Name: Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprende a transfectar neuroblastos de roedores mediante nucleofección para estudiar su migración en un ensayo tridimensional. Este método permite analizar el efecto de proteínas específicas en la neurogénesis postnatal.

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Este trabajo fue financiado por una subvención del Proyecto Fideicomiso Wellcome concedido a la EP y GL (089236/Z/09/Z). SG fue apoyado por una beca de doctorado de Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Agradecemos a Matthieu Vermeren para el tipo de regalo del vector shRNA y Jennifer Shieh de valiosos consejos sobre nucleofection neuroblastos.

Este procedimiento es conforme a los reglamentos del RU Home Office (Ley de Procedimientos Científicos Animal, 1986). Los científicos deben seguir las directrices establecidas y aprobadas por sus órganos reguladores animales institucionales y nacionales. 1. Disección y disociación de rata RMS neuroblastos <ol><li> Preparar las soluciones necesarias para la disección RMS y disociación: </li></ol> Medio de disección (100 ml) Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) - 98,5 ml 5 M de HEPES, pH 7,4 a 0,5 ml La penicilina-estreptomicina (10.000 unidades / ml y 10.000 g / ml) - 1 ml Medio de disociación (2 ml) HBSS - 1.760 ml 10x Tripsina (2,5%) - 200 l Dnase1 (1 mg / ml) - 40 l Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) + 10% de suero de ternera fetal (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS - 4 ml El medio completo (12 ml) Medianas Neurobasal - 11,46 ml B27 Suplemento - 250 l L-Glutamina (200 mm) - 125 l Glucosa (45%) - 165 l 2. Filter-esterilizar el% de FCS DMEM + 10 y el medio completo y preequilibrate en un 37 ° C / 5% de CO 2 incubadora. <ol><li> Disección <ol><li> Sacrificar una camada de ratas P6-P7 (unos 12 cachorros) por dislocación cervical y decapitar con unas tijeras. </li><li> Hacer una incisión anteroposterior en la piel a lo largo de la sutura sagital medial desde la nariz hasta el cerebelo con una hoja de bisturí. Pelar la piel y repita la misma incisión a lo largo del cráneo. </li><li> Retire suavemente las aletas craneales con fórceps y retirar con cuidado el cerebro con una espátula, teniendo cuidado de incluir los bulbos olfatorios. </li><li> Cortar el tercero más caudal del cerebro y lo descarta. </li><li> Picar ªe tejido cerebral en 1,4 mm de espesor rebanadas coronales utilizando un cortador de tejidos. </li><li> Coloque las rebanadas en platos que contenían medio disección fría y separe con cuidado usando una aguja. </li><li> El RMS aparece como un triangular, zona translúcida en el centro de las secciones de obstetricia y como una pequeña área circular en rodajas de cerebro más caudales. Cortar las RMS de cada rebanada con un cuchillo microquirúrgico, teniendo cuidado de evitar la inclusión de tejido circundante. En crías de ratas P7, por lo general los ~ 8 rebanadas más rostral (incluyendo OB) contienen el RMS. </li><li> Recoger los fragmentos de RMS con una pipeta Pasteur de plástico y colocarlos en un plato pequeño que contiene medio de disección en frío en hielo. </li><li> Cuando la disección es completa, la transferencia de los fragmentos de RMS en un tubo de 15 ml con una pipeta de plástico. Deja fragmentos para ubicarse en la parte inferior del tubo. </li></ol></li><li> Disociación <ol><li> Sustituya el medio de disección con 2 ml de medio de disociación. </li><li> Se tritura los fragmentos de RMS por suavemente pipetting la suspensión de fragmentos de arriba abajo sobre 10 veces con una pipeta P1000. </li><li> Deje el tubo con los fragmentos de tejido en un 37 ° C baño de agua durante 2 min. </li><li> Pipetear la solución de nuevo 10 veces y asegurarse de que los fragmentos han disociado (la suspensión debe enturbiarse). </li><li> Inactivar la tripsina mediante la adición de 5 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 433 xg durante 5 min. </li><li> En la alícuota Mientras tanto, la cantidad requerida de ARNsi / ADN en tubos de Eppendorf (generalmente 3-5 g de ADN / shRNA o 5-9 ARNsi g oligo por nucleofection, sin embargo, la cantidad de ADN / ARNsi puede requerir optimización). </li><li> Retire el exceso de medios y resuspender el botón celular por pipeteo suave en 5 ml de DMEM precalentado + 10% FCS. </li><li> Realizar un recuento de células. Esperar ~ 1 × 10 6 células por rata cachorro cerebro. Se requiere un mínimo de 2,5 x 10 6 células por cada nucleofection, mientrasresultados óptimos se logran utilizando 3-4 x 10 6 células por nucleofection. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 433 xg durante 5 min. Asegúrese de eliminar la mayor cantidad media de lo posible. </li></ol></li></ol> 2. Nucleofection <ol><li> Inmediatamente resuspender el sedimento de células en ratas (o el ratón si el uso de células de ratón) solución nucleofection neurona previamente se incubó a temperatura ambiente. Utilice 100 l por nucleofection Nota:. Típicamente una camada de ratas de 12 crías es suficiente para llevar a cabo 4 nucleofections y una camada de ratón (12 cachorros) es suficiente para llevar a cabo 2 nucleofections. </li><li> Transferir 100 l de la suspensión celular a cada tubo Eppendorf que contenía ARNsi / ADN y mezclar suavemente 2-3x por pipeteado con una pipeta P200. </li><li> Añadir la muestra (suspensión cell-DNA/siRNA) a la parte inferior de la nucleofectioncuvette, teniendo cuidado de evitar burbujas. </li><li> Nucleofect mediante el programa G-013 (para las células de rata) o O-005 (paracélulas de ratón). Uno nucleofection tarda aproximadamente 5 seg. </li><li> Añadir rápidamente 1 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS a la muestra nucleofected. </li><li> Repita los pasos 2,4 y 2,5 para el resto de las muestras. Nota: para obtener resultados óptimos, todo el procedimiento nucleofection no debe durar más de 5 minutos. </li><li> Transfiera cada muestra a un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS utilizando la pipeta de plástico proporcionado por el kit nucleofection. Evitar la transferencia de cualquier residuo celular para el tubo. </li><li> Centrifugar las muestras a 433 xg durante 5 min. </li><li> Quite