Identificación de un murino eritroblasto subpoblación Enriquecido en enucleación Eventos Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo

El objetivo general de este procedimiento es facilitar la identificación de eventos de enucleación con una subpoblación de Erythroblast aurn. El primer paso es crear una población enriquecida en eventos nucleantes. Esto se logra mediante cultivo in vitro de eritropoyesis, ya sea a largo plazo a partir de células de médula ósea de baja densidad aisladas de los fémures, la tibia y los huesos pélvicos de un ratón no estresado o cultivo a corto plazo.

A partir de plecitos del bazo de un ratón sometido previamente a una flebotomía con el fin de montar la eritropoyesis de estrés. Las células cultivadas en el paso final del cultivo se fijan, se impregnan y se tiñen con los marcadores fluorescentes de interés. Estas células se ejecutan en un citómetro de flujo de imágenes y luego se analizan para identificar las células que experimentan enucleación en la población de células nucleantes, se pueden identificar los componentes de señalización y citoesqueléticos que regulan y median el proceso de enucleación.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía fluorescente, es que se puede observar y analizar un número significativamente mayor de células nucleantes en un corto período de tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la eritropoyesis, como qué mecanismos moleculares están involucrados en la nucleación de eritroblastos. Para diferenciar las células eritroides de las células de médula ósea de baja densidad, comience agregando un mililitro de medio de cultivo a un tubo de citometría de flujo estéril.

A continuación, conecte una aguja de calibre 25 por cinco octavos de pulgada a una jeringa de tuberculina y enjuague suavemente los medios de cultivo frescos a través de los fémures y la tibia extraídos unas cuantas veces en el tubo de citometría de flujo. Después de ajustar el volumen de suspensión celular a cinco mililitros con IMDM, coloque cuidadosamente cinco mililitros en un medio de separación celular en gradiente de densidad de 1,083 gramos por mililitro en un tubo de 15 mililitros. Transfiera todo hasta la marca de dos mililitros a un nuevo tubo de 15 mililitros y lave la capa de leucocemia recolectada con medios de cultivo frescos, pique los glóbulos rojos en tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos durante cinco minutos a temperatura ambiente después de lavar las células en medios de cultivo y vuelva a suspender el pellet en la misma placa, las células en una placa de cultivo celular de seis pocillos a una concentración de cinco veces la décima parte de la quinta célula por pocillo hasta un volumen final de 2,5 mililitros en un medio de crecimiento e incubar las células a 37 grados centígrados cinco días después de la siembra del cultivo.

Cuente el número de eritroblastos en cada pocillo de la placa de cultivo original y luego transfiera cada pocillo a los tubos cónicos individuales de 15 mililitros correspondientes. Después de centrifugar las células, aspire los sobrenadantes y vuelva a suspender los gránulos en un medio de crecimiento fresco que contenga solo eritropoyetina a una concentración de dos veces 10 de las quintas células por mililitro. A continuación, aspire el sobrenadante de una placa de células MS cinco y añada las células eritroides a los pocillos.

Dos días después, reemplace el sobrenadante con un medio de crecimiento fresco sin citocinas para los eritroblastos de los citos PLE de baja densidad. Use el émbolo de una jeringa de cinco mililitros para macerar el bazo a través de un colador de 40 micras en un tubo de 50 mililitros. Lave el colador de células con medios de crecimiento y ajuste el volumen final de la suspensión celular a cinco mililitros.

Luego, después de separar las capas celulares por gradiente de densidad como se acaba de demostrar, piojos los glóbulos rojos y lavar los citos en siete mililitros de medios de cultivo. A continuación, Resus suspende el pellet en un medio de crecimiento suplementado con citoquinas e incuba las células de una a cinco veces 10 a las seis células en un volumen final de un mililitro por pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente.

Transfiera las células a los pocillos que contengan cinco células MS adheridas como se describió anteriormente y analice después de seis a ocho horas, recoja los eritroblastos de los pocillos de cultivo y fíjelos en 500 microlitros de formaldehído al 3,7% en PBS Resus, suspendiendo el pellet con un pipeteo suave. Después de 15 minutos, gire las células a 2000 GS durante 20 segundos en una microcentrífuga, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS. Después de girar las células en la microcentrífuga, nuevamente, aspire el sobrenadante nuevamente y coloque las células en hielo durante al menos 15 minutos.

