Aislamiento de glándulas multicelulares viables a partir de tejido de la planta carnívora Nepenthes

El objetivo del método presentado es obtener glándulas individuales y puras a partir de tejido vegetal fresco para análisis molecular. Esto se logra primero recolectando una trampa jarro de la planta de Nepenthes. Luego, el tejido se fija directamente sobre una plataforma de muestreo microscópica sobre hielo para mantenerlo fresco.

Durante el procedimiento de microtoma, las glándulas se aíslan de manera precisa y se transfieren al tubo de PCR antes de realizar el análisis de PCR cuantitativa en el material recolectado. En última instancia, se utiliza la tecnología mecánica de microtoma para obtener glándulas individuales y puras de plantas napes con el fin de proporcionar rápidamente tejido específico de forma mínimamente invasiva para análisis moleculares posteriores. Las plantas carnívoras son especialistas dentro de la flora porque son capaces de digerir proteínas animales.

Nuestro conocimiento sobre cómo funciona esto a nivel molecular aún es limitado. Un buen modelo para abordar esta pregunta es la mezcla de imágenes del apéndice genial, porque tiene órganos distintos, imágenes que producen glándulas, que contribuyen a estos procesos de digestión. En el apéndice.

Estas glándulas se encuentran ubicadas dentro de las imágenes en la parte inferior. Para el análisis molecular, es necesario aislar estas estructuras anchas y planas, que tienen un diámetro de aproximadamente 100 a 200 micrómetros, directamente a partir de tejido fresco. Para hacerlo más difícil, las glándulas están cubiertas por una capucha protectora.

Al tener una estructura similar a un cobertizo, se requieren observaciones tridimensionales durante el muestreo, así como una herramienta que pueda moverse de forma delicada en tres dimensiones. Aprendimos que las técnicas actuales de microdisección no fueron diseñadas para resolver nuestros problemas. Por ejemplo, un láser falló debido al alto contenido de agua en el tejido vegetal.

Por lo tanto, decidimos utilizar una nueva técnica mecánica de microdisección llamada aika, específicamente para aislar partes de tejidos o incluso células individuales de estructuras tridimensionales. Consiste en un microscopio estéreo o sum en el que se integra un micromanipulador 3D de tal manera que puede alcanzar fácilmente objetos muy planos o muy altos. Simplemente se mueve junto con el microscopio como un pilar para muestrear en plantas, donde a menudo utilizamos micropipetas.

Sin embargo, en el caso del vidrio de apéndice, descubrimos que la pinza microscópica accionada por PTO funciona de manera más eficaz para nuestro procedimiento. Con el apéndice, la plataforma ha sido modificada. Un pequeño escenario VXY sostiene un recipiente para hielo lo suficientemente grande como para contener tanto la muestra de tejido con su soporte como el lugar donde se depositará la glándula.

El hielo asegura que los procesos de gradación dentro del tejido se ralenticen lo suficiente como para poder reconocer el estado molecular original del tejido. El siguiente procedimiento se ha establecido a partir de la porción inferior de una imagen. Se extrae un fragmento de aproximadamente uno a dos centímetros cuadrados y luego se aplanan.

El tejido se fija luego sobre un portaobjetos mediante cinta adhesiva de doble cara. Esta muestra de tejido se cubre con agua libre de RNAsas y se mantiene húmeda durante el proceso de muestreo. A continuación, la muestra se coloca con las glándulas y las cúpulas protectoras orientadas hacia el lado del manipulador.

El ángulo entre la muestra y la herramienta debe ajustarse para que las glándulas queden planas. Mediante una platina universal, la inclinación puede ajustarse en dos ejes y puede corregirse fácilmente bajo el microscopio. La platina metálica mantiene la muestra fría bajo el microscopio.

Las glándulas están bien diferenciadas. La fluorescencia facilita el reconocimiento del contorno tanto de la glándula como de la capucha protectora. La muestra se observa a través de un filtro FSE para el aislamiento de las glándulas.

Para la extracción de ARN, se utiliza un filtro UV. Es esencial una posición muy precisa de la pinza micro para el aislamiento de la glándula. Se recomienda manipular la herramienta en modo de baja velocidad.

Con la pinza microquirúrgica, se accede a una glándula y se colocan las puntas en sus bordes mediante el joystick; luego, se cierran delicadamente las puntas de la pinza. A continuación, se levanta la glándula del tejido circundante. Tras una aislamiento preciso, puede observarse la cavidad intacta que muestra el tejido vascular subyacente.

La glándula aislada se transfiere entonces al tubo de PCR y se deposita en el tampón preparado. Para validar este método, se determinó la expresión génica de la proteína corta de la glándula atómica, TAP, que se secreta en la gota de fluido; el gen puede amplificarse directamente a partir de las glándulas sin una extracción previa de ADN genómico. Simplemente añadiendo la mezcla de reacción de PCR al tejido aislado.

La serie de experimentos incluyó glándulas de imágenes de nepenthes sometidas a diferentes tratamientos, así como muestras de su tejido epidérmico circundante. En cada experimento, se extrajo ARN total. El ARNm obtenido se tradujo en el ADNc correspondiente mediante transcripción inversa y se utilizó para la reacción de PCR subsiguiente.

Para amplificar la secuencia del gen de interés, se utilizó PCR en tiempo real para comparar el nivel de expresión de TLP en las glándulas secretoras y en el epidermis de Nepenthes. Los resultados muestran que el nivel de transcripción de TLP es mayor en las glándulas secretoras en comparación con el tejido epidérmico tanto en Nepenthes allotta como en Nepenthes miis, como se observa mediante una relación de tejido epidérmico sobre tejido glandular menor a uno, para comprobar si el contacto con la presa podría inducir la expresión génica. Se compararon los niveles de transcripción de TLP e imágenes sin tratar con imágenes de muestras alimentadas con Drosophila melanogaster tras el atrapamiento de la presa.

El tejido epidérmico mostró aquí una expresión más alta de TLP. Se comparó el nivel de transcripción de TLP en glándulas y tejido epidérmico, junto con una imagen tratada de Nepenthes miis. La sobrexpresión de la expresión de TLP en ambos tipos de tejido indica que la producción de proteínas del fluido de la jarra puede ser inducida efectivamente por la presa.

Los resultados de PCR sugieren que la alimentación altera eficazmente la expresión de TLP en ambos tipos de tejido y puede modificar la relación de expresión entre la glándula y el epidermis. Desarrollamos un método eficiente para cosechar cleanse a partir de tejido de apéndice FA y aislamos una cantidad suficiente de mRNA para realizar experimentos de expresión génica. Con este nuevo método que desarrollamos, no solo es posible abordar la transcriptómica en las glándulas del apéndice, sino que además también podemos abordar la metabolómica así como la proteómica.I.