cuidadosamente todo exceso de medio y resuspender el precipitado en 25 a 30 l de precalentado DMEM + FCS al 10% utilizando una pipeta P20. No utilice más de 30 l de medio. </li><li> Pipetear la suspensión como una gota en el lado interior de una tapa de la placa de p35. </li><li> Invertir la tapa sobre el plato de p35 que contiene 2 ml de medio completo (véase también la Figura 1). </li><li> Deja en la incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante almenos de 5 horas y un máximo de 7 horas. Un mayor tiempo de incubación permite una mejor reagregación de grupos de células. </li><li> Transfiera las gotas que cuelgan de la tapa en el medio completo en el plato con una pipeta P1000 con una punta de corte. </li><li> Se incuba a 37 ° C / 5% de CO2 durante 24 h para nucleofections de ADN y 48 h para nucleofections siRNA / shRNA. </li></ol> 3. Incorporación <ol><li> Preparar medio completo (25 ml) y preequilibrate que a 37 ° C / 5% de CO 2 durante unas pocas horas. </li><li> Saque las alícuotas congeladas de la matriz de la membrana basal de -80 ° C congelador y descongelar en hielo en la cámara frigorífica. </li><li> Para cada nucleofection preparar un plato de 6 cm que contiene hasta ocho 13 mm coverlips estériles. </li><li> Colocar las cápsulas en una caja de hielo cubierta con papel film. Es importante mantener los cubreobjetos fresco para evitar la solidificación de la matriz durante el procedimiento de incrustación. </li><li> Para mantener la humedad, coloque una tira de tejido húmedo dentro de un plato de 15 cm que wenfermo puede utilizar para almacenar hasta tres placas de 6 cm que contienen los neuroblastos embebidos. </li><li> Añadir medio completo a la matriz descongelada en una relación de 01:03. Por ejemplo, mezclar 40 l de medio completo con 120 l de la matriz con la pipeta. Esta cantidad de matriz es suficiente para incrustar agregados en ocho cubreobjetos de 12 mm. </li><li> La transferencia de los grupos de células reaggregated a un tubo de 15 ml y centrifugar a 433 xg durante 5 min. </li><li> Retire el exceso de medios y resuspender el precipitado en 10 l de medio completo. </li><li> Coloque 2 l de suspensión de agregados de células en cada cubreobjetos estéril y añadir 18 l de matriz / mezcla de medio completo. Use la punta de la pipeta para ampliar la matriz a través de todo el cubreobjetos. </li><li> Colocar inmediatamente el recipiente de 6 cm que contiene los cubreobjetos en el plato de 15 cm y dejar en la incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante 15-20 min. Cuando la matriz se ha solidificado, añadir con cuidado 5 ml de medio completo a cada 6 cm plato toma el cuidado de empujarpor cualquier cubreobjetos flotante con una punta de pipeta. </li><li> Incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% CO 2 para permitir que los neuroblastos migran fuera de los agregados celulares. </li></ol> 4. Ensayo de Migración 3D <ol><li> Preparar las soluciones necesarias para la inmunotinción. <ol><li> Prepare la solución de bloqueo: Solución de bloqueo de cabra (50 ml) Tampón fosfato salino (PBS) - 5 ml Suero de cabra - 7,5 ml 10% de Triton X-100 - 1,5 ml BSA - 50 mg H 2 O - 36 ml </li><li> Se filtra y se almacena a 4 º C. </li><li> Preparar la solución de fijación: La fijación de solución (100 ml) El paraformaldehído (PFA) - PRECAUCIÓN 4 g: siempre manejar PFA bajo una campana La sacarosa - 20 g (opcional) PBS hasta 100 ml </li><li> En un plato caliente y con agitación constante disolver la PFA en 80 ml de PBS mantuvo a 65 ° C. </li><li> Una vez que la PFA se haya disuelto, añadir 20 g de sacarosa. </li><li> Ajustar el pH a7.4 (por lo general mediante la adición de ~ 60 l 1 M NaOH por 100 ml de solución). </li><li> Llevar a un volumen total de 100 ml con PBS. </li></ol></li><li> La inmunotinción <ol><li> Coloque cubreobjetos en una placa de 24 pocillos. </li><li> Enjuague cubreobjetos con PBS 2x. </li><li> Fijar los agregados neuroblast RMS con solución fijadora durante 45 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague cubreobjetos con PBS 3 veces (5 min / lavado - en una plataforma oscilante). </li><li> Bloquee durante 30-60 min con solución de bloqueo de cabra. </li><li> Diluir anticuerpos primarios en solución de bloqueo de cabra e incubar durante la noche a 4 ° C. (Si se desea, faloidina fluorescente (1:400) y el colorante Hoechst (1:10.000) pueden también ser añadidos a la solución de anticuerpo primario para visualizar la actina filamentosa y núcleos). </li><li> Enjuague cubreobjetos con PBS 3 veces (5 min / lavado). </li><li> Diluir los anticuerpos secundarios de cabra en solución de bloqueo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague coverslips con PBS 3 veces (5 min / lavado) </li><li> Monte cubreobjetos con medio de montaje fluorescente y dejar secar al aire durante la noche a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Análisis de migración <ol><li> Captura de imágenes de agregados neuroblast RMS fijos con un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de 10X. Incluye una barra de escala de la imagen de una muestra en. </li><li> Para configurar la escala para la cuantificación, mida la barra de escala en la imagen mediante la selección de la herramienta &#39;Recta&#39; en la barra de herramientas ImageJ. </li><li> Elija la opción &quot;Analizar&quot; y haga clic en &#39;establecer la escala&#39;. </li><li> En la ventana de escala establecida la &quot;distancia conocida&quot; y marque la casilla &quot;global&quot; para mantener la misma configuración para todas las mediciones. </li><li> Utilice la herramienta de línea segmentada &quot;en la barra de herramientas ImageJ para medir la distancia desde el borde de la suma a la más lejana neuroblast migrado en 6 sectores diferentes alrededor de todo el conjunto (Figura 3B). Considere sólo aislados agagregados para su análisis. </li><li> Calcular una distancia media de migración desde los 6 valores obtenidos para cada agregado. </li><li> Mida 10-20 agregados para cada condición en cada experimento y piscina resultados independientes de un mínimo de tres experimentos independientes. Incluya siempre un control nucleofection (GFP o un sh / control siRNA por ejemplo.). </li></ol></li></ol>

