(s) célula(s) blanqueada(s). Para el blanqueamiento, dibuje una región de interés o ROI correspondiente a un retículo endoplásmico liso organizado o OSER.Configure el programa de imagen para realizar el blanqueo utilizando un número adecuado de iteraciones para lograr un blanqueo fotónico eficiente y rápido. Si es necesario, puede utilizarse una combinación de láseres de 488 nanómetros y 405 nanómetros. Instruya al software para capturar un cuadro individual cada 10 segundos durante 10 minutos a lo largo de todo el experimento. Esto incluye los períodos previo al blanqueo, de blanqueo y de recuperación.Una vez que todo esté configurado, inicie el blanqueo y la captura. Cuando la captura esté completa, cambie a un nuevo campo de visión y repita este proceso. Capture de cuatro a cinco campos de visión para cada cubreobjetos.Deslice al siguiente para medir la pérdida de fluorescencia en el blanqueo inducido por luz o en la técnica de flip. Instruya al programa para que realice una secuencia de blanqueo y adquisición de imágenes posteriores al blanqueo durante 10 segundos cada 30 segundos durante 10 minutos, luego muévase a un nuevo campo de visión. Dibuje una ROI correspondiente a una estructura OSER e inicie el blanqueo y la captura como antes para su análisis.Importe las imágenes de frap y flip al software Image J. Primero, evalúe la recuperación de la fluorescencia de la ROI fotoblanqueada a lo largo del tiempo para los experimentos de frack, y luego determine la fluorescencia de fondo seleccionando un área fuera de las células y midiendo su intensidad media a lo largo del tiempo. A continuación, reste la señal de fondo de las intensidades fluorescentes de las ROI.Normalice los datos respecto a la fluorescencia total de la célula blanqueada, la cual debe ser constante en el tiempo. Luego, ajuste la ecuación exponencial monoexponencial mostrada aquí, donde F post es la señal fluorescente después del blanqueo fotónico, F rec es el valor máximo de recuperación de fluorescencia alcanzado tras el blanqueo, T es el tiempo final de registro y tau es el tiempo medio de registro.Para el análisis de los experimentos de flip, dibuje una ROI fuera del OSER fotoblanqueado, que cubra toda la célula, y mida su intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo. En cuanto a los experimentos de frack, reste el fondo utilizando un área fuera de las células. Normalice los datos respecto a los niveles de fluorescencia de una ROI trazada en una célula no fotoblanqueada para corregir cualquier disminución en la fluorescencia causada por la adquisición de imágenes.Finalmente, grafique los resultados utilizando GraphPad Prism o un software similar. Muchos de los reactivos utilizados en la preparación de las muestras para microscopía electrónica son tóxicos. Por lo tanto, los siguientes pasos deben realizarse usando una bata de laboratorio y guantes, trabajando bajo una campana extractora.Después de retirar la cubierta del platillo de Petri para microscopía óptica, fije las células restantes cultivadas en el fondo del platillo como una monocapa durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilizando un raspador de teflón, desprenda las células y transfiéralas a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros; haga un pellet de las células mediante centrifugación a 9.000 ×g durante 10 minutos tras la centrifugación. Retire el sobrenadante, agregue fijador fresco y deje en refrigeración durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente.Lave los pellet suavemente aspirando el fijador con una pipeta Pasteur y agregando tampón Cate. Para evitar perturbar el pellet, deje que el tampón escurra por la pared lateral del tubo al ser agregado. Aspire la solución de lavado y realice la fijación posterior añadiendo las células en una solución de 1% de tetróxido de osmio en tampón Cate durante una hora a temperatura ambiente.A continuación, enjuague con agua Milli Q y agregue 1% de acetato de uranilo en agua destilada directamente al tubo de microcentrífuga. Desbloquee la tinción durante 20 minutos a una hora, deshidrate las muestras en una serie creciente de etanol del 70%, 80%, 90%, 100% y nuevamente 100% durante 10 minutos cada uno. Luego, lave los sedimentos dos veces en óxido de propileno durante 15 minutos cada vez.Infiltra las muestras sustituyendo el óxido de propileno por la mezcla uno a uno de óxido de propileno y Epon, e incuba durante al menos dos horas o durante toda la noche. A continuación, para incluir las muestras, coloca los fragmentos del sedimento celular en moldes de inclusión previamente llenos con resina epoxi