Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast In vitro

La migración de los neuroblastos es un paso crucial en la neurogénesis postnatal. El protocolo se describe aquí se puede utilizar para investigar el papel de los reguladores candidatos de la migración de los neuroblastos mediante el empleo de ADN / ARN de horquilla pequeña (shRNA) nucleofection y un ensayo de migración de neuroblastos 3D con aislados de la corriente migratoria rostral posnatal roedor.

El objetivo general de este procedimiento es transfectar el neuroblasto postnatal de roedores primarios con el fin de examinar el efecto de las proteínas objetivo en su migración. Esto se logra diseccionando primero el neuroblasto de la corriente migratoria rostral de las estallidos de los roedores. El segundo paso es disociarlos y transfectarlos por afección del núcleo con ADN o S-H-R-N-A.

A continuación, los neuroblastos se vuelven a agregar en gotas colgantes y luego se cultivan en suspensión durante un tiempo adecuado. El paso final es incrustar los grupos de neuroblastos reagregados en una matriz tridimensional y dejarlos migrar. En última instancia, la inmunofluorescencia o la microscopía de imágenes de lapso de tiempo se utilizan para analizar la migración de neuroblastos.

Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la neurogénesis, como el control de la migración de neuroblastos derivados de células madre en el cerebro postnatal. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente fácil y rápida en comparación con el uso de vectores virales, lo que puede ser un desafío y llevar mucho tiempo. Después de sacrificar una camada de ratas P six a P seven, haga una incisión posterior en la piel a lo largo de la sutura sagital media desde la nariz hasta el cerebelo con una hoja de bisturí en cada rata.

A continuación, retira la piel y repite la misma incisión a lo largo del cráneo. A continuación, retire suavemente las colgajos craneales con pinzas y retire con cuidado el cerebro junto con los bulbos olfativos con una espátula.

Después de eso, corta el tercio más mimado del cerebro y deséchalo. Posteriormente, corte el tejido cerebral en rodajas coronales de 1,4 milímetros de grosor con un picador de tejidos. Transfiera las rodajas a un plato que contenga medio de disección frío.

A continuación, observe los cortes bajo el microscopio de disección. Sepáralos con cuidado con una aguja. La corriente migratoria rostral aparece como un área triangular translúcida en el centro de las secciones OB y como una pequeña área circular.

En cortes de cerebro más mimados, corte el RMS de cada corte con un bisturí microquirúrgico teniendo cuidado de evitar incluir el tejido circundante. A continuación, recoja los fragmentos de RMS con una pipeta de plástico y colóquelos en un plato pequeño que contenga medio de disección frío en hielo. A continuación, gire suavemente el plato para recoger los fragmentos RMS en el centro del plato.

Recoja los fragmentos con una pipeta de plástico y transfiéralos a un tubo de 15 mililitros. Deja que los fragmentos se depositen en el fondo del tubo. Sustituya el medio de disección por dos mililitros de medio de disociación T tri.

Evalúe los fragmentos RMS pipeteando suavemente la suspensión de fragmentos hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces con una pipeta P 1000 después. Deje el tubo con los fragmentos de tejido en un baño de agua a 37 grados centígrados durante dos minutos. A continuación, vuelva a pipetear la solución 10 veces y asegúrese de que los fragmentos se han disociado.

A continuación, inactive la tripsina añadiendo cinco mililitros de DMEM predesparasitado más un 10% de FCS y centrifugue la suspensión celular a 433 veces G durante cinco minutos. Retire el exceso de medio y resus. Suspenda el pellet de celda pipeteándolo suavemente en un mililitro de DMEM precalentado más 10% FCS, y luego agregue otros cuatro mililitros del mismo medio.

A continuación, realice un recuento de células. Se requiere un mínimo de 2,5 veces 10 a la sexta célula para cada afección del nucleo, mientras se logran resultados óptimos. Usando de tres a cuatro veces 10 a las seis células por afección del núcleo.

Centrifugar la suspensión celular a 433 veces G durante cinco minutos. Después de eso, elimine la mayor cantidad de medio posible en este procedimiento. Inmediatamente Resus, suspender el pellet celular en la solución de afección del núcleo de la neurona de rata previamente incubada.

A temperatura ambiente, transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a cada tubo EOR que contenga SI R-N-A-D-N-A. A continuación, mézclalo suavemente pipeteando dos o tres veces con una pipeta P 200. A continuación, añadimos la muestra en la parte inferior del núcleo de afección teniendo cuidado de no generar burbujas.

Para la afección del núcleo, use el programa G dash 0 1 3 para células de rata o O dash 0 0 5 para células de ratón. Después de eso, agregue rápidamente un mililitro de DMEM de antes de la guerra más un 10% de FCS a la muestra afectada por el núcleo. Transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de DMEM de antes de la guerra más un 10% de FCS utilizando la pipeta de plástico proporcionada por el kit de afección de núcleos.