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<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La migración de los neuroblastos a lo largo de los RMS a la ubicación final en el OB es un paso fundamental en la neurogénesis postnatal. Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan este proceso complejo están lejos de ser plenamente comprendido. El procedimiento experimental descrito aquí permite el estudio de la migración de los neuroblastos in vitro. Hemos adaptado un protocolo previamente publicado para el aislamiento de los neuroblastos RMS de ratón o de rata postnatal temprano 25. Para lograr resultados óptimos es importante para dominar el paso de la disección, ya que es crucial para mantener el intervalo de tiempo entre la disección y nucleofection a un mínimo. Después de nucleofection, neuroblastos pueden reaggregated, incrustados en una matriz de tres dimensiones y se dejaron migrar durante un período de 24 horas. Alternativamente, para fines distintos de la migración (por ejemplo, inmunofluorescencia o análisis de transferencia Western), las células se pueden sembrar inmediatamente después de nucleofection en polyornithine/laminin-cubreobjetos recubiertos, donde sobreviven hasta 4-5 días. Ratón y rata neuroblastos migran en Matrigel en un grado similar, sin embargo las células de ratón parecen tener una tendencia más fuerte a migrar en las cadenas de que las células de rata. Dependiendo del objetivo del estudio, los neuroblastos pueden nucleofected con diferentes plásmidos que codifican proteínas fluorescentes o proteínas de tipo / mutante silvestres de interés. Para los plásmidos de expresión de proteínas óptimos con un promotor CAG (promotor de β-actina con potenciador de CMV y β-globina cola poli-A) 26 son altamente recomendados. Por otra parte, oligos siRNA o plásmidos shRNA pueden nucleofected para derribar blancos de interés. Agotamiento de proteína eficaz puede ser visualizado por inmunofluorescencia o por Western blot (generalmente lisar agregados incrustados de 1 de rata crías con 50 l de tampón de lisis estándar). Nucleofection es un método relativamente sencillo para transfectar neuroblastos primarios, ofrece una alternativa más fácil y más rápido a vitransfección mediada por vector RAL, y puede lograr alta (~ 70-80%) la eficacia de transfección. Es fundamental trabajar con rapidez durante el procedimiento nucleofection, desde que salió de neuroblastos en la solución nucleofection por un tiempo prolongado reduce drásticamente la viabilidad celular. El rendimiento promedio de la celda de la disección RMS es relativamente baja para los ratones P7 (~ 5 x 10 5 células / cerebro) en comparación con las ratas P7 (~ 1 x 10 6 células / cerebro) y se requieren al menos 3 x 10 6 células por nucleofection para lograr la transfección con ~ 50% de eficiencia. Por otra parte, los neuroblastos de ratas parecen resistir mejor a nucleofection comparación con los neuroblastos de ratón. Por lo tanto, las crías postnatal temprano (P6-P7) de ratas podrían representar una fuente neuroblast conveniente, considerando también que la organización de rata y ratón RMS son notablemente simiLAR 27 y que el alcance de la rata y el ratón neuroblastos la migración in vitro también es comparable. Se recomienda no guardar los racimos reaggregated de neuroblastos nucleofected en suspensión durante más de 48 horas para evitar los efectos anormales en la morfología celular y la migración (nuestras observaciones no publicadas). El ensayo 3D se describe aquí se puede utilizar para cuantificar la migración de neuroblastos en un punto de tiempo fijo después de la incrustación en la matriz (por ejemplo. 24 h). Los agregados de diferentes tamaños se pueden utilizar en el análisis, ya que no existe una correlación significativa entre el tamaño de los agregados y la distancia de migración (nuestras observaciones no publicadas). Para visualizar e investigar más a fondo la dinámica de la migración de los neuroblastos, time-lapse se puede utilizar. Se recomienda realizar el análisis de la migración dentro de un intervalo de 24 horas después de la incrustación, ya que la velocidad de neuroblastos parece disminuir drásticamente en los puntos de tiempo más largos (nuestras observaciones no publicadas). &lt;/ P&gt; Existen algunas limitaciones a este protocolo. En primer lugar, nucleofection hasta ahora se puede utilizar para principios de neuroblastos de roedores postnatales, mientras que la infección con vectores virales sigue siendo el método de transfección más eficaz para los neuroblastos adultos 28. En segundo lugar, el ensayo in vitro de la migración en no reproduce completamente la compleja arquitectura de los RMS observados in vivo. De hecho, aunque los neuroblastos mantienen la capacidad de migrar de una manera similar a sus contrapartes en vivo, en la configuración experimental descrito aquí que carecen de interacciones con otros componentes de RMS tales como astrocitos y los vasos sanguíneos, que también contribuyen a regular su motilidad 9,29, 30. Este problema puede ser abordado en el futuro mediante la optimización de los sistemas modelo de co-cultivo en tres dimensiones. En conclusión, la combinación de nucleofection con un ensayo de migración 3D representa una herramienta valiosa para comprender mejor los mecanismos moleculares que subyacenla migración de los neuroblastos. Este procedimiento proporciona un método experimental inicial, rápido y relativamente sencillo para evaluar el papel de los reguladores de candidatos de la migración de los neuroblastos, que se pueden validar aún más por otros enfoques, como la electroporación in vivo postnatal y time-lapse de cultivos de cortes cerebrales 28,31,32 .

