Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast

El objetivo general de este procedimiento es transfectar neuroblastos primarios posnatales de roedores para examinar el efecto de proteínas diana sobre su migración. Esto se logra primero mediante la disección de neuroblastos de la corriente migratoria rostral de los roedores. El segundo paso consiste en disociarlos y transfectarlos mediante nucleofección con ADN o ARNih-S-H-R.

A continuación, los neuroblastos se reagregan en gotas colgantes y luego se cultivan en suspensión durante un tiempo adecuado. El último paso consiste en embeber los agregados de neuroblastos en una matriz tridimensional y dejarlos migrar. Finalmente, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia o de imágenes de lapso de tiempo para analizar la migración de los neuroblastos.

Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la neurogénesis, como el control de la migración de neuroblastos derivados de células madre en el cerebro posnatal. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente sencilla y rápida en comparación con el uso de vectores virales, que pueden ser difíciles y requieren mucho tiempo. Tras sacrificar una camada de ratas P6 a P7, realice una incisión an posterior en la piel a lo largo de la sutura sagital media desde la nariz hasta el cerebelo con una hoja de bisturí en cada rata.

A continuación, retire la piel. Repita la misma incisión a lo largo del cráneo. Luego, retire suavemente las escotaduras craneales con pinzas y extraiga cuidadosamente el cerebro junto con los bulbos olfatorios utilizando una espátula.

Después de eso, corte la tercera parte más caudal del cerebro y deséchela. Posteriormente, corte el tejido cerebral en rebanadas coronales de 1,4 milímetros de espesor utilizando un cortador de tejidos. Transfiera las rebanadas a una placa que contenga medio de disección frío.

Luego, observe las secciones bajo el microscopio de disección. Sepárelas cuidadosamente utilizando una aguja. La corriente migratoria rostral aparece como una zona translúcida triangular en el centro de las secciones del bulbo olfativo y como una zona circular pequeña.

En cortes cerebrales más tiernos, extraiga la RMS de cada corte con un cuchillo microquirúrgico teniendo cuidado de evitar incluir tejido circundante. A continuación, recoja los fragmentos de la RMS con una pipeta de Pasteur de plástico y colóquelos en un pequeño recipiente que contenga medio de disección frío sobre hielo. Luego gire suavemente el recipiente para reunir los fragmentos de la RMS en el centro del mismo.

Recolecte los fragmentos con una pipeta de plástico y transfiéralos a un tubo de 15 mililitros. Deje que los fragmentos se sedimenten en el fondo del tubo. Reemplace el medio de disección con dos mililitros de medio de disociación T tri.

Valore los fragmentos de RMS pipeteando suavemente la suspensión de fragmentos hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces utilizando una pipeta P1000 después. Deje el tubo con los fragmentos de tejido en un baño de agua a 37 grados Celsius durante dos minutos. Posteriormente, pipetee nuevamente la solución 10 veces y asegúrese de que los fragmentos se hayan disociado.

Luego, inactivar la tripsina añadiendo cinco mililitros de DMEM precalentado más 10% de FCS y centrifugar la suspensión celular a 433 × g durante cinco minutos. Eliminar el medio en exceso y resuspender. Suspender el sedimento celular pipeteando suavemente con un mililitro de DMEM precalentado más 10% de FCS, y luego añadir otros cuatro mililitros del mismo medio.

Luego, realice un recuento celular. Se requiere un mínimo de 2,5 × 10⁶ células para cada nucleoafectación, aunque se obtienen resultados óptimos utilizando entre 3 y 4 × 10⁶ células por nucleoafectación.

Centrifugue la suspensión celular a 433 veces G durante cinco minutos. Después de eso, retire tanto medio como sea posible en este procedimiento. Inmediatamente resuspenda el botón celular en la solución de afección nucleo neuronal de rata previamente incubada.

A temperatura ambiente, transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a cada tubo EOR que contenga SI R-N-A-D-N-A. Luego, mezcle suavemente pipeteando dos o tres veces con una pipeta P 200. A continuación, agregue la muestra al fondo del vete de nucleoafinidad, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas.

Para la transfección nucleica, utilice el programa G guion 0 1 3 para células de rata u O guion 0 0 5 para células de ratón. Después, agregue rápidamente un mililitro de DMEM precalentado más 10 %FCS a la muestra transfectada. Transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de DMEM precalentado más 10 %FCS utilizando la pipeta de plástico proporcionada por el kit de transfección nucleica.

Luego, centrifugue la muestra a 433 veces G durante cinco minutos. Retire cuidadosamente todo el medio en exceso y re suspenda el precipitado en 25 a 30 microlitros de DMEM precalentado más 10% FCS utilizando una pipeta P20. No utilice más de 30 microlitros de medio.