A continuación, centrifugar la muestra a 433 veces G durante cinco minutos. Retire con cuidado todo el exceso de medio y vuelva a suspender el pellet en 25 a 30 microlitros de DMEM de antes de la guerra más un 10% de FCS utilizando una pipeta P 20. No utilice más de 30 microlitros de medio.

A continuación, pipetee la suspensión en forma de gota en el lado interior de la tapa de un plato P 35. A continuación, invierta la tapa sobre el plato P 35 que contiene dos mililitros de medio completo. Déjelo en la incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante al menos cinco horas.

Después de cinco horas, transfiera las gotas colgantes de la tapa al medio completo en el plato. Con una pipeta P 1000 con punta de corte. A continuación, incubar las muestras a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante 24 horas para las infecciones nucleares de ADN NU, o 48 horas para las afecciones del núcleo SI A HRA.

Ahora prepare 25 mililitros de medio completo y preequilibre a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante unas horas. Mientras tanto, saque las alícuotas congeladas de la matriz de membrana basal del congelador a menos 80 grados centígrados y descongélelas en hielo en la cámara frigorífica. Para cada afección del núcleo, prepare un plato de seis centímetros que contenga hasta ocho cubreobjetos estériles de 13 milímetros.

Coloque los platos en una nevera cubierta con film transparente. Para mantener la humedad, coloque una tira de pañuelo húmedo dentro de un plato de 15 centímetros que se utilizará para sostener hasta tres platos de seis centímetros que contienen oblast incrustados en la rodilla. A continuación, agregue el medio completo a la matriz de haw en una proporción de uno a tres, transfiera los grupos de células reagregados a un tubo de 15 mililitros y centrifugue 433 veces G durante cinco minutos.

Después de eso, retire el exceso de medio y vuelva a suspender el palet en 10 microlitros de medio completo. A continuación, coloque dos microlitros de suspensión de agregado celular en cada cubreobjetos estériles. Agregue 18 microlitros de mezcla de medio completo de matriz y use la punta de la pipeta para extender la matriz por toda la cubierta.

Deslice inmediatamente después de colocar el plato de seis centímetros que contiene los deslizamientos de tapa en el plato de 15 centímetros. Transfiera el plato a la incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 15 a 20 minutos. Una vez que la matriz se haya solidificado, agregue suavemente cinco mililitros de medio completo a cada plato de seis centímetros y empuje hacia abajo los cubreobjetos flotantes con la punta de la pipeta y luego incube durante 24 horas a 37 grados Celsius con 5% de carbógeno para permitir que el neuroblasto migre fuera de los agregados celulares.

En esta figura, se muestra que las células RMS de rata aisladas son inmunopositivas para los marcadores de neuroblastos migratorios DCX y beta tres tubulina. Y esta figura muestra que los marcadores de neuroblastos migratorios DCX y PSA NCA se expresan en las células que migran fuera del ratón. RMS Explan para el ratón Neuroblast Nu afección nuclear, el ratón disociado RMS Neuroblast fue un núcleo afectado con GFP reagregado incrustado en una matriz tridimensional y se le permitió migrar durante seis horas.

Los neuroblastos que migran fuera de un grupo de células reagregadas muestran una alta eficiencia de transfección. Aquí, el neuroblasto de rata se vio afectado por el núcleo con dos plásmidos diferentes que codifican GFP reagregados incrustados en la matriz y se dejaron migrar durante 24 horas. A continuación, se fijaron las células y se les realizó una inmunotinción de GFP y beta tres tubulina para medir la distancia de migración.

El grupo de células agregadas se divide en seis sectores iguales y se mide la distancia entre el borde del grupo y la célula migrada más lejana para cada sector. Esta figura muestra la cuantificación de la distancia relativa migrada por las células afectadas por GFP positivo NUCLE y el control de las células GFP negativas no afectadas por el núcleo para monitorear la migración de neuroblastos. Después de la afección del núcleo S-H-R-N-A, el neuroblasto de rata se vio afectado por un núcleo afectado con un vector S-H-R-N-A de control o el mismo vector que contenía un objetivo de ARNH, se fijó y agrupó actina, las células de proteínas se volvieron a agregar durante 48 horas, se incrustaron en la matriz y se dejaron migrar durante 24 horas.

A continuación, se fijaron los agregados y se realizó una tinción inmunológica para GFP y beta tres tubulina. La depleción efectiva de la sujeción se puede detectar 50 horas después de la afección de los núcleos S-H-R-N-A mediante análisis de sangre occidental y Acton se muestra aquí como un control de carga. Aquí está el análisis cuantitativo de la distancia de migración relativa que muestra que el agotamiento fijado perjudica significativamente la migración de neuroblastos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la electroporación postnatal para validar in vivo los resultados obtenidos con el ensayo de migración NU Nuclear Affection.