En el cerebro de mamífero posnatal, la generación de nuevas neuronas (neurogénesis) se produce durante toda la vida y se limita a dos nichos neurogénicos: la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la zona subgranular de la circunvolución dentada del hipocampo 1. Varios estudios recientes han demostrado el importante papel de la neurogénesis adulta en la facilitación de las tareas de aprendizaje y memoria 2,3. Además, la evidencia de la proliferación y el reclutamiento de células progenitoras neurales después de una lesión cerebral 4-7 plantea la posibilidad de la activación farmacológica de la neurogénesis en la reparación neural. Neurogénesis postnatal es regulado estrictamente en todas sus fases, que incluyen la proliferación neuronal progenitor, migración, diferenciación, supervivencia, y la integración sináptica definitiva de neuronas recién nacidas 8. Progenitores neurales (neuroblastos) derivadas de células madre en la ZVS migran a grandes distancias a través de la migratoria rostralcorriente (RMS) hacia el bulbo olfatorio (OB), donde maduran hasta convertirse en neuronas funcionales 9. Neuroblastos migratorios son predominantemente unipolar, con un cuerpo celular alargado que se extiende un único proceso de liderazgo. Estas células se mueven en las cadenas de una manera colectiva, deslizando una sobre la otra 10. La migración es un paso crucial para la posterior maduración de los progenitores derivados de SVZ en neuronas funcionales 11 y es controlado por múltiples factores y moléculas de orientación incluyendo: molécula de adhesión celular neural polisialiladas (PSA-NCAM) 12, Efrinas 13, integrinas 14, aberturas 15, factores de crecimiento y neurotransmisores 16 17, sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso no se entiende completamente. La investigación de las vías de señalización intracelular que regulan la migración de neuroblastos no sólo proporcionará una mejor comprensión de la neurogénesis adulta, sino que también contribuirá al desarrollo de la nueva terapéuticaenfoques para promover la reparación del cerebro. Este manuscrito describe un protocolo detallado para estudiar el papel de los reguladores de candidatos de la migración de los neuroblastos in vitro utilizando nucleofection y un ensayo de migración 3D. Nucleofection es una técnica de transfección de células basado en un método mejorado de electroporación. Corriente eléctrica específica de tipo celular y solución nucleofection permiten la transferencia de macromoléculas polianiónicos tales como ADN y shRNA vectores y siRNA oligonucleótidos directamente en el núcleo de la célula y permiso de transfección de dividir lentamente o mitóticamente inactivas las células como neuronas embrionarias de mamíferos y 18. Este método es rápido, relativamente fácil de realizar y los resultados en la transfección altamente reproducible de una amplia gama de tipos de células incluyendo los neuroblastos primarios y las neuronas 19-21. La disociación de tejido RMS permite el aislamiento de los neuroblastos migratorios, que puede ser nucleofected con éxito con ADN / SHRVectores NA o oligos siRNA dirigidos genes de interés. Tras nucleofection, neuroblastos se reaggregated en gotas colgantes y posteriormente embebidos en una matriz de Matrigel en tres dimensiones. Estas condiciones permiten a los neuroblastos migran fuera de los agregados celulares que recapitulan el modo de migración observado in vivo, proporcionando así un excelente sistema modelo para investigar las vías de señalización implicadas en la migración de los neuroblastos y para evaluar la influencia de los tratamientos farmacológicos en la motilidad de estas células.