A continuación, aspire la suspensión como una gota sobre la cara interna de la tapa de una placa P 35. Luego invierta la tapa sobre la placa P 35 que contiene dos mililitros de medio completo. Déjela en el incubador a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono durante al menos cinco horas.

Después de cinco horas, transfiera las gotas colgantes de la tapa al medio completo en el recipiente. Utilice una pipeta P 1000 con una punta cortada. A continuación, incube las muestras a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono durante 24 horas para infecciones nucleares de ADN NU, o 48 horas para afecciones nucleares de SI A HRA.

Ahora prepare 25 mililitros de medio completo y pre-equilibre a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono durante varias horas. Mientras tanto, retire las alícuotas congeladas de la matriz de membrana basal del congelador a menos 80 grados Celsius y deshiélelas sobre hielo en la sala fría. Para cada nucleofección, prepare un plato de seis centímetros que contenga hasta ocho cubreobjetos estériles de 13 milímetros.

Coloque los platillos sobre una caja de hielo cubierta con película adhesiva. Para mantener la humedad, coloque una tira de papel de filtro húmedo dentro de un platillo de 15 centímetros que se utilizará para alojar hasta tres platillos de seis centímetros que contengan oblastos embebidos en la rodilla. A continuación, añada el medio completo a la matriz de haw en una proporción de uno a tres, transfiera los agregados celulares reagregados a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 433 ×g durante cinco minutos.

A continuación, elimine el medio en exceso y resuspenda el pellet en 10 microlitros de medio completo. Luego, coloque dos microlitros de suspensión de agregados celulares sobre cada cubreobjetos estéril. Añada 18 microlitros de la mezcla de medio completo con matriz y use la punta de pipeta para extender la matriz sobre toda la superficie del cubreobjetos.

Coloque inmediatamente el plato de seis centímetros que contiene las laminillas en el plato de 15 centímetros. Transfiera el plato al incubador a 37 grados Celsius con 5% dióxido de carbono durante 15 a 20 minutos. Después de que la matriz haya solidificado, agregue suavemente cinco mililitros de medio completo a cada plato de seis centímetros y presione hacia abajo cualquier laminilla flotante con la punta de la pipeta, luego incube durante 24 horas a 37 grados Celsius con 5% carbógeno para permitir que los neuroblastos migren fuera de los agregados celulares.

En esta figura, se muestra que las células aisladas del RMS de rata son inmuno positivas para los marcadores de neuroblastos migratorios DCX y beta tres tubulina. Y esta figura muestra que los marcadores de neuroblastos migratorios DCX y PSA-NCA se expresan en las células que migran fuera del RMS de ratón. Para el ensayo de migración de neuroblastos de ratón, neuroblastos disociados del RMS de ratón fueron nucleofectados con GFP, reagregados, embebidos en una matriz tridimensional y se les permitió migrar durante seis horas.

El neuroblasto que migra fuera de un cúmulo celular reagregado muestra una alta eficiencia de transfección. Aquí, los neuroblastos de rata fueron nucleofectados con dos plásmidos diferentes que codifican GFP, reagregados, embebidos en una matriz y dejados migrar durante 24 horas. Luego, las células se fijaron y se inmunotincionaron para GFP y tubulina beta tres para medir la distancia de migración.

El agregado celular se divide en seis sectores iguales y se mide la distancia entre el borde del agregado y la célula migrada más alejada en cada sector. Esta figura muestra la cuantificación de la distancia relativa recorrida por las células afectadas por NUCLE GFP positivas y las células control no afectadas por NUCLE GFP negativas para monitorear la migración de neuroblastos. Después de la afectación de neuroblastos de rata con S-H-R-N-A Nucle, las células fueron afectadas con un vector control S-H-R-N-A o con el mismo vector que contiene un ARNH diana que codifica una proteína de fijación y agrupamiento de actina; luego, las células se volvieron a agregar durante 48 horas, se incrustaron en matriz y se dejaron migrar durante 24 horas.

Los agregados se fijaron y se realizó tinción inmunológica para GFP y beta tres tubulina. La reducción eficaz de fasten puede detectarse 50 horas después de la transfección de núcleos con S-H-R-N-A mediante análisis por Western blot, y actina se muestra aquí como control de carga. Aquí se presenta el análisis cuantitativo de la distancia relativa de migración, que demuestra que la reducción de fasten afecta significativamente la migración de neuroblastos.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la electroporación posnatal para validar in vivo los resultados obtenidos con el ensayo de migración NU Nuclear Affection.