de Epon y cura a 60 grados Celsius durante al menos 24 horas. Al día siguiente, monta el bloque de resina en un ultramicrotomo equipado con un cuchillo de diamante de 45 grados.Utilizando un cuchillo de corte, recorte manualmente los bloques de resina para eliminar las porciones del bloque en las que no está presente la muestra embebida. Luego, con el ultramicrotomo, obtenga secciones de 60 a 70 nanómetros. Recojas las secciones sobre rejillas de cobre de 300 mallas para teñir las secciones.Coloque las rejillas sobre gotas de 30 microlitros de una solución saturada de uranilo de acetato e incube durante 20 minutos. Luego enjuague tres veces con agua milli Q e incube nuevamente las rejillas sobre pequeñas gotas de citrato de plomo durante siete minutos. Después de la incubación, lave cuidadosamente las rejillas sumergiéndolas en agua milli Q y déjelas secar a temperatura ambiente.Observe las cuadrículas teñidas utilizando un microscopio electrónico de transmisión y capture imágenes mediante una cámara CCD montada en la base, con un aumento final que oscila entre 6.000 y 39.000 ×, para investigar la difusión lateral de D-E-G-F-P ER en el retículo endoplasmático liso organizado. Se analizaron siete células transfectadas transitoriamente procedentes de tres cubreobjetos mediante FRAP, como se describe en este video; tal como se muestra en esta secuencia de lapsos de tiempo, se bleaquinaron dos estructuras OSER y se registró la recuperación de fluorescencia a lo largo del tiempo. Se detectó una recuperación clara de la fluorescencia un minuto después del blanqueo, con un aumento adicional de la señal cuatro minutos más tarde, para determinar el tiempo medio de recuperación y cuantificar la fracción móvil de D-E-G-F-P-E-R.Las imágenes capturadas se analizaron según se describe en este video, como se puede ver aquí. La intensidad fluorescente del área blanqueada aumentó con el tiempo, lo que demuestra que la proteína fluorescente es altamente móvil dentro de los agregados. Para estudiar la continuidad entre diferentes subdominios del retículo endoplasmático, se realizaron experimentos de inversión como se muestra en esta secuencia de lapsos de tiempo.El blanqueamiento continuo de un OSER indicado aquí por la flecha amarilla provoca una disminución progresiva de la fluorescencia en el resto del RE y en otras estructuras OSER dentro de la misma célula. La flecha roja indica una porción de una célula no blanqueada en la cual la señal fluorescente es constante en el tiempo. El análisis cuantitativo de estos datos reveló un vaciado progresivo y rápido del RE reticular, lo que demuestra que los agregados están físicamente conectados con el resto del RE. Para examinar la arquitectura fina de estos agregados, se observaron células que expresaban altos niveles de D-E-G-F-P RE mediante microscopía electrónica de transmisión.Esta micrografía muestra una vista de baja magnificación del citoplasma celular que contiene un agregado de membranas. El agregado consiste en una pila de cisternas y membranas sinusoidales onduladas. Como puede observarse aquí.Las mitocondrias pueden observarse agrupadas alrededor de las estructuras OSER, mientras que los ribosomas, indicados por las flechas, se encuentran únicamente en las membranas de la cisterna más externa. Obsérvese que el espacio denso al electrón de 11 nanómetros de grosor entre las membranas es continuo con el citoplasma. Un OSER puede formarse a partir de ER laminar, que son pilas de cisternas de ER aplanadas que pueden aparecer continuas o fragmentadas en cortes delgados; ocasionalmente pueden observarse vesículas que brotan de la cisterna más externa de la pila, como se muestra aquí.En conjunto, estos datos demuestran que los agregados fluorescentes observados en células en cultivo transfectadas con D-E-G-F-P ER representan parches de retículo endoplásmico liso y aplanado que se organizan espacialmente en geometrías tridimensionales bien definidas. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar adquirir todas las imágenes sin píxeles saturados, ya que estos podrían alterar la recuperación fluorescente y, consecuentemente, el análisis de movilidad proteica. Asegúrese siempre de normalizar la señal fluorescente en la zona de blanqueo (bleach), la región de interés, con respecto a la fluorescencia total de la misma célula, con el fin de tener en cuenta las variaciones de intensidad fluorescente debidas al blanqueo durante la adquisición de imágenes o pequeños cambios en el plano de enfoque.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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