<table><tbody><tr><td>Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Tripsina-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>tienda 200 &micro; l alícuotas en -20 &deg; </td></tr><tr><td>C ADNasa I Vial (D2)</td><td>Worthington</td><td>LK003170</td><td>&ge; 1.000 unidades por vial; tienda 50 &micro; l alícuotas en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Dulbecco Medio de águila modificado (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera (FCS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3007902</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Solución de D-(+)-Glucosa (45%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matriz de Membrana Basal, Factor de Crecimiento Reducido (GFR), Fenol Rojo, 10 ml, Libre de LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>356231 prepare 120 &micro; l alícuotas en 4 &deg; C, luego almacene a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441242</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>BDH</td><td>102745C</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Chemical</td><td>BPE9701-100</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje de fluorescencia Dako</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nucleofección de neurona de rata</td><td>Lonza</td><td>VPG-1003</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nucleofección de neurona de ratón</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí microquirúrgico</td><td>Angiotech</td><td>7516</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain picadora de tejidos</td><td>The Mickle Laboratory Engineering Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nucleofection de roedores neuroblastos para el estudio de la migración neuroblast<em&gt; in vitro</em

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

La zona subventricular (SVZ) situado en la pared lateral de los ventrículos laterales juega un papel fundamental en la neurogénesis adulta. En este área restringida del cerebro, células madre neurales proliferan y generan constantemente neuroblastos que migran tangencialmente en cadenas a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) para alcanzar el bulbo olfatorio (OB). Una vez en el OB, los neuroblastos cambiar a la migración radial y a continuación, se diferencian en neuronas maduras capaces de incorporar en la red neuronal preexistente. La migración de los neuroblastos adecuada es un paso fundamental en la neurogénesis, lo que garantiza la correcta maduración funcional de las neuronas recién nacidas. Dada la capacidad de los neuroblastos derivados de ZVS para apuntar a áreas lesionadas en el cerebro, la investigación de los mecanismos intracelulares que subyacen a su movilidad no sólo mejorará la comprensión de la neurogénesis, pero también puede promover el desarrollo de estrategias de neurorregenerativas. Este manuscrito describe un detalladoprotocolo para la transfección de roedor primario RMS neuroblastos postnatales y el análisis de su motilidad utilizando un ensayo in vitro de 3D ​​en la migración recapitulando su modo de migración observada in vivo. Ambos neuroblastos rata y ratón pueden ser rápida y eficiente a través de nucleofection transfectadas con el plásmido de ADN, pequeña horquilla (sh) ARN corto de interferencia o (si) oligos de ARN objetivo genes de interés. Para el análisis de la migración, las células se nucleofected reaggregated en &#39;gotas colgantes, y posteriormente embebidos en una matriz tridimensional. Nucleofection per se no menoscabe significativamente la migración de los neuroblastos. El tratamiento farmacológico de los neuroblastos nucleofected y reaggregated también se puede realizar para estudiar la función de las vías de señalización implicadas en la migración de los neuroblastos.