Ponga a menos 20 grados centígrados, las soluciones de acetona almacenadas en hielo. A continuación, vuelva a suspender rápidamente y centrifugar las células en una serie de lavados con acetona como se indica después del lavado con tampón de fax, incube los gránulos de células en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos adecuado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, después de lavar las celdas en el tampón de fax nuevamente, vuelva a suspender los gránulos sostenidos en 60 microlitros de tampón de fax que contengan drac cinco y ejecute las muestras en un citómetro de flujo de imágenes que recoja al menos 10,000 eventos por muestra experimental.

A continuación, comience el análisis seleccionando las celdas en función de su relación de aspecto de campo claro, la relación entre la longitud de su eje menor y su eje mayor y su área de campo claro, que es indicativa de su tamaño. Los eventos con un valor de área de campo claro inferior a 20 y superior a 200 son en su mayoría escombros y agregados de células, respectivamente, y se excluyen del análisis. A continuación, analice las celdas individuales en función de su valor para el parámetro RMS de gradiente, que indica la nitidez de la imagen, cree una segunda puerta que contenga las celdas con el valor RMS de gradiente mayor que el percentil 50 para seleccionar las imágenes tomadas bien enfocadas.

En la siguiente puerta, las células en función de su tamaño medido por su área de campo claro y su positividad para el marcador eritroide TER one 19 medido por el parámetro de píxel medio de la tinción fluorescente TER one 19 células muy bajas o muy altas para TER one 19 son no eritroides o agregados celulares restantes, respectivamente, y se excluyen del análisis en el siguiente paso. Las células se seleccionan en función de la intensidad de su relación de aspecto DR cinco, la relación entre el eje menor y el eje mayor de su núcleo y la intensidad de su expresión d dr cinco. DR cinco células negativas, en su mayoría células enucleadas como reticulocitos y glóbulos rojos, y células con una relación de aspecto de cinco arrastres baja.

La mayoría de los dobletes se excluyen de la marcha de análisis. Arrastran cinco células positivas para ADN positivo, que en este punto son en su mayoría eritroblastos. A continuación, estos eritroblastos se analizan en función de su área TER one 19, que indica el tamaño de la célula, y su área media de píxeles TER one 19 o la densidad de expresión de TER one 19, que indica el brillo de su tinción TER one 19.

Los eritroblastos ortocromáticos se reconocen como pequeños TER de 19 células altas. Por último, una subpoblación de los eritroblastos ortocromáticos se caracteriza por su baja relación de aspecto de campo claro y su alto delta sentu XY TUR one 19. DR cinco, definida por la distancia entre el centro del reticulocito incipiente TUR uno 19 positivo y el centro del núcleo DR cinco positivo junto con el anticuerpo contra ella uno 19 y la tinción de ADN DRAAK cinco.

Por lo general, las células también se tiñen para identificar la localización de la fctina durante el eritroblasto y la nucleación. Cabe destacar que la progresión de la enucleación se puede visualizar como células con una relación de aspecto decreciente. Es decir, se observan células que se vuelven cada vez más alargadas y con un delta OID xy TUR creciente, se observan 19 y cinco arrastras.

La F actina se concentra en el surco de escisión durante la nucleación y luego se disipa una vez que se extruye el núcleo. Otras proteínas y estructuras de interés también se pueden teñir con los anticuerpos apropiados o marcadores fluorescentes para permitir la obtención de imágenes de sus funciones durante la enucleación. Por ejemplo, la formación de microtúbulos polarizados se puede visualizar en eritroblastos ortocromáticos de tipo salvaje antes de una nucleación, pero no en eritroblastos tratados con colchicina.

La inhibición de la polimerización de la tubulina por colchicina disminuye la polarización celular, como se demuestra midiendo el parámetro delta OID XYB FDR cinco entre el centro del cuerpo celular visto en el canal de campo claro y el centro de la tinción nuclear lograda con DR cinco. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de fluorescencia, para responder a preguntas sobre las interacciones entre los diferentes tipos de células implicadas en la eritropoyesis, como las observadas en las islas de eritroblastos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar los eventos de enucleación en una población enriquecida con eritroblastos.