Los neuroblastos se pueden aislar con éxito a partir de tejido disecado RMS (Figura 1A) y embebidos en una matriz tridimensional. Las células aisladas a partir de cualquiera de rata o de ratón postnatal de RMS son inmunopositivas para marcadores neuroblast migratorias, tales como doblecortina (DCX), tubulina βIII o PSA-NCAM (Figuras 1B-C). Neuroblastos disociadas se pueden nucleofected de manera eficiente con el ADN (por ejemplo. Un plásmido de GFP-codificación, Figura 2) o plásmidos shRNA (Figura 4) para lograr el agotamiento de la proteína, que puede ser evaluado mediante análisis de transferencia Western (Figura 4B) o inmunofluorescencia (no se muestra) . Las células nucleofected con plásmidos que codifican GFP migran radialmente hacia fuera racimos neuroblast reaggregated (Figura 3A). La cuantificación de la relativa distancia migrada 24 h después de la incorporación (Figura 3B) no muestra diferencias en la migración entre GFP-posit<html> ive células y células nonnucleofected GFP-negativos (Figura 3C), lo que indica que nucleofection per se no interrumpe la migración. También hay ninguna diferencia significativa en la medida de la migración entre los neuroblastos nucleofected y neuroblastos migran directamente de explantes RMS (datos no presentados). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. La disección de los neuroblastos RMS. (A) Representación esquemática de la disección de los neuroblastos RMS. Para una descripción detallada, por favor referirse al texto. (B) Las células de rata RMS aislados son immunopositive para los fabricantes de neuroblastos migratorios DCX y tubulina βlll. Bar, 20 m. (C) Las células que migran fuera del RMS explantes ratón expresan la neuroblast migratoria marcadores DCX y PSA-NCAM. Bar, 20 micras.0989/50989fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Ratón nucleofection neuroblastos. Disociada ratón RMS neuroblastos se nucleofected con pMAX-GFP, reaggregated, incrustados en una matriz tridimensional y permite migrar durante 6 horas. Los neuroblastos migran fuera de un grupo de células reaggregated (superior, contraste de fase fotos) muestran una alta eficiencia de transfección (abajo, canal GFP fotos). Los paneles de las columnas de la derecha muestran altos cuadros de ampliación correspondientes a los recuadros resaltados en los paneles de la columna izquierda. Bares, 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:c<html> ontenido-width = src &quot;6 pulgadas&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 3. Migración de ensayo 3D. (A) neuroblastos de rata se nucleofected con pMAX-GFP (GFP) o pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, incrustado en la matriz y de izquierda a migrar durante 24 h. Las células fueron fijadas y se inmunotiñeron para GFP (verde) y βIII tubulina (rojo). Bar, 50 m. (B) Medición de distancia de migración utilizando ImageJ. El grupo de células reaggregated está dividida en 6 sectores iguales. La distancia entre el borde de la agrupación (línea de puntos) y la célula migrado más lejos se mide para cada sector. (C) Cuantificación de la distancia relativa migró por las células nucleofected, células nonnucleofected (GFP-positivas) y de control (-GFP negativo) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 4&quot; fo: content-width = &quot;6 pulgadas&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 4. Monitoreo de la migración de los neuroblastos después shRNA nucleofection. (A) neuroblastos de rata se nucleofected con un shRNA vector de control (PCA-b-EGFPm5 silenciador 3, que también expresa EGFP 23) o el mismo vector que contiene una, una proteína actina-agrupación shRNA orientación Fascin 24. Las células fueron reaggregated más de 48 horas, embebidas en la matriz y se dejaron migrar durante 24 horas. Los agregados se fijaron y se inmunotiñeron para GFP (verde) y βIII tubulina (rojo). Bar, 50 m. (B) fascin Efectiva agotamiento se puede detectar 50 horas después de shRNA nucleofection por Western blot. La actina se muestra aquí como control de carga (C) Análisis cuantitativo de distancia de migración relativa mostrando que el agotamiento fascin entorpece seriamente la migración de los neuroblastos. (Media ± SEM; ** p &lt;0.01, n = 3 experimentos independientes). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

La migración de los neuroblastos es un paso crucial en la neurogénesis postnatal. El protocolo se describe aquí se puede utilizar para investigar el papel de los reguladores candidatos de la migración de los neuroblastos mediante el empleo de ADN / ARN de horquilla pequeña (shRNA) nucleofection y un ensayo de migración de neuroblastos 3D con aislados de la corriente migratoria rostral posnatal roedor.

Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

El objetivo general de este procedimiento es transfectar neuroblastos primarios posnatales de roedores para examinar el efecto de proteínas diana sobre su migración. Esto se logra primero mediante la disección de neuroblastos de la corriente migratoria rostral de los roedores. El segundo paso consiste en disociarlos y transfectarlos mediante nucleofección con ADN o ARNih-S-H-R.A continuación, los neuroblastos se reagregan en gotas colgantes y luego se cultivan en suspensión durante un tiempo adecuado. El último paso consiste en embeber los agregados de neuroblastos en una matriz tridimensional y dejarlos migrar. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia o de imágenes de lapso de tiempo para analizar la migración de los neuroblastos.Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la neurogénesis, como el control de la migración de neuroblastos derivados de células madre en el cerebro posnatal. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente sencilla y rápida en comparación con el uso de vectores virales, que pueden ser difíciles y requieren mucho tiempo. Tras sacrificar una camada de ratas P6 a P7, realice una incisión an posterior en la piel a lo largo de la sutura sagital media desde la nariz hasta el cerebelo con una hoja de bisturí en cada rata.A continuación, retire la piel. Repita la misma incisión a lo largo del cráneo. Luego, retire suavemente las escotaduras craneales con pinzas y extraiga cuidadosamente el cerebro junto con los bulbos olfatorios utilizando una espátula.Después de eso, corte la tercera parte más caudal del cerebro y deséchela. Posteriormente, corte el tejido cerebral en rebanadas coronales de 1,4 milímetros de espesor utilizando un cortador de tejidos. Transfiera las rebanadas a una placa que contenga medio de disección frío.Luego, observe las secciones bajo el microscopio de disección. Sepárelas cuidadosamente utilizando una aguja. La corriente migratoria rostral aparece como una zona translúcida triangular en el centro de las secciones del bulbo olfativo y como una zona circular pequeña.En cortes cerebrales más tiernos, extraiga la RMS de cada corte con un cuchillo microquirúrgico teniendo cuidado de evitar incluir tejido circundante. A continuación, recoja los fragmentos de la RMS con una pipeta de Pasteur de plástico y colóquelos en un pequeño recipiente que contenga medio de disección frío sobre hielo. Luego gire suavemente el recipiente para reunir los fragmentos de la RMS en el centro del mismo.Recolecte los fragmentos con una pipeta de plástico y transfiéralos a un tubo de 15 mililitros. Deje que los fragmentos se sedimenten en el fondo del tubo. Reemplace el medio de disección con dos mililitros de medio de disociación T tri.Valore los fragmentos de RMS pipeteando suavemente la suspensión de fragmentos hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces utilizando una pipeta P1000 después. Deje el tubo con los fragmentos de tejido en un baño de agua a 37 grados Celsius durante dos minutos. Posteriormente, pipetee nuevamente la solución 10 veces y asegúrese de que los fragmentos se hayan disociado.Luego, inactivar la tripsina añadiendo cinco mililitros de DMEM precalentado más 10% de FCS y centrifugar la suspensión celular a 433 × g durante cinco minutos. Eliminar el medio en exceso y resuspender. Suspender el sedimento celular pipeteando suavemente con un mililitro de DMEM precalentado más 10% de FCS, y luego añadir otros cuatro mililitros del mismo medio.Luego, realice un recuento celular. Se requiere un mínimo de 2,5 × 10⁶ células para cada nucleoafectación, aunque se obtienen resultados óptimos utilizando entre 3 y 4 × 10⁶ células por nucleoafectación.Centrifugue la suspensión celular a 433 veces G durante cinco minutos. Después de eso, retire tanto medio como sea posible en este procedimiento. Inmediatamente resuspenda el botón celular en la solución de afección nucleo neuronal de rata previamente incubada.A temperatura ambiente, transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a cada tubo EOR que contenga SI R-N-A-D-N-A. Luego, mezcle suavemente pipeteando dos o tres veces con una pipeta P 200. A continuación, agregue la muestra al fondo del vete de nucleoafinidad, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas.Para la transfección nucleica, utilice el programa G guion 0 1 3 para células de rata u O guion 0 0 5 para células de ratón. Después, agregue rápidamente un mililitro de DMEM precalentado más 10 %FCS a la muestra transfectada. Transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de DMEM precalentado más 10 %FCS utilizando la pipeta de plástico proporcionada por el kit de transfección nucleica.Luego, centrifugue la muestra a 433 veces G durante cinco minutos. Retire cuidadosamente todo el medio en exceso y re suspenda el precipitado en 25 a 30 microlitros de DMEM precalentado más 10% FCS utilizando una pipeta P20. No utilice más de 30 microlitros de medio.A continuación, aspire la suspensión como una gota sobre la cara interna de la tapa de una placa P 35. Luego invierta la tapa sobre la placa P 35 que contiene dos mililitros de medio completo. Déjela en el incubador a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono durante al menos cinco horas.Después de cinco horas, transfiera las gotas colgantes de la tapa al medio completo en el recipiente. Utilice una pipeta P 1000 con una punta cortada. A continuación, incube las muestras a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono durante 24 horas para infecciones nucleares de ADN NU, o 48 horas para afecciones nucleares de SI A HRA.Ahora prepare 25 mililitros de medio completo y pre-equilibre a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono durante varias horas. Mientras tanto, retire las alícuotas congeladas de la matriz de membrana basal del congelador a menos 80 grados Celsius y deshiélelas sobre hielo en la sala fría. Para cada nucleofección, prepare un plato de seis centímetros que contenga hasta ocho cubreobjetos estériles de 13 milímetros.Coloque los platillos sobre una caja de hielo cubierta con película adhesiva. Para mantener la humedad, coloque una tira de papel de filtro húmedo dentro de un platillo de 15 centímetros que se utilizará para alojar hasta tres platillos de seis centímetros que contengan oblastos embebidos en la rodilla. A continuación, añada el medio completo a la matriz de haw en una proporción de uno a tres, transfiera los agregados celulares reagregados a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 433 ×g durante cinco minutos.A continuación, elimine el medio en exceso y resuspenda el pellet en 10 microlitros de medio completo. Luego, coloque dos microlitros de suspensión de agregados celulares sobre cada cubreobjetos estéril. Añada 18 microlitros de la mezcla de medio completo con matriz y use la punta de pipeta para extender la matriz sobre toda la superficie del cubreobjetos.Coloque inmediatamente el plato de seis centímetros que contiene las laminillas en el plato de 15 centímetros. Transfiera el plato al incubador a 37 grados Celsius con 5% dióxido de carbono durante 15 a 20 minutos. Después de que la matriz haya solidificado, agregue suavemente cinco mililitros de medio completo a cada plato de seis centímetros y presione hacia abajo cualquier laminilla flotante con la punta de la pipeta, luego incube durante 24 horas a 37 grados Celsius con 5% carbógeno para permitir que los neuroblastos migren fuera de los agregados celulares.En esta figura, se muestra que las células aisladas del RMS de rata son inmuno positivas para los marcadores de neuroblastos migratorios DCX y beta tres tubulina. Y esta figura muestra que los marcadores de neuroblastos migratorios DCX y PSA-NCA se expresan en las células que migran fuera del RMS de ratón. Para el ensayo de migración de neuroblastos de ratón, neuroblastos disociados del RMS de ratón fueron nucleofectados con GFP, reagregados, embebidos en una matriz tridimensional y se les permitió migrar durante seis horas.El neuroblasto que migra fuera de un cúmulo celular reagregado muestra una alta eficiencia de transfección. Aquí, los neuroblastos de rata fueron nucleofectados con dos plásmidos diferentes que codifican GFP, reagregados, embebidos en una matriz y dejados migrar durante 24 horas. Luego, las células se fijaron y se inmunotincionaron para GFP y tubulina beta tres para medir la distancia de migración.El agregado celular se divide en seis sectores iguales y se mide la distancia entre el borde del agregado y la célula migrada más alejada en cada sector. Esta figura muestra la cuantificación de la distancia relativa recorrida por las células afectadas por NUCLE GFP positivas y las células control no afectadas por NUCLE GFP negativas para monitorear la migración de neuroblastos. Después de la afectación de neuroblastos de rata con S-H-R-N-A Nucle, las células fueron afectadas con un vector control S-H-R-N-A o con el mismo vector que contiene un ARNH diana que codifica una proteína de fijación y agrupamiento de actina; luego, las células se volvieron a agregar durante 48 horas, se incrustaron en matriz y se dejaron migrar durante 24 horas.Los agregados se fijaron y se realizó tinción inmunológica para GFP y beta tres tubulina. La reducción eficaz de fasten puede detectarse 50 horas después de la transfección de núcleos con S-H-R-N-A mediante análisis por Western blot, y actina se muestra aquí como control de carga. Aquí se presenta el análisis cuantitativo de la distancia relativa de migración, que demuestra que la reducción de fasten afecta significativamente la migración de neuroblastos.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la electroporación posnatal para validar in vivo los resultados obtenidos con el ensayo de migración NU Nuclear Affection.

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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El control de la expansión de células madre somáticas es un factor importante que impide su estudio y uso en terapia. Aquí se describe un sistema para controlar temporalmente madre neural expansión células durante el desarrollo y la edad adulta, que se puede utilizar para aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro de ratón.

La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

En este protocolo, describimos cómo inyectar lentivirus la cavidad amniótica del ratón en E7.5, lo que lleva a una transducción uniforme de toda la placa neural, con efectos perjudiciales mínimos sobre la supervivencia o el desarrollo embrionario.

Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aquí, describimos un sistema de nucleofección diseñado para mejorar la eficiencia de la entrega de genes en células madre neurales expandidas (NSC) aisladas de la zona subventricular murina adulta. Los hallazgos demuestran que este método mejora significativamente la perturbación génica en las NSC, superando la efectividad de los protocolos tradicionales de transfección y mejorando la tasa de supervivencia celular.

Aislamiento, expansión y nucleofección de células madre neurales de la zona subventricular murina adulta

Aprende a transfectar neuroblastos de roedores mediante nucleofección para estudiar su migración en un ensayo tridimensional. Este método permite analizar el efecto de proteínas específicas en la neurogénesis postnatal.

Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast

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